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Biology

Erkennung und Analyse von DNA-Schädigungen in Maus-Skelettmuskel Published: December 16, 2014 doi: 10.3791/52211
Automatic Translation
1, 1
1Division of Neuropathology, Department of Pathology, Pathobiology Graduate Program, Johns Hopkins School of Medicine

Introduction

Desoxyribonukleotidyltransferase (TdT) dUTP nick end labeling (TUNEL) ist der Prozess, mit dem TdT-Enzym zu dUTP bis 3 befestigen-Enden von Doppel- und Einzelstrang-DNA bricht 12,23. Die TUNEL-Methode zur Detektion von Apoptose und DNA-Schädigung wurde zuerst vor mehr als 20 Jahren von Gavrieli et al. 1,12,24 gemeldet. Es ist seit bewertet worden und in verschiedenen Gewebepräparaten 7,23,27,40 optimiert. TUNEL verwendet wurde, um Ischämie-induziertem Zelltod von Neuronen 6,14,29 und Kardiomyozyten 43,44, exzitotoxischen neuronalen Zelltod 30,31 studieren und als Biomarker in Arthritisbehandlung 39. Es hat sich auch als prognostischer Faktor und Tumorzellmarker in verschiedenen menschlichen Krebsarten 2,3,15,32,37,38,42 verwendet.

Alternative Methoden gibt es für DNA-Schädigung und Zelltod-Erkennung, aber sie technische Herausforderungen und Einschränkungen haben. Southern-Blotting verwendet werden, um quantif werdeny DNA-Schäden in ganz Gewebelysaten 7,9-11, aber diese Methode bietet keine Zellebene Auflösung und ist schwer zu quantifizieren. Der Comet-Assay ist eine Alternative zellbasierte Verfahren, die Extraktion erhaltenen Kerne von Zellen 4,20,28,36 erfordert. Obwohl der Comet-Assay eignet sich gut an kultivierten isolierten Zellen, ist es viel schwieriger, intakten Zellkernen von Skelettmuskelgewebe 8,21 vorzubereiten. Wie bei Southern-Blot, wird der Comet-Assay keine Zelltyp-spezifische Informationen aus einer ganzen Muskel Gewebehomogenat. Eine weitere Alternative der TUNEL-Methode ist die Immunhistochemie unter Verwendung von Antikörpern gegen einzelsträngige DNA 25,33,41 oder gegen Proteine, die in die DNA-Reparatur und Zelltod Wege beteiligt (zB p53, H2AX und Caspasen) 13,17,22,40. Solche Antikörper-basierten Verfahren benötigen sorgfältige Charakterisierung von Antikörpern und ausgezeichnete Antikörperspezifität, ein hohes Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis zu erhalten. Auch wenn specific Antikörper vorhanden sind, sie die Denaturierung des Zielproteins durch Antigengewinnungsverfahren 34,35 erfordern. Wie wir hier diskutieren, Antigen-Retrieval im Muskelgewebe führt zu inakzeptabel hohen Autofluoreszenz. Im Gegensatz zu den alternativen Methoden, TUNEL erreicht DNA Schadenserkennung mit einem hohen Signal und niedrige Hintergrund, ausgezeichnete Spezifität, die mit einfachen Positiv- und Negativkontrollen, gute Gewebepenetration, die keine Antigen-Retrieval nicht verlangen, und zellulären Ebene Auflösung getestet werden können. Darüber hinaus nimmt der TUNEL-Methode ca. 4 Stunden in Anspruch, während alternative Methoden erfordern in der Regel über Nacht Inkubationen.

Wir untersuchen die Skelettmuskulatur Zelltod in einem Mausmodell der spinalen Muskelatrophie (SMA) 10, die von Hsieh-Li und seine Kollegen 16 generiert wurde. Apoptotische Zellen quantifizieren im Muskel, haben wir ein Verfahren zur Gewebevorbereitung, Anfärbung und Quantifizierung, das robust gegenüber verschiedenen skele arbeitet entwickeltental Muskelgruppen in verschiedenen Entwicklungszeitpunkten bei Mäusen. Wir verwenden ein handelsübliches TUNEL-Markierungs-Kits und handelsüblichen Bildanalyse-Software. Wir haben erfolgreich die TUNEL-Assay in Kombination mit Immunfluoreszenzfärbung in der Wirbelsäule 10 eingesetzt.

Die hier beschriebenen Methoden sind nützlich für Ermittler, die zu Gewebepathologie, Mechanismen der Krankheits, Mechanismen des Alterns und Entwicklungs (prä- und postnatalen) Zelltod in der Skelettmuskulatur bewerten möchten. Die TUNEL-Technik ist besonders nützlich für die Untersuchung der DNA-Schädigung und Reparatur und Zelltod in Modellsystemen, wo nur eine Untergruppe von Zellen notwendig betroffenen und zellulärer Ebene Auflösung.

Dieses Video beschreibt Dissektion Gewebeverarbeitung, Schneide- und Fluoreszenz basierenden TUNEL Kennzeichnung Maus Skelettmuskel. Sie beschreibt auch ein Verfahren zur halbautomatischen TUNEL Signal Quantifizierung.

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Protocol

HINWEIS: Alle in diesem Protokoll beschriebenen Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Empfehlungen in der Bedienungsanleitung für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health 26 durchgeführt. Das Protokoll (MO13M391) wurde von der Johns Hopkins University Animal Care und Verwenden Committee genehmigt.

1. neonatale Maus Opfer, Dissection, und Fixierung

  1. Opfere eine neonatale Maus durch CO 2 Inhalation.
  2. Unmittelbar vor der Hinterlauf oberhalb des Knies geschnitten. Bis etwa postnatalen Tag 7, sind die Beinknochen weich genug über mit großen Labor Schere oder scharfe Klinge zu schneiden und anschließend Abschnitt eines Kryostaten.
  3. Platzieren Sie den Hinterlauf in 10 ml eiskaltem 4% Paraformaldehyd in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) in einem 15 ml Röhrchen.
  4. Eint fixieren den Hinterlauf in Paraformaldehyd für 4-24 h bei 4 ° C. Embryonalem Gewebe erfordert nur wenige Stundens der Fixierung.
    1. Fixierung Vermeiden von mehr als 24 Stunden, da dies TUNEL-Assay Effizienz reduzieren.
  5. Cryoprotect den Hinterlauf durch in einer Zuckerlösung eingetaucht wird.
    1. Ändern Paraformaldehyd und 10% Saccharose in PBS auf die gleiche 15-ml-Röhrchen, Inkubieren über Nacht bei 4 ° C.
    2. Änderung bis 30% Saccharose in PBS, inkubiert über Nacht bei 4 ° C oder, bis der Hinterlauf sinkt auf den Boden des Röhrchens. Gewebe kann in 30% Sucrose für eine längere Zeit verwendet werden, vorausgesetzt, daß die Saccharose wurde sterilfiltriert.

2. Gewebeeinbettung

  1. Füllen Sie eine markierte Einbettform Hälfte mit Einbettmedium.
  2. Platzieren hindlimb auf der Oberseite des Einbettungsmediums, mit der Schnittfläche möglichst nahe an einer Wand der Form. Markieren die Ausrichtung der Hinterlauf an der Außenseite der Form.
    1. Betten Sie mehrere Hinterbeine und im selben Block geschnitten. Jedoch ist es wichtig, sicherzustellen, dass alle Hindlimbs im Block sind parallel zueinander ausgerichtet sind, um Abschnitte fristenkon- Ebenen längs der Achse des Gliedes zu erhalten.
  3. Bedecken Hinterbeine mit Einbettmedium. Wenn Hinterbeine verschieben beim Schütten von Medium, neu orientieren sie mit stumpfen Pinzette oder einem Zahnstocher.
  4. Zulassen Einbettmedium, um das Gewebe bei Raumtemperatur für mindestens 15 min zu infiltrieren.
  5. Platz Formen direkt auf Trockeneis oder in Isopentan auf Trockeneis zu frieren Einbettmedium. Achten Sie auf die Formen Niveau halten zu allen Zeiten und Verschiebung der eingebetteten Gewebe vermeiden.
  6. Halten gefrorenen Formen bei -80 ° C bis bereit zu schneiden, bis zu mehreren Monaten.

3. Kryoschneiden Embedded Gliedmaßen

  1. Stellen Kryostatkammer Temperatur bis -20 ° C, Objekttemperatur bis -18 ° C; einstellen Objekttemperatur abkühlen.
  2. Äquilibrieren der Gewebeblock in der Kryostatkammer für mindestens 30 min. Correct Block Tempratur ist entscheidend für Schnittqualität.
  3. Geschnitten Querschnitte mit einer Dicke von 10 um oder weniger. Dickere Abschnitte nicht vollständig durch TUNEL Reagenzien durchdrungen werden. Verwenden Sie den Treckerplatte, Klingen und Klingenwinkel (in der Regel 5 °) empfohlen für den Kryostaten.
  4. Sammeln Schnitte auf gelatin- oder vectabond beschichteten Glasobjektträger bei Raumtemperatur. Platzieren Sie sofort in eine Schiebefenster auf Trockeneis. Halten Sie den Schiebefenster in einem separaten Behälter mit Trockeneis in der Nähe des Kryostaten in Reichweite platziert.
    1. Schneiden Querschnittserien durch die lange Achse des Gliedes, das Überspringen von 100 bis 200 & mgr; m. Sammeln Sie mindestens 3 benachbarte Abschnitte an jedem Serienniveau.

4. TUNEL Assay am Hinterlauf Abschnitte mit einem handelsüblichen Kit (alle Schritte bei Raumtemperatur wenn nicht anders vermerkt)

  1. Tauen Sie Dias mit Abschnitten auf Raumtemperatur und trocken über Nacht oder über das Wochenende.
  2. Rehydrieren Abschnitte von immersing Dias in PBS für 2 x 10 min in einem Coplin-Gefäß. Dry mit einem Labor zu wischen, zu entfernen so viel Flüssigkeit um den Abschnitt wie möglich.
  3. Permeabilisieren Abschnitte
    1. Verwenden Sie entweder eine nicht-proteolytischen, Saponin-basierten kommerziellen Reagenz oder 0,5% Tween 20 und 0,05% Triton X100 in PBS.
    2. Den Objektträger in eine feuchte Kammer überführen. Eine einfache Feuchtigkeitskammer ist eine leere Pipettenspitzenkasten mit einem dichten Deckel, mit gerade genug Wasser zugesetzt, um die Unterseite der Box ab.
    3. Pipette genügend Reagenz auf den Objektträger, um den Abschnitt zu decken (50 ul reicht für neonatale Maus Gliedmaßen). Direkt pipettieren Sie nicht auf den Abschnitt, als wiederholte Rühren kann den Abschnitt zu veranlassen, heben Sie die Folie.
    4. Mit stumpfen Pinzette, legen Sie ein kleines Rechteck von Parafilm auf der Oberseite des Abschnitts, um sich auszubreiten die Tropfen des Reagens und den Abschnitt vollständig zu bedecken. Sollten Blasen unter der Parafilm, heben Sie sie vorsichtig ab, trocknen und erneut anwenden.
    5. Folien mit permeabili inkubierensierung Reagenz für 1 Stunde in einem abgedeckten feuchten Kammer. Sofern Teile beginnen, aus dem Schlitten abheben kann Permeabilisierung Zeit auf 30 Minuten reduziert werden.
    6. Waschen Sie Dias in PBS in einer Coplin-Gefäß 2 x 5 min. Die Parafilm Rechtecke sollte nach oben schweben und kann dann entfernt und entsorgt werden.
    7. Mit einem Labortuch trocknen so viel Flüssigkeit um die Abschnitte wie möglich.
  4. TdT-vermittelte DNA-Pause Kennzeichnung
    1. Folgen Sie den Anweisungen, um Kit 1x TdT Markierungspuffer pipettieren genug Markierungspuffer auf den Objektträger auf den Gewebeschnitt zu decken (50 ul reicht für neonatale Maus Gliedmaßen). Inkubieren in der Feuchtigkeitskammer für 5 min. Alternativ tauchen Sie die Folie in TdT Markierungspuffer in einer Coplin-Gefäß.
    2. Folgen Kit Anweisungen TdT Kennzeichnung Mix zu machen. Das Kit umfasst Kobalt, Magnesium und Mangan-Kationen; das Mangankation funktioniert gut auf einer Vielzahl von Geweben, einschließlich Skelettmuskel, dem Nervensystem tissues, Leber, Haut und Knochen.
    3. Für eine positive Kontrolle, fügen DNase (mit "Nuklease" im Satz) an die TdT Markierungsmischung. Alternativ vorzubehandeln eine positive Steuerabschnitt mit DNase in Nuklease-Puffer für 1 h bei 37 ° C, je nach Montageanweisungen. Halten DNase-Lösung und DNase behandelten Abschnitte entfernt von anderen experimentellen Abschnitten um eine Kreuzkontamination zu vermeiden.
    4. Für eine negative Kontrolle, wegzulassen TdT-Enzym von der Markierungsmischung.
    5. Verwenden Sie eine Laborwischtuch, um so viel TdT Markierungspuffer von dem Objektträger wie möglich zu entfernen. Pipette TdT Markierungsmischung auf den Objektträger (50 ul pro Abschnitt), Deckel mit einem neuen Rechteck von Parafilm, und Inkubation in der Feuchtigkeitskammer bei 37 ° C für 1 Stunde.
    6. Folgen Sie den Anweisungen, um Kit 1x Anschlagpuffer zu machen. Verwenden Sie ein Labor wischen TdT Markierungsmischung von der Folie zu entfernen, und fügen Sie 200-300 ul Stop-Puffer, um den Gewebeschnitt zu bedecken, und Inkubation in der Feuchtigkeitskammer für 5 min. Al nativ, tauchen Sie die Folie in Anschlagpuffer in einer Coplin-Gefäß.
    7. Die Folie 2 x 2 min in PBS waschen. Verwenden Sie eine Laborwischtuch, um so viel PBS zu entfernen von der Folie wie möglich.
  5. Fluoreszenzmarkierung
    1. Folgen Kit Anweisungen an Fluorescein Etikettierungslösung vorbereiten, dNTPs auf DNA-Brüche kennzeichnen. Pipette Lösung auf den Objektträger (50 ul pro Abschnitt), Deckel mit einem neuen Rechteck von Parafilm, und Inkubation in der feuchten Kammer für 20 min.
    2. Wash Rutsche für 2 min in PBS in einer Coplin-Gefäß. Verwenden Sie eine Laborwischtuch, um so viel PBS von der Folie zu entfernen, wie möglich.
    3. Verdünne Hoechst 33258 Kernfärbung bis 1 ug / ml in PBS und Pipette auf den Schlitten (100-200 & mgr; l ist ausreichend, um Teilabdeckung). Inkubieren in der Feuchtigkeitskammer für 5 min.
    4. Für 5 min in PBS waschen 3x.
    5. Deckglas mit Antifade Fluoreszenz Eindeckmittel und Dichtung Kanten mit Nagellack.
jove_title "> 5. Digitale Bildaufnahme

  1. Erwerben von Bildern mit einem konventionellen Fluoreszenzmikroskop mit DAPI, FITC und Texas Red-Filter (oder äquivalent). Verwenden Sie eine höhere Vergrößerung Ziel (20X oder 40X), um zu überprüfen, dass die Kennzeichnung war erfolgreich und Kerne (intakt oder fragmentiert) markiert waren. A 10X-Objektiv ist ausreichend für die Quantifizierung der TUNEL-positiven puncta.
  2. Bilder der Hoechst-Färbung, TUNEL-Färbung und Autofluoreszenzsignals Sammeln Sie so drei separate Falschfarbenkanäle in einem Bild kombiniert. Wenn der TUNEL Fluorophormarkierung ist grün, Bild Autofluoreszenzsignals im Rotfilter, und umgekehrt.
    1. Bewahren Sie alle Bildeinstellungen Äquivalent zwischen den Folien für die anschließende Schwellen und Quantifizierung. Für jeden Filter, Presets und Plattenbelichtungszeiten, Verstärkung und Binning (kein Binning ist am besten); Verwenden Sie keine automatische Belichtungs oder Verstärkungseinstellungen.
    2. Verwenden Sie Trial-and-error, um Belichtung und Gain-Einstellungen, die am besten erfassen wird die Palette der inten findenschulen in allen gefärbten Schnitten. Stellen Sie sicher, dass es keine gesättigten Pixel in den erfassten Bildern, da dies die Bias-Quantifizierung.
  3. Nehmen Sie Bilder des gesamten Muskelgruppe von Interesse. Dies kann erfordern, mehrere Bilder zu "genäht" werden zusammen.

6. Bildanalyse

  1. Verwenden Sie handelsübliche Bildanalyse-Programme, um digitale Bilder von TUNEL-Färbung analysiert. Analyse mittels kommerzieller Software wird hier gezeigt. Alternativ kann die freie Software ImageJ von NIH zur TUNEL-Färbung analysiert werden.
  2. Fleck einen Abschnitt neben dem TUNEL-gefärbten Abschnitt mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) und einen Vollschnitt digitalen Bildes mit einem konventionellen Hellfeldmikroskop. Verwenden Sie dieses Bild H & E in Kombination mit einem Anatomieatlas 5,18,19, um die anatomischen Strukturen zu quantifizieren verfolgen.
  3. Bei ausgeschaltetem TUNEL Kanal manuell die Kontur der Fläche zu verfolgen, um zu quantifizieren, mitHoechst und Autofluoreszenz-Kanäle für die Führung. Die zurückBereich in eine Maske konvertieren (eine Reihe von ausgewählten Pixelkoordinaten zu analysieren).
  4. Schalten Sie den TUNEL-Kanal. Mit der Intensität Schwellenwertfunktion in der Bildanalyse-Programm, stellen Sie die untere Schwelle, um alle Autofluoreszenzsignal aus.
  5. Übernehmen Sie die gleiche Schwellenwerteinstellungen für alle Bilder in der Studie Set. Konvertieren einer Schwellenwertauswahl in Masken.
  6. Für jedes Bild, kombinieren die Muskelfläche Maske und die TUNEL-Maske. Die neue Kombination Maske TUNEL Signal innerhalb nur der zurückMuskelBereich darstellen.
  7. Führen Maske Quantifizierung auf die Kombination Maske Anzahl von Objekten zu bestimmen, und Objektbereich des TUNEL-Signal innerhalb des Muskelbereichs zurückzuführen. Führen Sie diese mit Hilfe der Particle Analyzer-Funktion in ImageJ.

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Representative Results

Mit erfolgreichen Färbung sollte TUNEL-positiven Signal hell genug, um von Autofluoreszenz, indem Intensitätsschwellen zu isolieren. TUNEL-positive Objekte bei geringer Vergrößerung als helle unregelmäßige Fragmente im Skelettmuskel (1A) angezeigt. Jedoch bei höherer Vergrößerung einige TUNEL-positive Objekte mit dem klassischen apoptotische Morphologie zu beachten, wenn der Zelltod-Typ beteiligt ist, Apoptose (Figur 1B). Die positive Kontrolle (DNase zugegeben) sollte reichlich TUNEL-positive Signal, einheitlich über alle Gewebe im Abschnitt (1C) verteilt aufweisen. Die Negativkontrolle (TdT-Enzym aus der Reaktion weggelassen) sollte geringer Intensität Hintergrund und autofluoreszierenden Signal nur (1D) zu ergeben. Haut stellt eine interne positive Kontrolle in ganzen Beinteile, da diese Gewebe eine hohe Rate der normalen Apoptose (Figur 1A).

Rote BlutZellen, Knochen und Endothelzellen können signifikante Autofluoreszenzsignal (Abbildung 2) bei. Es ist ratsam, Bild jeder Abschnitt in einem separaten Kanal ohne Fluoreszenzmarkierung, dass Autofluoreszenz zu gewährleisten ist nicht zu verwechseln mit TUNEL positive Signalisierung. Wahre TUNEL-positiven Signal sollte viel höhere Intensität als Autofluoreszenz haben, so dass es durch Einstellen der Bildintensität Schwellen (2A, mittlere Reihe) isoliert werden. Alternativ kann der Autofluoreszenzkanal digital von der TUNEL Kanal subtrahiert werden, um TUNEL-positiven Signal (2A, untere Reihe) ergeben.

Die hier beschriebene TUNEL Markierungsverfahren wurde verwendet, um die Skelettmuskulatur Zelltod in einem Mausmodell der SMA 10 zu quantifizieren. TUNEL Kennzeichnung zeigt einen Anstieg in der Anzahl der apoptotischen Profile Beinmuskeln 5 Tage alte SMA-Mäusen im Vergleich zu Kontrollen littermate (3A). Die Zunahme der Apoptosequantifizierbar durch die oben beschriebenen Verfahren angibt, statistisch signifikante Unterschiede in mehrere Muskelgruppen (3B).

Figur 1
Abbildung 1: Vertreter TUNEL Kennzeichnung Maus Hinterbein Muskeln. (A) TUNEL-markierten Querschnitt der Maus Hinterlauf zeigt M. tibialis anterior, Schienbein, und die Haut. TA - tibialis anterior, Fdl - langen Zehenbeugers, Edl - extensor digitorum longus. Green - TUNEL, blau - Kerne, rot - Autofluoreszenzsignals. Gepunktete Linien skizzieren Muskelbereiche für die Quantifizierung. Haut angrenzenden Hinterbein Muskeln stellt eine interne positive Kontrolle für TUNEL Kennzeichnung. Balken = 200 um. (B) Vertreter hoher Vergrößerung Bilder zu identifizieren TUNEL-positiven Strukturen (grün) in embryonalen Tag 13 Maus-Skelettmuskel als apoptotischen Kernen. Maßstabsbalken = 10 & mgr; m. A und B aus Fayzullina und Martin 2014 10 geändert. (C) Querschnitt der Maus Hinterlauf TUNEL-markierten nach DNase-Behandlung, um als positive Kontrolle zu dienen. Die meisten Kerne hellen TUNEL Kennzeichnung. Balken = 50 um. (D) Querschnitt der gleichen Maus Hinterlauf wie in C gezeigt (halb angrenzenden Abschnitt in C) mit TdT-Enzym unterlassen, als negative Kontrolle dienen TUNEL-markierten. Es gibt keine hellen TUNEL-positiven Signal; die nur grünes Autofluoreszenzsignal ist, wie durch Co-Lokalisierung mit dem Signal in den roten Kanal detektiert. Maßstabsbalken = 50 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

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Abbildung 2: Gewebeautofluoreszenz zu berücksichtigen und von Quantifizierung ausgeschlossen bei der Analyse von TUNEL Kennzeichnung werden. (A) Maus-Hinterlauf Querschnitt mit TUNEL Kennzeichnung und Autofluoreszenz: Originalbild (obere Reihe), dasselbe Bild mit angepassten Schwellenwerte (mittlere Reihe), und dasselbe Bild mit Autofluoreszenz (rot) Kanal subtrahiert (untere Reihe). Schwellen beseitigt die meisten der roten Blutzellen und Endothelzellen Autofluoreszenz, aber nicht die Färbung Artefakt (Pfeilspitze, mittlere Reihe). Kanal Subtraktion eliminiert auch die Färbung Artefakt (Pfeilspitze, untere Reihe). Green - TUNEL, rot - Autofluoreszenz, blau - Kernen. Balken = 100 um. Eine stärkere Vergrößerung Bild der roten Eigenfluoreszenz Panel graues Rechteck skizziert Bereich B vergrößert. (B) in A. Rote Blutkörperchen und einige Endothelzellen (Pfeile) und eine tissue Färbung Artefakt (Pfeilspitze) Autofluoreszenz in beiden roten und grünen Fluoreszenz-Filter. Maßstabsbalken = 50 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Figur 3
Abbildung 3: TUNEL Kennzeichnung zeigt Zelltod im Skelettmuskel neonataler SMA Mäusen Nieder hindlimb Muskeln von SMA-Mäusen am postnatalen Tag 5 wurden durch das TUNEL-Verfahren markiert (A) TUNEL Kennzeichnung zeigt mehrere apoptotischen Profile in mehrere Muskelgruppen in SMA Maus.. Muskel (rechts) im Vergleich zu Wurfkontrolle (links). Green - TUNEL, blau - Hoechst (Kernen), rot - Autofluoreszenz. Gepunktete Linien beschreiben die Muskelbereiche quantifiziert. TA - tibialis anterior, Fdl - Flexor digitorum longus, Edl - extensor digitorum longus. Maßstabsbalken = 200 um. (B) TUNEL Kennzeichnung wurde das Gesamtbildfläche von TUNEL Signal an das Gesamtbildfläche von Muskel normalisiert quantifiziert. Mittelwerte ± Standardfehler dargestellt sind, n = 4 - 5 Mäusen. Statistische Signifikanz zwischen SMA und Steuerung für jede Muskelgruppe (one-tailed t-Test): * p <0,05, ** p <0,01 *** p <0,001. Diese Zahl hat sich von Fayzullina und Martin 2014 10 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

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Discussion

Verfahren zum Nachweis und zur quantitativen Analyse von DNA-Schäden assoziierten Apoptose in Skelettmuskel der Maus beschrieben. Das Verfahren beinhaltet Gewebeernte, TUNEL-Färbung, digitale Bildaufnahme und Bildanalyse. Gemeinsame histologische Lieferungen und Werkzeuge benötigt werden, und eine spezielle Handels TUNEL-Kit erforderlich. Die wesentlichen große Ausrüstungsteile nötig sind, einen Kryostat, Epifluoreszenz-Mikroskop mit digitaler Bildfähigkeit und ein Computersystem zur Bildanalyse.

Der Versuchsleiter sollte sich bewusst sein, mögliche Fallstricke. Gewebeautofluoreszenz ist ein wichtiges Anliegen in Fluoreszenz-Imaging. In unperfused Tiere verbleibenden roten Blutkörperchen wird ziemlich hoch Autofluoreszenzsignal beitragen. Endothelzellen können auch deutlich autofluoreszierenden werden. Daher ist es wichtig, dass die Autofluoreszenz bestätigen, ist nicht zu verwechseln mit TUNEL-positiven Signal. Diese Einschätzung wird leicht, indem sie ein Bild in einem Kanal ohne fl erreichtuorophore, die für den Vergleich und mögliche Subtraktion von dem TUNEL-positiven Kanal verwendet werden. Auf diese Weise ist die fluoreszenzbasierte TUNEL Methode überlegen kolorimetrischen Hellfeldmikroskopie Methoden, die nicht bieten eine interne Kontrolle für die Hintergrundfärbung.

Gewebefixierung haben erhebliche Auswirkungen auf den Erfolg der TUNEL Kennzeichnung. Am besten ist es, um die Fixierung der Zeit in Para minimieren, 24 Stunden nicht zu überschreiten. Embryonale und neonatale Gewebe Fixierung Zeiten deutlich kürzer als 24 Stunden benötigen.

Wenn TUNEL Kennzeichnung erfolgreich ist, sollte TUNEL-positiven Signals viel höher als der Hintergrund-Autofluoreszenz ist, so daß das Signal kann durch Intensitätsschwellen Gating isoliert unter Verwendung von Bildanalysesoftware wird. Antigen-Wiedergewinnung unter Verwendung des Standardprotokolls von Wärme in Citratpuffer 27,35 geringfügig niedriger TUNEL Signals zu verbessern, wenn Erhitzungszeit auf ein Minimum (5 min) gehalten, aber diese Vorbehandlung zehnds TUNEL Signals zu verringern, wenn der Heizbetrieb für längere Zeit (zB 20 min bei 95 ° C) verlängert. Antigen-Retrieval wird Hintergrund-Autofluoreszenz und False Positives zu erhöhen, und somit kann keine Gewinne in der Signal-zu-Rausch-Verhältnis von erhöhter TUNEL Signal zu negieren.

Die TUNEL-Signalmessungen, die entweder die Gesamtmuskelfläche quantifiziert oder der Anzahl der Kerne pro Fläche quantitativ normalisiert. Da TUNEL misst apoptotischen Kernen, wäre die ideale Normalisierung Gesamt Kerne sein. , Auch in relativ dünnen (10 um) Muskelpartien Allerdings sind die Muskelfasern und Kerne so zahlreich und so dicht gepackt, dass es unmöglich ist, automatisch zu zählen Hoechst-gefärbten Zellkernen durch Schwellen und Partikelabscheidung Algorithmen. Manuelle Zählung ist auch sehr arbeitsintensiv und ungenau. Die mögliche Alternative ist es, die Gesamtmuskelbereich zu normalisieren.

Die TUNEL-Assay, mit den entsprechenden GewebeverarbeitungTechniken und positive und negative Kontrollen, ist eine relativ schnelle, reproduzierbare quantitative Verfahren zur Detektion von DNA-Schäden und Zelltod in Geweben. Es kann verwendet werden, um die Apoptose als Pathomechanismus bestätigen, auf die betroffenen Zelltypen zu identifizieren und um die Wirksamkeit von therapeutischen Behandlungen zu beurteilen. Dieses Verfahren wird der Wert für Forscher im Bereich der Skelettmuskulatur von Krankheiten und Verletzungen, einschließlich SMA, ALS, Muskeldystrophie, Toxin-induzierte Myopathie sein und Sportphysiologie.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% Paraformaldehyde in phosphate buffered saline Electron Microscopy Sciences 19202 For procedures described here, 4% solution was prepared fresh from powder. Paraformaldehyde from any supplier may be used. Prepared formaldehyde solution should be stored at 4 °C and should not be used after its expiration date (up to several months). Paraformaldehyde is a carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling paraformaldehyde.
Sucrose Sigma S0389 Used for cryoprotecting tissue before freezing. Sucrose from any supplier may be used.
O.C.T. compound Tissue-Tek 4583 Embedding medium for cryosectioning.
Cryostat Leica CM 3050S A Leica CM3050S cryostat was used for the preparations described here. Any cryostat capable of cutting 10 μm sections may be used.
Glass slides, 25 x 75 x 1 mm Fisher 12-552-3 Slides from any supplier may be used.
Gelatin Sigma G-9391 Gelatin is used to promote tissue section adhesion to glass slides. To coat glass slides with gelatin, dissolve 2.75 g gelatin and 0.275 g chrome alum in 500 ml distilled water, warm to 60 °C, dip slides for several seconds, and let dry. Gelatin from any supplier may be used. Alternatively, gelatin-precoated slides may be purchased.
Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate (chrome alum) Sigma 243361 Chrome alum is added to gelatin solution to promote tissue adhesion on glass slides. It is a possible carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling chrome alum.
Vectabond tissue adhesion reagent Vector Labs SP-1800 Optional substrate for better tissue adhesion to glass slides; gelatin-coated slides may be used instead.
Tween20 Sigma P9416 A detergent used to permeabilize tissue. Tween20 from any supplier may be used.
Triton X100 Sigma T8787 A detergent used to permeabilize tissue. Triton X100 from any supplier may be used.
TACS 2 TdT fluorescein in situ apoptosis detection kit Trevigen 4812-30-K Commercial kit for fluorescence-based TUNEL labeling.
DNase/nuclease Trevigen 4812-30-K (included with kit)
DNase/nuclease buffer Trevigen 4812-30-K (included with kit)
10x phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 Amresco 780 Make 1x PBS for washes and dilutions. PBS from any supplier may be used.
DNase-free water Quality Biologicals 351-029-131 Water from any supplier may be used.
Hoechst 33258 Sigma 94403 Nuclear dye. Any blue fluorescent nuclear dye may be used. As a DNA-binding dye, Hoechst is a suspected carcinogen and should be handled with protective equipment to minimize skin contact.
Parafilm M multiple 807 Any other hydrophobic film or cover slip may be used. Available from multiple suppliers.
Fluorescent microscope with digital camera  --  -- Any fluorescent microscope capable of digitally capturing red, green, and blue fluorescence in separate channels may be used.
Vectashield antifade media Vector Labs H-1000 Antifade media from any supplier may be used.
glass coverslips, No.1 thickness Brain Research Labs 2222-1 Cover slips from any supplier may be used. The smallest size of 22 x 22 mm is sufficient for neonatal mouse leg sections.
Nail polish Ted Pella 114-8 Used to seal coverslips. Nail polish from any supplier (including regular retailers) may be used. Avoid using nail polish with color or additives that may reflect light during fluorescent imaging.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Erkennung und Analyse von DNA-Schädigungen in Maus-Skelettmuskel<em&gt; In-situ-</em&gt; Verwenden der TUNEL-Methode
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Fayzullina, S., Martin, L. J.… More

Fayzullina, S., Martin, L. J. Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method. J. Vis. Exp. (94), e52211, doi:10.3791/52211 (2014).

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