Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Deteksjon og analyse av DNA Skade i Mouse Skeletal Muscle Published: December 16, 2014 doi: 10.3791/52211
Automatic Translation
1, 1
1Division of Neuropathology, Department of Pathology, Pathobiology Graduate Program, Johns Hopkins School of Medicine

Introduction

Terminal deoksynukleotidyltransferase (TdT) dUTP nick end merking (TUNEL) er prosessen med å bruke den TdT enzymet å feste dUTP til 3 'endene av dobbel og enkelttrådet DNA bryter 12,23. Den TUNEL metode for påvisning av apoptose og DNA-skader ble først rapportert over 20 år siden av Gavrieli et al. 1,12,24. Det har siden blitt evaluert og optimalisert i ulike vevspreparater 7,23,27,40. TUNEL har blitt brukt til å studere ischemi-indusert celledød av neuroner 6,14,29 og kardiomyocytter 43,44, eksitotoksisk nevronal celledød 30,31, og som en biomarkør i leddgikt behandling 39. Det har også blitt brukt som en prognostisk faktor og svulst celle markør i ulike humane kreftformer 2,3,15,32,37,38,42.

Alternative metoder finnes for DNA-skade og celledød deteksjon, men de har tekniske utfordringer og begrensninger. Southern blotting kan anvendes for å quantify DNA-skader i hele vev lysatene 7,9-11, men denne metoden ikke gir cellenivå oppløsning og er vanskelig å kvantifisere. Kometen analysen er et alternativ celle-basert metode som krever utpakking bevarte kjerner fra celler 4,20,28,36. Selv om kometmetoden fungerer godt på dyrkede isolerte celler, er det mye vanskeligere å forberede intakte kjerner fra skjelettmuskulatur vev 8,21. Som med Southern blot, gjør kometmetoden ikke gi celle-type-spesifikk informasjon fra en hel muskel vevhomogenat. Et annet alternativ til TUNEL-metoden er immunhistokjemi ved hjelp av antistoffer mot enkelt-trådet DNA 25,33,41 eller mot proteiner som deltar i DNA-skade respons og celledødsveier (for eksempel p53, H2AX, og kaspaser) 13,17,22,40. Slike antistoffbaserte metoder krever grundig karakterisering av antistoffer og utmerket antistoffspesifisitet og ga et høyt signal-til-bakgrunnsforhold. Selv når specIFIC antistoffer eksisterer, de kan kreve denaturering av målproteinet gjennom antigen gjenfinning prosedyrer 34,35. Som vi diskuterer her, antigen gjenfinning i muskel vev resulterer i uakseptabel høy autofluorescence. I motsetning til andre metoder, oppnår TUNEL DNA-skade deteksjon med et høyt signal og lav bakgrunn, utmerket spesifisitet som kan testes med enkle positive og negative kontroller, god vevspenetrasjon som ikke krever antigen gjenfinning, og cellulært nivå oppløsning. I tillegg tar TUNEL-metoden ca. 4 timer for å fullføre, mens alternative fremgangsmåter krever vanligvis over natten inkubasjoner.

Vi studerer skjelettmuskulatur celledød i en musemodell for spinal muskelatrofi (SMA) 10 som ble generert av Hsieh-Li og kolleger 16. Å kvantifisere apoptotiske celler i muskelen, har vi utviklet en metode for vev forberedelse, flekker, og kvantifisering som fungerer robust tvers av ulike Skeletal muskelgrupper på ulike utviklings tidspunkter i mus. Vi bruker et kommersielt tilgjengelig TUNEL-merking kit og kommersielt tilgjengelig programvare for bildeanalyse. Vi har også med hell brukt TUNEL analysen i kombinasjon med immunofluorescent flekker i ryggmargen 10.

Metodene som beskrives her er nyttige for etterforskere som ønsker å vurdere vev patologi, mekanismer for sykdom, mekanismer for aldring og utviklings (pre- og postnatal) celledød i skjelettmuskulatur. Den TUNEL teknikken er spesielt nyttig for studier av DNA-skade og reparasjon og celledød i modellsystemer, hvor bare et delsett av celler som er påvirket og cellenivå oppløsning er nødvendig.

Denne videoen beskriver disseksjon, vev behandling, seksjonering, og fluorescens-basert TUNEL merking av mus skjelettmuskulatur. Det beskrives også en fremgangsmåte for semi-automatisert TUNEL signal kvantifisering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Alle dyr prosedyrer beskrevet i denne protokollen ble utført i samsvar med anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health 26. Protokollen (MO13M391) ble godkjent av Johns Hopkins University Animal Care og bruk komité.

1. Neonatal Mouse Sacrifice, Dissection, og Fiksering

  1. Ofre en neonatal musen ved CO 2 innånding.
  2. Umiddelbart avskåret bakben over kneet. Inntil ca postnatal dag 7 leggbena er myke nok til å skjære gjennom med store laboratorie saks eller skarp kniv og til senere avsnitt om en kryostat.
  3. Plasser bakben i 10 ml iskald 4% paraformaldehyd i fosfat-bufret saltvann (PBS) i et 15 ml rør.
  4. Nedsenking fikse bakben i paraformaldehyde for 4-24 timer ved 4 ° C. Embryonale vev krever bare flere timerss fiksering.
    1. Unngå fiksering lenger enn 24 timer, da dette kan redusere TUNEL analysen effektivitet.
  5. Cryoprotect den bakben ved å dyppe den i sukroseløsning.
    1. Endre paraformaldehyd i 10% sukrose i PBS i det samme 15 ml rør, inkuberes over natten ved 4 ° C.
    2. Endring til 30% sukrose i PBS, inkuberes over natten ved 4 ° C eller inntil bakben, synker til bunnen av røret. Vev kan bli stående i 30% sukrose i en lengre periode, forutsatt at sukrose har vært sterilfiltrert.

2. Tissue Inkludering

  1. Fyll en merket embedding mold halvveis med innstøpningsmediet.
  2. Plasser bakben på toppen av forsenkningen medium, med snittet side så nær som mulig til den ene vegg av formen. Markere retningen på bakbena på utsiden av formen.
    1. Embed flere bakbena og kuttet i samme blokk. Det er imidlertid viktig å sikre at all hindlimbs i blokken er orientert parallelt med hverandre for å få seksjonene til å matche nivåer langs aksen av den lem.
  3. Dekk bakbena med innstøpningsmediet. Hvis bakbena skifte mens helle medium, re-orientere dem med butt spiss tang eller en tannpirker.
  4. Tillat innstøpningsmediet å infiltrere vev ved romtemperatur i minst 15 min.
  5. Plasser formene direkte på tørris eller i isopentan på tørris å fryse innstøpningsmediet. Sørg for å holde formene nivå til enhver tid og unngå forskyvning av den innebygde vev.
  6. Hold frosne støpeformer ved -80 ° C inntil de er klare til å kutte, i opptil flere måneder.

3. Cryosectioning Embedded Limbs

  1. Sett kryostat kammertemperatur til -20 ° C, objekttemperatur på -18 ° C; juster objekttemperatur ned etter behov.
  2. Ekvilibrere vevet blokken inne i kryostaten kammeret i minst 30 min. Riktig blokk templitteraturen er avgjørende for seksjon kvalitet.
  3. Skjær tverrgående seksjoner med en tykkelse på 10 um eller mindre. Tykkere seksjoner vil ikke være fullt penetrert av tunel reagenser. Bruk anti-roll plate, blader og bladvinkel (typisk 5 °) anbefales for kryostaten.
  4. Samle seksjoner over på gelatin- eller vectabond-belagt glass lysbilder ved romtemperatur. Plasser umiddelbart inn et lysbilde boks på tørris. Hold raset boksen i en egen beholder med tørris plassert nær kryostat innen armlengdes avstand.
    1. Skjær tverrgående seriesnitt gjennom lengdeaksen av benet, hopper 100-200 um. Samle minst 3 tilstøtende deler på hvert serienivå.

4. TUNEL analysen på bakben Seksjoner med en kommersielt tilgjengelig Kit (alle trinn ved romtemperatur hvis ingenting)

  1. Tine lysbilder med seksjoner til romtemperatur og tørr over natten eller over helgen.
  2. Rehydrere deler av immersing lysbilder i PBS for 2 x 10 min i en Coplin krukke. Tørk med en lab tørke, fjerne så mye væske rundt seksjonen som mulig.
  3. Permeabilize seksjoner
    1. Bruk enten en ikke-proteolytisk, saponin-baserte kommersiell reagens eller 0,5% Tween 20 og 0,05% Triton X100 i PBS.
    2. Plasser lysbilde i en fuktighet kammer. En enkel fuktighetskammer er en tom pipettespissen boks med tett lokk, med akkurat nok vann tilsatt til å dekke bunnen av boksen.
    3. Pipette nok reagenset inn lysbildet å dekke seksjonen (50 III er tilstrekkelig for neonatale mus lemmer). Ikke pipette direkte på seksjonen, som gjentatt agitasjon kan føre til at seksjonen for å løfte av raset.
    4. Med butte-tipped tang, plasserer en liten firkant av Parafilm på toppen av seksjonen for å spre ut dråpe reagens og dekker hele seksjonen. Hvis noen bobler under Parafilm, forsiktig løfte den av, tørr, og på nytt.
    5. Inkuber lysbilder med permeabilization reagent for en time i en overbygd fuktighet kammer. Dersom deler begynner å løfte seg fra raset, kan permeabilization tid reduseres til 30 min.
    6. Vask lysbilder i PBS i en Coplin krukke 2 x 5 min. De parafilm rektangler skal flyte opp til toppen og kan deretter fjernes og kastes.
    7. Ved hjelp av en lab tørk, tørk så mye væske rundt seksjonene som mulig.
  4. TdT-mediert DNA pause merking
    1. Følg instruksjonene i settet for å gjøre 1x TdT merking buffer, pipette nok merking buffer på lysbildet for å dekke vev seksjon (50 III er tilstrekkelig for neonatale mus lemmer). Inkuber i fuktighetskammeret i 5 min. Alternativt, fordype raset i TdT merking buffer i en Coplin krukke.
    2. Følg instruksjonene kit for å gjøre TdT merking mix. Settet inneholder kobolt, magnesium og mangan kationer; mangan kation fungerer godt på en rekke vev, inkludert skjelettmuskulatur, nervesystemet tissues, lever, hud og ben.
    3. For en positiv kontroll, legge DNase (merket "nuclease" i settet) til TdT merking mix. Alternativt kan pre-behandling av en positiv kontroll-delen med DNase i nuklease buffer i 1 time ved 37 ° C, i henhold til instruksjonssett. Hold DNase løsning og DNase-behandlet seksjoner unna andre eksperimentelle deler for å forhindre krysskontaminering.
    4. For en negativ kontroll, utelater TdT enzym fra merkingsblanding.
    5. Bruk en lab klut for å fjerne så mye TdT merking buffer fra raset som mulig. Pipetter TdT merking blanding på objektglasset (50 ul per seksjon), dekkes med en ny rektangel med parafilm og inkuberes i fuktighetskammer ved 37 ° C i 1 time.
    6. Følg instruksjonene i settet for å gjøre 1x stopp buffer. Bruk en lab tørk for å fjerne TdT merking mix fra raset, og legge til 200-300 mL stopp buffer for å dekke vev delen, og inkuber i fuktigheten kammer for 5 min. Al ternatively, fordype raset i stoppbuffer i en Coplin krukke.
    7. Vask sleiden 2 x 2 min i PBS. Bruk en lab klut for å fjerne så mye PBS fra raset som mulig.
  5. Fluorescerende merking
    1. Følg instruksjonene kit å forberede fluorescein merking løsning å merke dNTPs på DNA pauser. Pipette løsning på lysbildet (50 mikroliter per seksjon), dekk med et nytt rektangel av parafilm, og inkuber i fuktigheten kammeret i 20 min.
    2. Vask lysbilde for 2 min i PBS i en Coplin krukke. Bruk en lab klut for å fjerne så mye PBS som mulig fra raset.
    3. Fortynn Hoechst 33258 nukleær flekk til 1 ug / ml i PBS og pipette på sleiden (100-200 ul er tilstrekkelig til å dekke delen). Inkuber i fuktighetskammeret i 5 min.
    4. Vask 3 ganger i 5 minutter i PBS.
    5. Dekkglass med antifade fluorescens monterings media og forsegle kantene med neglelakk.
jove_title "> 5. Digital Image Acquisition

  1. Hente bilder ved hjelp av en konvensjonell fluorescerende mikroskop med DAPI, FITC, og Texas Red filtre (eller tilsvarende). Bruk en høyere forstørrelse objektiv (20X eller 40X) for å kontrollere at merkingen var vellykket og kjerner (intakte eller fragmenterte) ble merket. En 10X objektiv er tilstrekkelig for kvantifisering av TUNEL-positive puncta.
  2. Samle bilder av Hoechst flekker, TUNEL flekker, og autofluorescent signal som tre separate falsk fargekanaler kombinert i ett bilde. Hvis TUNEL fluorophore etiketten er grønn, image autofluorescent signal i rødt filter, og vise versa.
    1. Hold alle bildeinnstillinger som tilsvarer mellom lysbilder for etterfølgende thresholding og kvantifisering. For hvert filter, forhåndsinnstilte og rekord eksponeringstider, gain, og binning (ingen binning er best); ikke bruk innstillinger for automatisk eksponering eller gevinst.
    2. Bruke prøving og feiling for å finne eksponering og styrke funksjonen som best vil fange utvalget av intensjonenesities tvers av alle farget lysbilder. Pass på at det ikke er noen mettede piksler i de oppkjøpte bilder, da dette vil skjevhet kvantifisering.
  3. Ta bilder av hele muskelgruppe av interesse. Dette kan kreve flere bilder som skal "sydd" sammen.

6. Bildeanalyse

  1. Bruke kommersielt tilgjengelige bildeanalyseprogrammer for å analysere digitale bilder av TUNEL farging. Analyse ved hjelp av kommersiell programvare er vist her. Alternativt kan den gratis programvaren ImageJ fra NIH brukes til å analysere TUNEL farging.
  2. Flekk en seksjon ved siden av TUNEL-farget seksjon med hematoxylin og eosin (H & E) og ta en full-seksjon digitalt bilde med en konvensjonell lysfelt mikroskop. Bruk denne H & E bilde i kombinasjon med en anatomi atlas 5,18,19 å spore de anatomiske strukturene som skal kvantifiseres.
  3. Med TUNEL kanal slått av, manuelt spore konturene av området som skal kvantifiseres ved hjelpHoechst og autofluorescence kanaler for veiledning. Konvertere spores området til en maske (et sett av utvalgte pixel-koordinater for å bli analysert).
  4. Slå på TUNEL kanal. Bruke intensitet terskel funksjon i bildeanalyseprogram, stiller lavere terskel for å utelukke alle autofluorescence signal.
  5. Bruke de samme terskelinnstillinger for alle bildene i studien sett. Konvertere terskel valgene i masker.
  6. For hvert bilde, kombinere muskelområdet masken og TUNEL maske. Den nye kombinasjonen maske vil representere TUNEL signal innenfor spores muskel området bare.
  7. Masken utfører kvantifisering av kombinasjonen maske for å bestemme antall objekter og objektområdet på TUNEL-signalet innenfor det spores muskelområdet. Utfør dette ved hjelp av Partikkel Analyzer funksjon i ImageJ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Med vellykket flekker, bør TUNEL-positive signal være sterke nok til å isolere fra autofluorescence ved å sette intensitet terskler. TUNEL-positive objekter ved lav forstørrelse kan vises som lyse uregelmessige fragmenter i skjelettmuskulatur (figur 1A). Men ved høyere forstørrelse, noe TUNEL-positive objekter med den klassiske apoptotisk morfologi må overholdes, hvis celledød typen som er involvert er apoptose (figur 1B). Den positive kontrollen (DNase lagt til) skal fremvise rikelig TUNEL-positive signal, fordelt jevnt over alle vev i seksjonen (figur 1C). Den negative kontrollen (TdT enzym utelatt fra reaksjon) bør gi lav intensitet bakgrunn og autofluorescent signal bare (figur 1D). Huden gir en indre positiv kontroll i hele bendeler, da dette vevet har en høy grad av normal apoptose (figur 1A).

Rødt blodceller, bein, og endotelceller kan bidra signifikant autofluorescent signal (figur 2). Det er tilrådelig å bilde hver del i en egen kanal uten fluorescerende merking for å sikre at autofluorescence er ikke feil for positiv TUNEL signalering. Sann TUNEL-positivt signal bør ha mye høyere intensitet enn autofluorescens, slik at det kan bli isolert ved å sette bildeintensitetsgrenser (Figur 2A, midterste rad). Alternativt kan autofluorescent kanalen være digitalt subtrahert fra TUNEL-kanalen for å gi TUNEL-positivt signal (figur 2A, nederste rad).

Den TUNEL merking metode som er beskrevet her har blitt brukt til å kvantifisere skjelettmuskel celledød i en musemodell av SMA 10. TUNEL merking viser en økning i antall apoptotiske profiler i leggmusklene fra fem dager gamle SMA-mus, sammenlignet med kull kontroller (figur 3A). Økningen i apoptose erkvantifiserbare ved fremgangsmåten beskrevet ovenfor, noe som indikerer statistisk signifikante forskjeller i flere muskelgrupper (Figur 3B).

Figur 1
Figur 1: Representant TUNEL merking av mus bakben muskler. (A) TUNEL-merket tverrsnitt av mus med bakbena viser tibialis anterior muskel, tibia, og huden. TA - tibialis anterior, FDL - flexor digitorum longus, Edl - extensor digitorum longus. Grønn - TUNEL, blå - kjerner, rød - autofluorescent signal. Stiplede linjer avgrense muskel områder for kvantifisering. Skin tilstøtende bakben muskler gir en intern positiv kontroll for TUNEL merking. Skala bar = 200 mikrometer. (B) Representative høy forstørrelse bilder som identifiserer Tünel-positive strukturer (grønn) i embryonale dag 13 mus skjelettmuskulatur som apoptotiske kjerner. Skala bar = 10 um. A og B modifisert fra Fayzullina og Martin 2014 10. (C) Tverrgående seksjon av mus med bakbena TUNEL-merket etter DNase-behandling for å tjene som en positiv kontroll. De fleste kjerner har lyst TUNEL merking. Skala bar = 50 mikrometer. (D) tverrsnitt av den samme mus med bakbena, som vist på C (delvis grenser til seksjonen i C) TUNEL-merket med TdT enzym utelatt for å tjene som en negativ kontroll. Det er ikke noe lys TUNEL-positive signal; den eneste grønne signal er autofluorescence som oppdages ved colocalization med signal i den røde kanalen. Skala bar = 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

2 "fo: content-width =" 6in "src =" / files / ftp_upload / 52211 / 52211fig2highres.jpg "width =" 600 "/>
Figur 2: Tissue autofluorescence må vurderes og utelukkes fra kvantifisering når analysere TUNEL merking. (A) Mouse bakben tverrsnitt med TUNEL merking og autofluorescence: originalbildet (øverste rad), samme bildet med justerte terskler (midterste rad), og samme bilde med autofluorescence (rød) kanal trekkes (nederste rad). Thresholding eliminerer mest røde blodceller og endotelceller autofluorescence men ikke fargingen artefakt (pilspiss, midterste rad). Kanal subtraksjon eliminerer også flekker artefakt (pilspiss, nederste rad). Grønn - TUNEL, rød - autofluorescence, blå - kjerner. Skala bar = 100 mikrometer. Grå firkant markerer området forstørret i B. (B) Høyere forstørrelse bilde av rød autofluorescence panel i A. Røde blodceller og noen endotelialceller (piler), og en tissue flekker juvelen (pilspiss) autofluoresce i både røde og grønne fluorescens filtre. Skala bar = 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: TUNEL merking viser celledød i skjelettmuskulatur av neonatale SMA mus Lavere bakben muskler fra SMA mus ved postnatal dag 5 ble merket av TUNEL metoden (A) TUNEL merking viser flere apoptotiske profiler i flere muskelgrupper i SMA mus.. muskel (høyre) sammenlignet med kull kontroll (venstre). Grønn - TUNEL, blå - Hoechst (kjerner), rød - autofluorescence. Stiplede linjer avgrense muskel områder kvantifisert. TA - tibialis anterior, FDL - flexor graveitorum longus, Edl - extensor digitorum longus. Skala barer = 200 mikrometer. (B) TUNEL merking ble kvantifisert som total pikselområde TUNEL signal normalisert til total pikselområde av muskel. Betyr ± standardfeil er vist, n = 4-5 mus. Statistisk signifikant sammenheng mellom SMA og kontroll for hver muskelgruppe (ensidige t-test): * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001. Dette tallet har blitt forandret fra Fayzullina og Martin 2014 10. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En fremgangsmåte for å detektere og kvantitativt å analysere DNA-skade-assosierte apoptose i mus skjelettmuskel er beskrevet. Prosedyren omfatter vev høsting, TUNEL farging, digital image oppkjøpet, og bildeanalyse. Vanligste histologiske forsyninger og verktøy er nødvendig, og en spesiell kommersiell TUNEL kit er nødvendig. De essensielle store utstyr elementer som trengs er en kryostat, epifluorescent mikroskop med digitalt bilde evne, og et datasystem for bildeanalyse.

Eksperimentator bør være oppmerksom på mulige fallgruver. Tissue autofluorescence er et stort problem i fluorescens bildebehandling. I unperfused dyr, vil gjenværende røde blodceller bidrar ganske høy autofluorescent signal. Endotelceller kan også bli betydelig autofluorescent. Derfor er det viktig å bekrefte at autofluorescens ikke forveksles med TUNEL-positivt signal. Denne vurderingen gjør du enkelt ved å ta et bilde i en kanal uten fluorophore, som skal brukes for sammenligning og mulig subtraksjon fra TUNEL-positive kanal. På denne måten er det fluorescens-basert TUNEL metoden overlegen kolorimetriske lysfelt mikroskopi metoder som ikke tilbyr en intern kontroll for bakgrunnsfarging.

Vev fiksering vil ha betydelige effekter på suksessen til TUNEL merking. Det er best å minimalisere festing tid i paraformaldehyd, for ikke å overstige 24 timer. Embryonale og neonatal vev vil kreve festetiden betraktelig kortere enn 24 timer.

Når TUNEL merking er vellykket, bør TUNEL-positive signalet være mye høyere enn bakgrunns autofluorescence, slik at signalet kan lett isoleres ved intensitet-terskel gating ved bildeanalyse programvare. Antigen gjenfinning ved hjelp av standardprotokollen av oppvarming i sitratbuffer 27,35 kan være noe bedre lav TUNEL signal hvis oppvarming tid holdes på et minimum (5 min), men dette forbehandling tids å redusere TUNEL-signal hvis oppvarming er utvidet for lengre perioder (for eksempel 20 minutter ved 95 ° C). Antigen gjenfinning vil øke bakgrunn autofluorescence og falske positiver, og dermed kan negere noen gevinst i signal-til-støy-forhold fra økt TUNEL signal.

De TUNEL signalmålinger må være normalisert enten til den totale muskelområdet kvantifisert eller til antallet kjerner pr området kvantifisert. Fordi TUNEL måler apoptotiske kjerner, ville det ideelle normalisering være totalt kjerner. Imidlertid, selv i forholdsvis tynne (10 um) muskel seksjonene, myofibers og kjerner er så tallrike og pakket så tett, at det er umulig for automatisk å telle Hoechst-fargede kjerner etter Terskelverdier og partikkelseparasjons algoritmer. Manuell telling er også svært arbeidskrevende og unøyaktig. Gjennomførbart alternativ er å normalisere til total muskelområdet.

Den TUNEL analysen brukes med passende vev behandlingteknikker og positive og negative kontroller, er en forholdsvis rask, reproduserbar, kvantitativ metode for påvisning av DNA-skade og celledød i vev. Den kan brukes for å bekrefte apoptose som en patologisk mekanisme, for å identifisere aktuelle celletyper, og for å vurdere effekten av terapeutiske behandlinger. Denne fremgangsmåten vil være av verdi for forskere innen muskel-skjelettlidelser sykdom og skade, inkludert SMA, ALS, muskeldystrofi, toksin myopati, og treningsfysiologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% Paraformaldehyde in phosphate buffered saline Electron Microscopy Sciences 19202 For procedures described here, 4% solution was prepared fresh from powder. Paraformaldehyde from any supplier may be used. Prepared formaldehyde solution should be stored at 4 °C and should not be used after its expiration date (up to several months). Paraformaldehyde is a carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling paraformaldehyde.
Sucrose Sigma S0389 Used for cryoprotecting tissue before freezing. Sucrose from any supplier may be used.
O.C.T. compound Tissue-Tek 4583 Embedding medium for cryosectioning.
Cryostat Leica CM 3050S A Leica CM3050S cryostat was used for the preparations described here. Any cryostat capable of cutting 10 μm sections may be used.
Glass slides, 25 x 75 x 1 mm Fisher 12-552-3 Slides from any supplier may be used.
Gelatin Sigma G-9391 Gelatin is used to promote tissue section adhesion to glass slides. To coat glass slides with gelatin, dissolve 2.75 g gelatin and 0.275 g chrome alum in 500 ml distilled water, warm to 60 °C, dip slides for several seconds, and let dry. Gelatin from any supplier may be used. Alternatively, gelatin-precoated slides may be purchased.
Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate (chrome alum) Sigma 243361 Chrome alum is added to gelatin solution to promote tissue adhesion on glass slides. It is a possible carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling chrome alum.
Vectabond tissue adhesion reagent Vector Labs SP-1800 Optional substrate for better tissue adhesion to glass slides; gelatin-coated slides may be used instead.
Tween20 Sigma P9416 A detergent used to permeabilize tissue. Tween20 from any supplier may be used.
Triton X100 Sigma T8787 A detergent used to permeabilize tissue. Triton X100 from any supplier may be used.
TACS 2 TdT fluorescein in situ apoptosis detection kit Trevigen 4812-30-K Commercial kit for fluorescence-based TUNEL labeling.
DNase/nuclease Trevigen 4812-30-K (included with kit)
DNase/nuclease buffer Trevigen 4812-30-K (included with kit)
10x phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 Amresco 780 Make 1x PBS for washes and dilutions. PBS from any supplier may be used.
DNase-free water Quality Biologicals 351-029-131 Water from any supplier may be used.
Hoechst 33258 Sigma 94403 Nuclear dye. Any blue fluorescent nuclear dye may be used. As a DNA-binding dye, Hoechst is a suspected carcinogen and should be handled with protective equipment to minimize skin contact.
Parafilm M multiple 807 Any other hydrophobic film or cover slip may be used. Available from multiple suppliers.
Fluorescent microscope with digital camera  --  -- Any fluorescent microscope capable of digitally capturing red, green, and blue fluorescence in separate channels may be used.
Vectashield antifade media Vector Labs H-1000 Antifade media from any supplier may be used.
glass coverslips, No.1 thickness Brain Research Labs 2222-1 Cover slips from any supplier may be used. The smallest size of 22 x 22 mm is sufficient for neonatal mouse leg sections.
Nail polish Ted Pella 114-8 Used to seal coverslips. Nail polish from any supplier (including regular retailers) may be used. Avoid using nail polish with color or additives that may reflect light during fluorescent imaging.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ansari, B., Coates, P. J., Greenstein, B. D., Hall, P. A. In situ end-labelling detects DNA strand breaks in apoptosis and other physiological and pathological states. 170 (1), 1-8 (1993).
  2. Ben-Izhak, O., Laster, Z., Akrish, S., Cohen, G., Nagler, R. M. TUNEL as a tumor marker of tongue cancer. Anticancer Res. 28 (5B), 2981-2986 (2008).
  3. Colecchia, M., et al. Detection of apoptosis by the TUNEL technique in clinically localised prostatic cancer before and after combined endocrine therapy. 50 (5), 384-388 (1997).
  4. Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Mol. Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).
  5. Delaurier, A., et al. The Mouse Limb Anatomy Atlas: an interactive 3D tool for studying embryonic limb patterning. 8, 83 (2008).
  6. Torres, C., Munell, F., Ferrer, I., Reventos, J., Macaya, A. Identification of necrotic cell death by the TUNEL assay in the hypoxic-ischemic neonatal rat brain. Neurosci. Lett. 230 (1), 1-4 (1997).
  7. Didenko, V. V. In Situ Detection of DNA Damage : Methods and Protocols. , Humana Press. 978-970 (2002).
  8. Edelman, J. C., Edelman, P. M., Kniggee, K. M., Schwartz, I. L. Isolation of skeletal muscle nuclei. J. Cell Biol. 27 (2), 365-378 (1965).
  9. Facchinetti, A., Tessarollo, L., Mazzocchi, M., Kingston, R., Collavo, D., Biasi, G. An improved method for the detection of DNA fragmentation. J. Immunol. Methods. 136 (1), 125-131 (1991).
  10. Fayzullina, S., Martin, L. J. Skeletal muscle DNA damage precedes spinal motor neuron DNA damage in a mouse model of spinal muscular atrophy (SMA). PLoS.One. 9 (3), e93329 (2014).
  11. Ferrer, I., et al. Naturally occurring cell death in the developing cerebral cortex of the rat. Evidence of apoptosis-associated internucleosomal DNA fragmentation. Neurosci. Lett. 182 (1), 77-79 (1994).
  12. Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J. Cell Biol. 119 (3), 493-501 (1992).
  13. Gown, A. M., Willingham, M. C. Improved detection of apoptotic cells in archival paraffin sections: immunohistochemistry using antibodies to cleaved caspase 3. J. Histochem. Cytochem. 50 (4), 449-454 (2002).
  14. Hara, A., et al. Neuronal apoptosis studied by a sequential TUNEL technique: a method for tract-tracing. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4 (2), 140-146 (1999).
  15. Harn, H. J., et al. Apoptosis occurs more frequently in intraductal carcinoma than in infiltrating duct carcinoma of human breast cancer and correlates with altered p53 expression: detected by terminal-deoxynucleotidyl-transferase-mediated dUTP-FITC nick end labelling (TUNEL). Histopathology. 31 (6), 534-539 (1997).
  16. Hsieh-Li, H. M., et al. A mouse model for spinal muscular atrophy. Nat. Genet. 24 (1), 66-70 (2000).
  17. Huerta, S., Goulet, E. J., Huerta-Yepez, S., Livingston, E. H. Screening and detection of apoptosis. J. Surg. Res. 139 (1), 143-156 (2007).
  18. Iwaki, T., Yamashita, H., Hayakawa, T. A color atlas of sectional anatomy of the mouse. 1, 1st edn, Braintree Scientific. Japan. (2001).
  19. Kaufman, M. H. The atlas of mouse development. , 1st edn, Academic Press. London. (1992).
  20. Koppen, G., Angelis, K. J. Repair of X-ray induced DNA damage measured by the comet assay in roots of Vicia faba. Environ. Mol. Mutagen. 32 (2), 281-285 (1998).
  21. Kuehl, L. Isolation of skeletal muscle nuclei. Methods Cell Biol. 15, 79-88 (1977).
  22. Kuo, L. J., Yang, L. X. Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).
  23. Labat-Moleur, F., et al. TUNEL apoptotic cell detection in tissue sections: critical evaluation and improvement. J. Histochem. Cytochem. 46 (3), 327-334 (1998).
  24. Modak, S. P., Bollum, F. J. Detection and measurement of single-strand breaks in nuclear DNA in fixed lens sections. Exp. Cell Res. 75 (2), 307-313 (1972).
  25. Naruse, I., Keino, H., Kawarada, Y. Antibody against single-stranded DNA detects both programmed cell death and drug-induced apoptosis. Histochemistry. 101 (1), 73-78 (1994).
  26. National Research Council (US) Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th edn, National Research Council. Washington, D.C.. (2011).
  27. Negoescu, A., et al. In situ apoptotic cell labeling by the TUNEL method: improvement and evaluation on cell preparations). J. Histochem. Cytochem. 44 (9), 959-968 (1996).
  28. Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 123 (1), 291-298 (1984).
  29. Phanithi, P. B., Yoshida, Y., Santana, A., Su, M., Kawamura, S., Yasui, N. Mild hypothermia mitigates post-ischemic neuronal death following focal cerebral ischemia in rat brain: immunohistochemical study of Fas, caspase-3 and TUNEL. Neuropathology. 20 (4), 273-282 (2000).
  30. Portera-Cailliau, C., Price, D. L., Martin, L. J. Excitotoxic neuronal death in the immature brain is an apoptosis-necrosis morphological continuum. J. Comp Neurol. 378 (1), 70-87 (1997).
  31. Portera-Cailliau, C., Price, D. L., Martin, L. J. Non-NMDA and NMDA receptor-mediated excitotoxic neuronal deaths in adult brain are morphologically distinct: further evidence for an apoptosis-necrosis continuum. J. Comp Neurol. 378 (1), 88-104 (1997).
  32. Ravi, D., Ramadas, K., Mathew, B. S., Nalinakumari, K. R., Nair, M. K., Pillai, M. R. De novo programmed cell death in oral cancer. Histopathology. 34 (3), 241-249 (1999).
  33. Sakaki, T., Kohmura, E., Kishiguchi, T., Yuguchi, T., Yamashita, T., Hayakawa, T. Loss and apoptosis of smooth muscle cells in intracranial aneurysms. Studies with in situ DNA end labeling and antibody against single-stranded DNA. Acta Neurochir.(Wien). 139 (5), 469-474 (1997).
  34. Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: past, present, and future. J. Histochem. Cytochem. 45 (3), 327-343 (1997).
  35. Shi, S. R., Imam, S. A., Young, L., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry under the influence of pH using monoclonal antibodies. J. Histochem. Cytochem. 43 (2), 193-201 (1995).
  36. Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp. Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).
  37. Sirvent, J. J., Aguilar, M. C., Olona, M., Pelegri, A., Blazquez, S., Gutierrez, C. Prognostic value of apoptosis in breast cancer pT1-pT2). A TUNEL, p53, bcl-2, bag-1 and Bax immunohistochemical study. Histol.Histopathol. 19 (3), 759-770 (2004).
  38. Skyrlas, A., Hantschke, M., Passa, V., Gaitanis, G., Malamou-Mitsi, V., Bassukas, I. D. Expression of apoptosis-inducing factor (AIF) in keratoacanthomas and squamous cell carcinomas of the skin. Exp. Dermatol. 20 (8), 674-676 (2011).
  39. Smith, M. D., Weedon, H., Papangelis, V., Walker, J., Roberts-Thomson, P. J., Ahern, M. J. Apoptosis in the rheumatoid arthritis synovial membrane: modulation by disease-modifying anti-rheumatic drug treatment. Rheumatology.(Oxford). 49 (5), 862-875 (2010).
  40. Stadelmann, C., Lassmann, H. Detection of apoptosis in tissue sections). Cell Tissue Res. 301 (1), 19-31 (2000).
  41. Schans, G. P., van Loon, A. A., Groenendijk, R. H., Baan, R. A. Detection of DNA damage in cells exposed to ionizing radiation by use of anti-single-stranded DNA monoclonal antibody. Int. J. Radiat. Biol. 55 (5), 747-760 (1989).
  42. Watanabe, I., et al. Detection of apoptotic cells in human colorectal cancer by two different in situ methods: antibody against single-stranded DNA and terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end-labeling (TUNEL) methods. Jpn. J. Cancer Res. 90 (2), 188-193 (1999).
  43. Watanabe, T., et al. Apoptosis signal-regulating kinase 1 is involved not only in apoptosis but also in non-apoptotic cardiomyocyte death. Biochem. Biophys. Res. Commun. 333 (2), 562-567 (2005).
  44. Yaoita, H., Ogawa, K., Maehara, K., Maruyama, Y. Attenuation of ischemia/reperfusion injury in rats by a caspase inhibitor. Circulation. 97 (3), 276-281 (1998).

Tags

Fysiologi TUNEL fluorescens skjelettmuskulatur DNA-skade bildeanalyse histologi SMA Motonevronsykdom
Deteksjon og analyse av DNA Skade i Mouse Skeletal Muscle<em&gt; In Situ</em&gt; Bruke TUNEL Method
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fayzullina, S., Martin, L. J.… More

Fayzullina, S., Martin, L. J. Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method. J. Vis. Exp. (94), e52211, doi:10.3791/52211 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter