Introduction
Terminal deoksinükleotidil transferaz (TdT) dUTP çentik uç etiketleme (TÜNEL) dUTP 3 bağlamak için TdT enzim kullanılarak işlemidir 'çift ve tek bükümlü DNA 12,23 sonları arasında sona erer. Apoptoz ve DNA hasarının tespiti için TÜNEL metodu ilk Gavrieli ve ark. 1,12,24 tarafından, 20 yıl kadar önce bildirildi. O zamandan beri değerlendirilir ve farklı doku hazırlıkları 7,23,27,40 optimize edilmiştir. TÜNEL nöronlar 6,14,29 ve 43,44 kardiyomiyositlerde ve iskemiye bağlı hücre ölümü, eksitotoksik nöronal hücre ölümünü 30,31 incelemek için kullanılan ve artrit tedavisinde 39 bir biyolojik olarak edilmiştir. Aynı zamanda, çeşitli insan kanserlerinde 2,3,15,32,37,38,42 bir prognostik faktör ve tümör hücre markeri olarak kullanılmıştır.
Alternatif yöntemler DNA hasarı ve hücre ölümü tespiti için var, ama onlar, teknik zorlukları ve uyarılar var. Southern lekeleme quantif için kullanılabilmektedirY bir DNA tam doku lysate'lerin 7,9-11 hasar, ancak bu yöntem hücre düzeyinde çözümlemesi sağlamak ve ölçmek için zor değildir. kuyrukluyıldız tahlil hücrelerinden 4,20,28,36 korunmuş çekirdekleri ayıklanan gerektiren bir alternatif hücre tabanlı bir yöntemdir. Kuyrukluyıldız tahlil kültüre izole hücreler üzerinde iyi çalışır rağmen, iskelet kas dokusunda 8,21 den sağlam çekirdekleri hazırlamak için çok daha zordur. Güney blot gibi, kuyrukluyıldız tahlil bütün kas dokusu homojenattan hücre türüne özgü bilgi vermemektedir. TÜNEL yöntemiyle için başka bir alternatif, tek kordonlu DNA 25,33,41 karşı veya DNA hasarına ve hücre ölümü yolları (örneğin, p53, H2AX ve Kaspaz) 13,17,22,40 katılmak proteinlerine karşı antikorlar kullanılarak immunohistokimyasal olup. Bu gibi antikor bazlı yöntemler, yüksek bir sinyal-arka oranını elde etmek için antikorların tam karakterizasyon ve mükemmel antikor özelliklerini gerektirir. Hatta zaman spectüpte antikorlar antijen alma prosedürleri 34,35 ile hedef proteinin denatürasyon gerektirebilir, mevcuttur. Burada tartışmak gibi, kabul edilemeyecek kadar yüksek otofloresans kas dokusu sonuçlarında antijen alma. Alternatif yöntemlerin aksine, TUNEL basit pozitif ve negatif kontroller, iyi doku penetrasyonu antijeni alma gerektirmez ve hücresel düzey çözünürlük ile test edilebilir bir yüksek sinyal ve düşük arka plan, mükemmel özgüllük ile DNA hasarı algılama ulaşır. Alternatif yöntemler, tipik olarak gece boyunca inkubasyon gerek duyması karşısında ek olarak, TÜNEL metodu, işlemin tamamlanması için yaklaşık 4 saat sürer.
Biz Hsieh-Li ve arkadaşları 16 tarafından oluşturulan spinal müsküler atrofi (SMA) 10 bir fare modelinde iskelet kas hücresi ölümünü incelemek. Kas hücreleri apoptotik ölçmek için, farklı Skele genelinde sağlam çalışır doku hazırlanması, boyama ve kantitatif bir yöntem geliştirdikFarelerde farklı gelişimsel zaman noktalarında tal kas grupları. Biz piyasada mevcut TÜNEL-etiketleme kiti ve ticari olarak satılan görüntü analiz yazılımı kullanmak. Biz de başarıyla omurilik 10 immunofluorescent boyama birlikte TÜNEL tahlili kullandık.
Burada tarif edilen yöntemler, iskelet kası, doku patolojisi, hastalığın mekanizmaları, yaşlanmanın mekanizmasını ve gelişim (uygulama öncesi ve sonrası), hücre ölümünü değerlendirmek isteyen araştırmacılar için yararlıdır. TÜNEL tekniği hücrelerinin sadece bir alt grubu, etkilenen ve hücresel düzeyde çözünürlüğü gereklidir modeli sistemlerinde DNA hasarı tamir ve hücre ölümünün çalışmalar için özellikle yararlıdır.
Bu video diseksiyon, doku işleme, kesit ve fare iskelet kası flüoresan bazlı TÜNEL etiketleme tarif etmektedir. Aynı zamanda, yarı otomatik TÜNEL sinyal sayımı için bir yöntem tarif etmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Bu protokol açıklanan tüm hayvan prosedürleri Sağlık 26 National Institutes Laboratuvar Hayvanları Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu önerileri doğrultusunda gerçekleştirilmiştir. protokol (MO13M391) Johns Hopkins Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır.
1. Yenidoğan Fare Kurban, Diseksiyon ve Fiksasyon
- CO 2 inhalasyon yoluyla bir yenidoğan fare Kurban.
- Hemen diz üstünde hindlimb kesti. Yaklaşık doğum sonrası güne kadar 7, bacak kemikleri bir kriostat sonradan bölüm büyük laboratuvar makas veya keskin bıçak ile kesmek için yeterince yumuşak ve.
- 15 ml'lik bir tüp içinde, fosfat tamponlu salin (PBS) içinde buz gibi soğuk% 4 paraformaldehit, 10 ml hindlimb yerleştirin.
- Daldırma 4 ° C'de 4-24 saat paraformaldehid hindlimb düzeltmek. Embriyonik doku sadece birkaç saat gerektirirtespitin s.
- Bu TÜNEL deneyi verimliliği azaltabilir gibi, 24 saat daha uzun tespit kaçının.
- Sukroz çözeltisi içinde daldırarak hindlimb cryoprotect.
- Aynı 15 ml tüp içinde, PBS içinde% 10 sakaroza paraformaldehit değiştirme, 4 ° C'de gece boyunca inkübe edilir.
- PBS içinde% 30 sakroz Change, 4 ° C 'de veya borunun alt arka bacak lavabolar kadar gece boyunca inkübe edilir. Doku sükroz steril olarak filtreden geçirilmiş olması koşuluyla, daha uzun bir süre için% 30 sukroz içinde bırakılabilir.
2. Doku Gömme
- Orta gömme ile etiketlenmiş gömme kalıp yarım doldurun.
- Bir kalıp duvarına mümkün olduğu kadar yakın kesilmiş yüzü, gömülü maddenin üzerine hindlimb yerleştirin. Kalıbın dışına hindlimb yönünü işaretleyin.
- Birkaç arka ayakların göm ve aynı blokta kesti. Ancak, tüm hin sağlamak için önemlidirblokta dlimbs bacak ekseni boyunca seviyeleri eşleşen en bölümleri elde etmek için birbirlerine paralel yönlendirilmiştir.
- Orta gömme arka ayakların örtün. Orta dökerken arka ayaklarında vardiya halinde, künt uçlu forseps veya bir kürdan ile yeniden yönlendirin.
- En az 15 dakika boyunca oda sıcaklığında doku sızmaya gömme orta izin verin.
- Doğrudan kuru buz veya kuru buz üzerinde izopentanın yerleştirin kalıpları orta gömme dondurmak için. Her zaman kalıpları seviyede tutmak ve gömülü doku kaymasını önlemek için emin olun.
- Birkaç aya kadar için kesmek için hazır olana kadar -80 ° C'de dondurulmuş kalıpları tutun.
3. Cryosectioning Gömülü Uzuvlar
- -20 ° C'ye ayarlayın kriyostat bölme sıcaklığı, -18 ° C malzeme sıcaklığında; Gerekirse aşağı nesne sıcaklığını ayarlamak.
- En az 30 dakika boyunca kriyostat bölmesinde içindeki doku bloğu dengelenmesi. Doğru blok sıcaklığıerature bölümü kalitesi için çok önemlidir.
- 10 um ya da daha az bir kalınlıkta enine kesitler halinde kesilmiştir. Kalın bölümler tamamen TUNEL reaktif nüfuz olmayacaktır. Anti-roll plaka, bıçak, bıçak ve açısını kullanın (tipik olarak 5 °) kriostat için tavsiye.
- Oda sıcaklığında gelatin- veya vectabond kaplı cam lam üzerine bölümleri toplayın. Kuru buz üzerinde bir slayt kutuya hemen yerleştirin. Kol ulaşılabilecek kriostat yakınına yerleştirilen kuru buz ile ayrı bir kapta slayt kutusunu saklayın.
- 100-200 mikron atlama, ekstremitenin uzun ekseni boyunca enine seri bölümleri kesin. Her seri seviyesinde en az 3 komşu bölümleri toplayın.
Piyasada Satılan Kit kullanarak Arka ayağın Bölüm 4. TÜNEL Testi (oda sıcaklığında tüm adımları belirtilmediği sürece)
- Oda sıcaklığında ve kuru bir gecede ya da hafta sonu bölümleri ile slaytlar çözülme.
- Immersin göre bölümleri rehydrateCoplin kavanoz, 2 x 10 dakika boyunca PBS g kayar. Bir laboratuarda Kuru mümkün olduğunca bölüm etrafında kadar sıvı kaldırarak, silin.
- Permeabilize bölümler
- Olmayan bir proteolitik, saponin tabanlı ticari reaktif veya% 0.5 Tween20 ve% 0.05 PBS Triton X100 birini kullanın.
- Bir nem odasına slayt yerleştirin. Yeterli su kutusunun alt kapağı için eklenen basit bir nem odası, sıkı kapaklı boş bir pipet ucu kutusu.
- Bölümü kapsayacak şekilde slayt üzerine Pipet yeterli reaktif (50 ul yenidoğan fare bacaklarda için yeterlidir). Tekrarlanan ajitasyon slayt kaldırın bölümüne neden olabilir, bölüm doğrudan pipetle etmeyin.
- Künt uçlu forseps kullanarak, reaktif damla yaymak için bölümün üstüne parafilm küçük bir dikdörtgen koyun ve tamamen bölümü kapsamaktadır. Herhangi kabarcıklar parafilmle altında formu, hafifçe kuru, onu kaldırın ve yeniden.
- Permeabili ile slaytlar inkübekapalı bir nem odası içinde 1 saat boyunca yattığı reaktifi. Bölümler slayt kaldırın başlarsanız, permeabilizasyon süresi 30 dakikaya düşürülebilir.
- Bir Coplin kavanoz 2 x 5 dakika PBS slaytlar yıkayın. Parafilm dikdörtgenler yukarıda kalması gerekir ve daha sonra çıkarılır ve atılır edilebilir.
- Bir laboratuar kullanarak, mümkün olduğunca bölümler etrafında kadar sıvı kurutun wipe.
- TdT-aracılı DNA sonu etiketleme
- (50 ul yenidoğan fare bacaklarda için yeterlidir) doku bölümünü kapsayacak şekilde slayt üzerine 1x TdT etiketleme tampon, pipet yeterli etiketleme tampon yapmak için kit talimatlarını izleyin. 5 dakika boyunca nem odasında inkübe edilir. Alternatif olarak, bir coplin kavanoza TdT etiketleme tampon slayt batırmayın.
- TdT etiketleme karışımı yapmak için kit talimatlarını izleyin. Kit, kobalt, magnezyum ve manganez katyonları içerir; manganez katyonu iskelet kası, sinir sistemi Tiss de dahil olmak üzere, çeşitli dokuların üzerinde çalışırdaah karaciğer, deri ve kemik.
- Bir pozitif kontrol için, TdT etiketleme karışımı DNase (kit etiketli "Nukleaz") ekleyin. Seçenek olarak ise, kiti talimatlarına göre, 37 ° C'de 1 saat boyunca nükleaz tamponu içinde DNase ile pozitif bir kontrol bölümü ön-muamele. Çapraz bulaşmayı önlemek için uzak diğer deneysel bölümlerden DNaz çözüm ve DNaz-tedavi bölümleri tutun.
- Bir negatif kontrol için, etiketleme karışımından TdT enzimi atlarsanız.
- Bir laboratuar mümkün olduğunca slayt kadar TdT etiketleme tampon kaldırmak için mendil kullanın. Sürgü (bölüm başına 50 ul) üzerine pipetle TdT etiketleme karışımı, parafilm yeni bir dikdörtgen kapak, ve 1 saat süre ile 37 ° C'de nem odasında inkübe edilir.
- 1x durdurma tamponu yapmak için kit talimatlarını izleyin. Slayt TdT etiketleme karışımını uzaklaştırmak için bir temizleme laboratuar kullanın ve doku kesitinin 200-300 ul durdurma tamponu ekleyin ve 5 dakika boyunca nem odasında inkübe edilir. Al ternatively, bir Coplin kavanoza durdurma tamponu slayt batırmayın.
- PBS slayt 2 x 2 dakika yıkayın. Bir laboratuar mümkün olduğunca slayt kadar PBS kaldırmak için mendil kullanın.
- Floresan etiketleme
- DNA kırıkları en dNTPs etiketlemek için floresan etiketleme çözümü hazırlamak için kit talimatlarını izleyin. Sürgü (bölüm başına 50 ul) üzerine pipetle çözeltisi, parafilm yeni bir dikdörtgen kapak ve 20 dakika boyunca nem odasında inkübe edilir.
- Coplin kavanoza PBS içerisinde 2 dakika süre ile yıkayın kayar. Bir laboratuar slayt mümkün olduğunca PBS kaldırmak için mendil kullanın.
- Slayt üzerine 1 mcg / ml PBS ve pipet Hoechst 33258 nükleer leke seyreltin (100-200 ul bölümünü kapsayacak yeterlidir). 5 dakika boyunca nem odasında inkübe edilir.
- PBS içinde 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
- Antifade floresan montaj medya ile lamel ve tırnak cilası ile kenarları mühür.
- DAPI, FITC, ve Texas Kırmızı filtreleri (veya eşdeğeri) ile geleneksel floresan mikroskop kullanılarak görüntü elde. Etiketleme başarılı oldu ve çekirdekler (bozulmamış veya parçalanmış) etiketli olduğunu doğrulamak için daha yüksek bir büyütme hedefi (20X veya 40X) kullanın. Bir 10X objektif TÜNEL pozitif puncta ölçülmesi için yeterlidir.
- Bir görüntüde kombine üç ayrı yanlış renk kanalları gibi Hoechst boyama, TUNEL boyama ve autofluorescent sinyal görüntüleri toplayın. TÜNEL fluorofor etiketi ve kırmızı filtre, görüntü autofluorescent sinyali, yeşil ise tam tersidir.
- Sonraki eşikleme ve kantitatif için slaytlar arasındaki eşdeğer tüm görüntüleme ayarları saklayın. Her filtre, önceden ayarlanmış ve kayıt pozlama süreleri, kazanç ve binning için (hiçbir binning en iyisi); Otomatik pozlama veya kazanç ayarlarını kullanmayın.
- En iyi niyet etme aralığını çekeceği pozlama ve kazanç ayarları bulmak için deneme-ve-hata kullanıntüm lekeli slaytlar arasında versiteler. Edinilen görüntülerde hiçbir doymuş piksel bu irade önyargı kantitatif olarak, olmadığından emin olun.
- Ilgi tüm kas grubunun görüntüleri çekmek. Bu arada "dikişli" olmak üzere birden çok görüntü gerektirebilir.
6. Görüntü Analizi
- TÜNEL boyama dijital görüntülerini analiz etmek piyasada mevcut görüntü analiz programları kullanın. Ticari yazılım kullanarak analiz burada gösterilmektedir. Alternatif olarak, NIH ücretsiz yazılım ImageJ TÜNEL boyama analiz etmek için kullanılabilir.
- Hematoksilen ve eosin (H & E) ile TÜNEL-lekeli bölümüne bitişik bir bölüm Leke ve geleneksel aydınlık mikroskop ile tam bölüm dijital görüntü almak. Sayısal olarak anatomik yapıları izlemek için bir anatomi atlası 5,18,19 ile birlikte bu H & E görüntüyü kullanın.
- TÜNEL kanalı kapalıyken, elle kullanırken, sayısal alanın anahat izHoechst ve rehberlik için otofloresansı kanalları. Bir maske içine izlenen alana dönüştürmek (seçilen piksel bir dizi analiz edilecek koordinatları).
- TÜNEL kanalı açın. Görüntü analiz programı işlevini eşikleme yoğunluğu kullanarak, tüm otofloresans sinyalini dışlamak için alt eşiğini ayarlayın.
- Çalışma kümesindeki tüm görüntüleri aynı eşik ayarlarını uygulayın. Maskeler içine eşiklenir seçimleri dönüştürün.
- Her görüntü için, kas alanı maskesi ve maske TÜNEL birleştirir. Yeni kombinasyon maskesi sadece takip kas alanı içinde TÜNEL sinyalini temsil edecek.
- Nesnelerin sayısını belirlemek ve takip kas alanı içinde TÜNEL sinyali alan nesne kombinasyon maske maske kantitatif gerçekleştirin. ImageJ Parçacık Analyzer işlevini kullanarak bu gerçekleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Başarılı boyama ile, TÜNEL-pozitif sinyal yoğunluğu eşik ayarlayarak otofloresansı izole etmek yeterince parlak olmalıdır. Düşük büyütme TUNEL-pozitif nesneler iskelet kası (Şekil 1A) olarak parlak düzensiz parçaları görünebilir. Ilgili hücre ölümü türü apoptoz (Şekil 1B) ise, ancak daha yüksek bir büyütmede, klasik apoptotik morfolojisi olan bir TÜNEL pozitif amaçları, takip edilmelidir. pozitif kontrol (DNaz ilave edilir) bölümü (Şekil 1C) tüm dokular arasında düzgün bir şekilde dağılmış, bol TÜNEL pozitif sinyal sergilemelidir. negatif kontrol (reaksiyondan ihmal TdT enzim), düşük yoğunluklu arka plan ve autofluorescent sinyalini sadece (Şekil 1D) boyun eğmek zorundadır. Bu doku, normal apoptosis (Şekil 1A), yüksek bir oranı olarak deri, bütün bacak bölümlerinde bir dahili pozitif kontrol sağlamaktadır.
Kırmızı kanhücreler, kemik ve endotelial hücreleri belirgin bir otofloresan sinyali (Şekil 2) katkıda bulunabilir. O otofloresans sağlamak için hiçbir floresan etiketleme ile ayrı bir kanalda her bölüm pozitif TÜNEL sinyalizasyon için yanlış değildir görüntüye tavsiye edilir. Görüntü yoğunluğu eşik (Şekil 2A, orta sıra) ayarlayarak izole edilebilir, böylece gerçek TÜNEL pozitif sinyal otofloresansı çok daha yüksek yoğunluğa sahip olmalıdır. Alternatif olarak, autofluorescent kanal dijital TÜNEL pozitif bir sinyal (Şekil 2A, alt sıra) elde TÜNEL kanaldan çıkarılır olabilir.
Burada anlatılan TÜNEL etiketleme yöntemi SMA 10 sahip bir fare modelinde, iskelet kası hücre ölümü ölçmek için kullanılmıştır. TÜNEL etiketleme yavru kontroller (Şekil 3A) ile karşılaştırıldığında, 5 günlük SMA fareleri bacak kaslarında apoptotik profil sayısında bir artış gösterir. apoptoz artıştıryöntemi ile ölçülebilir çoklu kas gruplarında (Şekil 3B) 'de istatistiksel olarak önemli farklılıklar gösteren, yukarıda tarif edilen.
Şekil 1: fare bacak kaslarının Temsilcisi TÜNEL etiketleme. (A) tibialis anterior kas, tibia ve cildi gösteren fare hindlimb enine bölümü TÜNEL-etiketli. TA - tibialis anterior, FDL - fleksör digitorum longus, Edl - ekstansör digitorum longus. Yeşil - TÜNEL, mavi - çekirdekler, kırmızı - autofluorescent sinyali. Noktalı çizgiler kantitatif için kas alanları belirginleştiren. Hindlimb kasları bitişik Cilt TÜNEL etiketleme için bir iç pozitif kontrol sağlar. Ölçek çubuğu = 200 mikron. (B) Temsilcisi yüksek büyütme görüntüleri embriyonik TUNEL pozitif yapılar (yeşil) belirlenmesi apoptotik çekirdekleri gibi gün 13 fare iskelet kası. Fayzullina ve Martin 2014 10 modifiye Ölçek çubuğu = 10 um. A ve B. Fare arka bacak (C) enine kesit bir pozitif kontrol olarak hizmet etmek için DNaz muamelesi sonrası TÜNEL etiketli. Çoğu çekirdekler parlak TÜNEL etiketleme var. Ölçü bar = 50 um. (D), C'de gösterildiği gibi, aynı fare hindlimb enine kesit (C bölümü yarı bitişik) bir negatif kontrol olarak hizmet etmek üzere çıkarılmıştır TdT enzimi ile TÜNEL etiketli. Hiç parlak TUNEL pozitif sinyal vardır; kırmızı kanalda sinyal ile ko tarafından tespit edilen sadece yeşil sinyal otofloresansı olduğunu. Ölçek çubuğu = 50 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
2 "fo: içerik width =" 6in "src =" / files / ftp_upload / 52.211 / 52211fig2highres.jpg "width =" 600 "/>
Şekil 2: Doku otofloresansı kabul ve TÜNEL etiketleme analiz ederken kantitatif dışında tutulmalıdır. TÜNEL etiketleme ve otofloresans (A) Fare hindlimb enine kesiti: otofloresansı (kırmızı) kanal ile orijinal görüntü (üst satır), düzeltilmiş eşikleri ile aynı görüntüde (orta sıra), ve aynı görüntünün (alt satır) çıkarılır. Eşik en çok kırmızı kan hücresi ve endotel hücre otofloresans değil boyama artifakı (ok ucu, orta sıra) ortadan kaldırır. Kanal çıkarma da boyama artefaktını (ok ucu, alt sıra) ortadan kaldırır. Yeşil - TÜNEL, kırmızı - otofloresansı, mavi - çekirdekler. Ölçek çubuğu = 100 mikron. Gri dikdörtgen B büyütülmüş alanı çizer. (B) kırmızı otofloresans panelinin yüksek büyütme görüntüsünü A. Kırmızı kan hücreleri ve bazı endotel hücreleri (oklar) ve Tisshem kırmızı hem de yeşil floresan filtreleri vi boyama artefakt (ok başı) autofluoresce. Ölçek çubuğu = 50 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: TÜNEL etiketleme yenidoğan SMA farelerin iskelet kası hücre ölümünü göstermektedir sonrası 5 gün SMA farelerden alt arka bacak kaslarının TÜNEL metodu ile etiketlenmiştir (A), TÜNEL etiketleme SMA farede birden fazla kas grupları birden fazla apoptotik profillerini göstermektedir.. yavru kontrol (sol) ile karşılaştırıldığında, kas (sağda). Yeşil - TÜNEL, mavi - Hoechst (çekirdekleri), kırmızı - otofloresans. Noktalı çizgiler sayısal kas alanları belirginleştiren. TA - tibialis anterior, FDL - fleksör kazmakitorum longus, Edl - ekstansör digitorum longus. Ölçek barlar = 200 mikron. (B) TÜNEL etiketleme kas toplam piksel alanına normalize TÜNEL sinyalinin toplam piksel alanı olarak belirlendi. 5 fareler - Means ± standart hatalar 4 gösterilen, n = edilir. Her kas grubu (tek kuyruklu t-testi) için SMA ve kontrol arasındaki istatistiksel anlamlılık: * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001. Bu rakam Fayzullina ve Martin 2014 10 modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bir yöntem algılamak ve nicel olarak açıklanan fare iskelet kasında DNA hasarı ile ilişkili apoptozu analiz etmek. Prosedür doku hasadı, TUNEL boyama, dijital görüntü alımını ve görüntü analizi içerir. Ortak histolojik malzemeler ve aletler gereklidir, ve özel ticari TÜNEL kiti gereklidir. gerekli temel büyük ekipman öğeleri Kriyostaz, dijital görüntü özelliğine sahip epifluorescent mikroskop ve görüntü analizi için bir bilgisayar sistemi vardır.
deneyci potansiyel tuzaklar farkında olmalıdır. Doku otofloresans floresan görüntüleme önemli bir husustur. Unperfused hayvanlarda, kırmızı kan hücreleri kalan oldukça yüksek autofluorescent sinyalini katkıda bulunacaktır. Endotel hücreleri, aynı zamanda önemli ölçüde otofloresan olabilir. Bu nedenle, bu otofloresans onaylamak için önemlidir TUNEL pozitif sinyal için yanlış değildir. Bu değerlendirme kolayca hiçbir fl olan bir kanalda bir görüntü alarak gerçekleştiriliruorophore, TÜNEL pozitif kanaldan karşılaştırmak ve olası çıkartma için kullanılır. Bu şekilde, flüoresan bazlı TÜNEL metodu arka plan boyaması için bir iç kontrol sunmaz kolorimetrik aydınlık mikroskopi yöntemlere üstündür.
Doku tespit TÜNEL etiketleme başarısı üzerinde önemli etkileri olacaktır. Bu, paraformaldehid tespit süresini en aza indirmek için 24 saat geçmeyecek en iyisidir. Embriyonik ve yenidoğan doku 24 saat daha anlamlı kısa tespit süreleri gerektirir.
TÜNEL etiketleme başarılı olduğunda bu sinyal kolaylıkla resim analiz yazılımı kullanılarak yoğunluk eşik gating izole edilebilir, böylece TÜNEL pozitif sinyal, arka plan otofloresansı çok daha yüksek olmalıdır. Sitrat tamponu 27,35 ısıtma standart protokol kullanılarak antijen alma hafif ısıtma süresi en az (5 dakika) tutulur, düşük TÜNEL sinyalini geliştirmek, ancak bu ön-muamele on olabilirısıtma (95 ° C 'de, örneğin 20 dakika) daha uzun süreler boyunca uzatılması halinde DS TÜNEL sinyalini azaltır. Antijen alma artan TÜNEL sinyali sinyal-gürültü oranı herhangi kazanımlar inkâr edebilir ve böylece arka plan otofloresans ve yanlış pozitif artırmak ve edecek.
TÜNEL sinyal ölçümleri quantitated toplam kas alanına veya niceliksel alan başına çekirdeklerin sayısına ya normalize edilmelidir. TÜNEL apoptotik çekirdekleri ölçer Çünkü, ideal bir normalleşme toplam çekirdekler olacaktır. Ancak, hatta nispeten ince (10 mikron) kas bölümlerinde, myofibers ve çekirdekler o kadar çoktur ve otomatik eşikleme ve partikül ayırma algoritmaları tarafından Hoechst-lekeli çekirdekleri saymak imkansız olduğunu, çok yakından dolu. Manuel sayma da çok emek-yoğun ve yanlıştır. uygun alternatif toplam kas alanına normalleştirmek için olduğunu.
Uygun doku işleme kullanılabilir TÜNEL deneyiteknikler ve pozitif ve negatif kontroller olarak, doku DNA hasarına ve hücre ölümünü tespit etmek için nispeten hızlı, tekrarlanabilir ve kantitatif bir yöntemdir. Bu, etkilenen hücre tiplerini tespit etmek ve terapötik tedavilerin etkisini değerlendirmek için, bir patolojik bir mekanizma olarak apoptozu teyit etmek için kullanılabilir. Bu prosedür SMA, ALS, müsküler distrofi, toksin kaynaklı miyopati dahil iskelet kası hastalığı ve yaralanma alanlarında araştırmacılara değerli ve fizyolojisini egzersiz olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Paraformaldehyde in phosphate buffered saline | Electron Microscopy Sciences | 19202 | For procedures described here, 4% solution was prepared fresh from powder. Paraformaldehyde from any supplier may be used. Prepared formaldehyde solution should be stored at 4 °C and should not be used after its expiration date (up to several months). Paraformaldehyde is a carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling paraformaldehyde. |
| Sucrose | Sigma | S0389 | Used for cryoprotecting tissue before freezing. Sucrose from any supplier may be used. |
| O.C.T. compound | Tissue-Tek | 4583 | Embedding medium for cryosectioning. |
| Cryostat | Leica | CM 3050S | A Leica CM3050S cryostat was used for the preparations described here. Any cryostat capable of cutting 10 μm sections may be used. |
| Glass slides, 25 x 75 x 1 mm | Fisher | 12-552-3 | Slides from any supplier may be used. |
| Gelatin | Sigma | G-9391 | Gelatin is used to promote tissue section adhesion to glass slides. To coat glass slides with gelatin, dissolve 2.75 g gelatin and 0.275 g chrome alum in 500 ml distilled water, warm to 60 °C, dip slides for several seconds, and let dry. Gelatin from any supplier may be used. Alternatively, gelatin-precoated slides may be purchased. |
| Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate (chrome alum) | Sigma | 243361 | Chrome alum is added to gelatin solution to promote tissue adhesion on glass slides. It is a possible carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling chrome alum. |
| Vectabond tissue adhesion reagent | Vector Labs | SP-1800 | Optional substrate for better tissue adhesion to glass slides; gelatin-coated slides may be used instead. |
| Tween20 | Sigma | P9416 | A detergent used to permeabilize tissue. Tween20 from any supplier may be used. |
| Triton X100 | Sigma | T8787 | A detergent used to permeabilize tissue. Triton X100 from any supplier may be used. |
| TACS 2 TdT fluorescein in situ apoptosis detection kit | Trevigen | 4812-30-K | Commercial kit for fluorescence-based TUNEL labeling. |
| DNase/nuclease | Trevigen | 4812-30-K | (included with kit) |
| DNase/nuclease buffer | Trevigen | 4812-30-K | (included with kit) |
| 10x phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Amresco | 780 | Make 1x PBS for washes and dilutions. PBS from any supplier may be used. |
| DNase-free water | Quality Biologicals | 351-029-131 | Water from any supplier may be used. |
| Hoechst 33258 | Sigma | 94403 | Nuclear dye. Any blue fluorescent nuclear dye may be used. As a DNA-binding dye, Hoechst is a suspected carcinogen and should be handled with protective equipment to minimize skin contact. |
| Parafilm M | multiple | 807 | Any other hydrophobic film or cover slip may be used. Available from multiple suppliers. |
| Fluorescent microscope with digital camera | -- | -- | Any fluorescent microscope capable of digitally capturing red, green, and blue fluorescence in separate channels may be used. |
| Vectashield antifade media | Vector Labs | H-1000 | Antifade media from any supplier may be used. |
| glass coverslips, No.1 thickness | Brain Research Labs | 2222-1 | Cover slips from any supplier may be used. The smallest size of 22 x 22 mm is sufficient for neonatal mouse leg sections. |
| Nail polish | Ted Pella | 114-8 | Used to seal coverslips. Nail polish from any supplier (including regular retailers) may be used. Avoid using nail polish with color or additives that may reflect light during fluorescent imaging. |
References
- Ansari, B., Coates, P. J., Greenstein, B. D., Hall, P. A. In situ end-labelling detects DNA strand breaks in apoptosis and other physiological and pathological states. 170 (1), 1-8 (1993).
- Ben-Izhak, O., Laster, Z., Akrish, S., Cohen, G., Nagler, R. M. TUNEL as a tumor marker of tongue cancer. Anticancer Res. 28 (5B), 2981-2986 (2008).
- Colecchia, M., et al. Detection of apoptosis by the TUNEL technique in clinically localised prostatic cancer before and after combined endocrine therapy. 50 (5), 384-388 (1997).
- Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Mol. Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).
- Delaurier, A., et al. The Mouse Limb Anatomy Atlas: an interactive 3D tool for studying embryonic limb patterning. 8, 83 (2008).
- Torres, C., Munell, F., Ferrer, I., Reventos, J., Macaya, A. Identification of necrotic cell death by the TUNEL assay in the hypoxic-ischemic neonatal rat brain. Neurosci. Lett. 230 (1), 1-4 (1997).
- Didenko, V. V. In Situ Detection of DNA Damage : Methods and Protocols. , Humana Press. 978-970 (2002).
- Edelman, J. C., Edelman, P. M., Kniggee, K. M., Schwartz, I. L. Isolation of skeletal muscle nuclei. J. Cell Biol. 27 (2), 365-378 (1965).
- Facchinetti, A., Tessarollo, L., Mazzocchi, M., Kingston, R., Collavo, D., Biasi, G. An improved method for the detection of DNA fragmentation. J. Immunol. Methods. 136 (1), 125-131 (1991).
- Fayzullina, S., Martin, L. J. Skeletal muscle DNA damage precedes spinal motor neuron DNA damage in a mouse model of spinal muscular atrophy (SMA). PLoS.One. 9 (3), e93329 (2014).
- Ferrer, I., et al. Naturally occurring cell death in the developing cerebral cortex of the rat. Evidence of apoptosis-associated internucleosomal DNA fragmentation. Neurosci. Lett. 182 (1), 77-79 (1994).
- Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J. Cell Biol. 119 (3), 493-501 (1992).
- Gown, A. M., Willingham, M. C. Improved detection of apoptotic cells in archival paraffin sections: immunohistochemistry using antibodies to cleaved caspase 3. J. Histochem. Cytochem. 50 (4), 449-454 (2002).
- Hara, A., et al. Neuronal apoptosis studied by a sequential TUNEL technique: a method for tract-tracing. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4 (2), 140-146 (1999).
- Harn, H. J., et al. Apoptosis occurs more frequently in intraductal carcinoma than in infiltrating duct carcinoma of human breast cancer and correlates with altered p53 expression: detected by terminal-deoxynucleotidyl-transferase-mediated dUTP-FITC nick end labelling (TUNEL). Histopathology. 31 (6), 534-539 (1997).
- Hsieh-Li, H. M., et al. A mouse model for spinal muscular atrophy. Nat. Genet. 24 (1), 66-70 (2000).
- Huerta, S., Goulet, E. J., Huerta-Yepez, S., Livingston, E. H. Screening and detection of apoptosis. J. Surg. Res. 139 (1), 143-156 (2007).
- Iwaki, T., Yamashita, H., Hayakawa, T. A color atlas of sectional anatomy of the mouse. 1, 1st edn, Braintree Scientific. Japan. (2001).
- Kaufman, M. H. The atlas of mouse development. , 1st edn, Academic Press. London. (1992).
- Koppen, G., Angelis, K. J. Repair of X-ray induced DNA damage measured by the comet assay in roots of Vicia faba. Environ. Mol. Mutagen. 32 (2), 281-285 (1998).
- Kuehl, L. Isolation of skeletal muscle nuclei. Methods Cell Biol. 15, 79-88 (1977).
- Kuo, L. J., Yang, L. X. Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).
- Labat-Moleur, F., et al. TUNEL apoptotic cell detection in tissue sections: critical evaluation and improvement. J. Histochem. Cytochem. 46 (3), 327-334 (1998).
- Modak, S. P., Bollum, F. J. Detection and measurement of single-strand breaks in nuclear DNA in fixed lens sections. Exp. Cell Res. 75 (2), 307-313 (1972).
- Naruse, I., Keino, H., Kawarada, Y. Antibody against single-stranded DNA detects both programmed cell death and drug-induced apoptosis. Histochemistry. 101 (1), 73-78 (1994).
- National Research Council (US) Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th edn, National Research Council. Washington, D.C.. (2011).
- Negoescu, A., et al. In situ apoptotic cell labeling by the TUNEL method: improvement and evaluation on cell preparations). J. Histochem. Cytochem. 44 (9), 959-968 (1996).
- Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 123 (1), 291-298 (1984).
- Phanithi, P. B., Yoshida, Y., Santana, A., Su, M., Kawamura, S., Yasui, N. Mild hypothermia mitigates post-ischemic neuronal death following focal cerebral ischemia in rat brain: immunohistochemical study of Fas, caspase-3 and TUNEL. Neuropathology. 20 (4), 273-282 (2000).
- Portera-Cailliau, C., Price, D. L., Martin, L. J. Excitotoxic neuronal death in the immature brain is an apoptosis-necrosis morphological continuum. J. Comp Neurol. 378 (1), 70-87 (1997).
- Portera-Cailliau, C., Price, D. L., Martin, L. J. Non-NMDA and NMDA receptor-mediated excitotoxic neuronal deaths in adult brain are morphologically distinct: further evidence for an apoptosis-necrosis continuum. J. Comp Neurol. 378 (1), 88-104 (1997).
- Ravi, D., Ramadas, K., Mathew, B. S., Nalinakumari, K. R., Nair, M. K., Pillai, M. R. De novo programmed cell death in oral cancer. Histopathology. 34 (3), 241-249 (1999).
- Sakaki, T., Kohmura, E., Kishiguchi, T., Yuguchi, T., Yamashita, T., Hayakawa, T. Loss and apoptosis of smooth muscle cells in intracranial aneurysms. Studies with in situ DNA end labeling and antibody against single-stranded DNA. Acta Neurochir.(Wien). 139 (5), 469-474 (1997).
- Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: past, present, and future. J. Histochem. Cytochem. 45 (3), 327-343 (1997).
- Shi, S. R., Imam, S. A., Young, L., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry under the influence of pH using monoclonal antibodies. J. Histochem. Cytochem. 43 (2), 193-201 (1995).
- Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp. Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).
- Sirvent, J. J., Aguilar, M. C., Olona, M., Pelegri, A., Blazquez, S., Gutierrez, C. Prognostic value of apoptosis in breast cancer pT1-pT2). A TUNEL, p53, bcl-2, bag-1 and Bax immunohistochemical study. Histol.Histopathol. 19 (3), 759-770 (2004).
- Skyrlas, A., Hantschke, M., Passa, V., Gaitanis, G., Malamou-Mitsi, V., Bassukas, I. D. Expression of apoptosis-inducing factor (AIF) in keratoacanthomas and squamous cell carcinomas of the skin. Exp. Dermatol. 20 (8), 674-676 (2011).
- Smith, M. D., Weedon, H., Papangelis, V., Walker, J., Roberts-Thomson, P. J., Ahern, M. J. Apoptosis in the rheumatoid arthritis synovial membrane: modulation by disease-modifying anti-rheumatic drug treatment. Rheumatology.(Oxford). 49 (5), 862-875 (2010).
- Stadelmann, C., Lassmann, H. Detection of apoptosis in tissue sections). Cell Tissue Res. 301 (1), 19-31 (2000).
- Schans, G. P., van Loon, A. A., Groenendijk, R. H., Baan, R. A. Detection of DNA damage in cells exposed to ionizing radiation by use of anti-single-stranded DNA monoclonal antibody. Int. J. Radiat. Biol. 55 (5), 747-760 (1989).
- Watanabe, I., et al. Detection of apoptotic cells in human colorectal cancer by two different in situ methods: antibody against single-stranded DNA and terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end-labeling (TUNEL) methods. Jpn. J. Cancer Res. 90 (2), 188-193 (1999).
- Watanabe, T., et al. Apoptosis signal-regulating kinase 1 is involved not only in apoptosis but also in non-apoptotic cardiomyocyte death. Biochem. Biophys. Res. Commun. 333 (2), 562-567 (2005).
- Yaoita, H., Ogawa, K., Maehara, K., Maruyama, Y. Attenuation of ischemia/reperfusion injury in rats by a caspase inhibitor. Circulation. 97 (3), 276-281 (1998).
