Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Detektion och analys av DNA-skador i Mouse skelettmuskulatur Published: December 16, 2014 doi: 10.3791/52211
Automatic Translation
1, 1
1Division of Neuropathology, Department of Pathology, Pathobiology Graduate Program, Johns Hopkins School of Medicine

Introduction

Terminal deoxinukleotidyltransferas (TdT) dUTP nick end märkning (TUNEL) är processen att använda TdT enzymet att fästa dUTP till 3 'ändarna av dubbel och singel DNA bryter 12,23. Tunel metod för detektion av apoptos och DNA-skador rapporterades först över 20 år sedan av Gavrieli et al. 1,12,24. Det har sedan utvärderats och optimeras i olika vävnadspreparat 7,23,27,40. TUNEL har använts för att studera ischemi-inducerad celldöd av neuroner 6,14,29 och kardiomyocyter 43,44, excitotoxisk neuronal celldöd 30,31, och som en biomarkör i artrit behandling 39. Det har också använts som en prognostisk faktor och tumörcellsmarkör i olika humana cancrar 2,3,15,32,37,38,42.

Alternativa metoder finns för DNA-skador och celldöd upptäckt, men de har tekniska utmaningar och varningar. Southern blotting kan användas för att quantify DNA-skador i hela vävnads lysat 7,9-11, men denna metod ger inte cellulär nivå upplösning och är svår att kvantifiera. Kometen analysen är en alternativ cellbaserad metod som kräver utvinna bevarade kärnor från celler 4,20,28,36. Även kometen analysen fungerar bra på odlade isolerade celler, är det mycket svårare att framställa intakta kärnor från skelettmuskelvävnaden 8,21. Som med Southern blot, inte kometen analysen inte ger celltyp-specifik information från en hel muskelvävnad homogenatet. Ett annat alternativ till TUNEL-metoden är immunohistokemi med användning av antikroppar mot enkelsträngat DNA 25,33,41 eller mot proteiner som deltar i DNA-skada respons och vägar med celldöd (t.ex. p53, H2AX och kaspaser) 13,17,22,40. Sådana antikroppsbaserade metoder kräver noggrann karakterisering av antikroppar och utmärkt antikroppspecificitet för att ge en hög signal-till-bakgrundsförhållande. Även när specIFIC antikroppar finns, de kan kräva denaturering av målproteinet genom antigen hämtning förfaranden 34,35. När vi diskuterar här, antigenåtervinning i muskulatur leder oacceptabelt hög autofluorescens. Till skillnad från de alternativa metoder, TUNEL uppnår DNA-skador detektering med en hög signal och låg bakgrund, utmärkt specificitet som kan testas med enkla positiva och negativa kontroller, god vävnadspenetration som inte kräver antigenåtervinning och cellulär nivå upplösning. Dessutom tar TUNEL metoden ca 4 timmar att slutföra, medan alternativa metoder kräver normalt över natten inkubationer.

Vi studerar skelettmuskulaturen celldöd i en musmodell av spinal muskelatrofi (SMA) 10 som genererades av Hsieh-Li och kollegor 16. För att kvantifiera apoptotiska celler i muskeln, har vi utvecklat en metod för beredning vävnad, färgning, och kvantifiering som fungerar robust över olika Skeletal muskelgrupper under olika utvecklings tidpunkter på möss. Vi använder en kommersiellt tillgänglig TUNEL-märkning kit och kommersiellt tillgängliga bildanalys mjukvara. Vi har också framgångsrikt använt TUNEL analys i kombination med immunofluorescerande färgning i ryggmärgen 10.

De metoder som beskrivs här är användbara för utredare som vill bedöma vävnadspatologi, sjukdomsmekanismer, mekanismer för åldrande och utvecklande (pre- och postnatal) celldöd i skelettmuskulaturen. Tunel tekniken är särskilt användbar för studier av DNA-skador och reparation och celldöd i modellsystem där endast en delmängd av celler påverkas och cellnivå upplösningen är nödvändigt.

Denna video beskriver dissektion, vävnadsbehandling, snittning, och fluorescens-baserade TUNEL märkning av musen skelettmuskel. Den beskriver även ett förfarande för halvautomatiserad TUNEL signal kvantifiering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OBS: Alla djurförsök som beskrivs i detta protokoll har genomförts i enlighet med rekommendationerna i Guide för skötsel och användning av försöksdjur i National Institutes of Health 26. Protokollet (MO13M391) godkändes av Johns Hopkins University Djurvård och användning kommittén.

1. Neonatal mus Sacrifice, Dissection och Fixering

  1. Offra en neonatal mus med CO 2 inandning.
  2. Omedelbart stänga av bakbenen ovanför knät. Tills ungefär postnatal dag 7, de ben ben är mjuka nog att skära igenom med stora laboratorie sax eller vass kniv och därefter avsnitt på en kryostat.
  3. Placera bakbenet i 10 ml iskall 4% paraformaldehyd i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i en 15 ml tub.
  4. Nedsänkning fixera bakbenen i paraformaldehyd under 4-24 timmar vid 4 ° C. Embryonal vävnad kräver endast flera timmars fixering.
    1. Undvik fixering längre än 24 timmar, eftersom detta kan minska TUNEL analyseffektivitet.
  5. Cryoprotect den bakdelen genom nedsänkning i sackaroslösning.
    1. Ändra paraformaldehyd till 10% sackaros i PBS i samma 15 ml rör, inkubera över natten vid 4 ° C.
    2. Ändra till 30% sackaros i PBS, inkubera över natten vid 4 ° C eller tills bakbenen sjunker till botten av röret. Vävnad kan lämnas kvar i 30% sackaros under en längre period, under förutsättning att sackaros har varit sterilfiltrerad.

2. Vävnads Inbäddning

  1. Fyll en märkt bädda form halvvägs med inbäddning medium.
  2. Placera bakben ovanpå inbäddningsmediet, med den skurna sidan så nära som möjligt till en vägg hos formen. Märk orienteringen av bakbenen på utsidan av formen.
    1. Bädda flera bakben och skär i samma kvarter. Det är dock viktigt att se till att alla hindlimbs i blocket är orienterade parallellt med varandra för att få avsnitten på att matcha nivåer längs axeln av lemmen.
  3. Täck bakben med inbäddningsmedium. Om bakben skiftar medan man häller mediet, omorientera dem med trubbiga spets pincett eller en tandpetare.
  4. Tillåt inbäddningsmedium att infiltrera vävnaden vid rumstemperatur i minst 15 minuter.
  5. Placera formar direkt på torr is eller i isopentan på torris att frysa inbäddningsmedium. Se till att hålla formarna nivån hela tiden och undvika förskjutning av den inbäddade vävnaden.
  6. Håll frysta formar vid -80 ° C tills den ska skära, i upp till flera månader.

3. cryosectioning Embedded Lemmarna

  1. Ställ kryostat kammartemperaturen till -20 ° C, objekttemperatur till -18 ° C; justera objekttemperatur ner efter behov.
  2. Jämvikta vävnadsblocket inuti kryostaten kammare under minst 30 minuter. Korrekta blocket tempratur är avgörande för avsnitt kvalitet.
  3. Skär tvärsektioner med en tjocklek på 10 nm eller mindre. Tjockare sektioner kommer inte helt penetreras av Tunel reagens. Använd snittsträckarplatta, blad och bladvinkeln (vanligtvis 5 °) rekommenderas för kryostaten.
  4. Samla sektioner Onto gelatin- eller vectabond-belagda objektglas vid rumstemperatur. Placera omedelbart in en bild ruta på torris. Håll skjutlådan i en separat behållare med torris placeras nära kryostaten inom räckhåll.
    1. Skär tvärseriesektioner genom den långa axeln av lemmen, hoppar 100-200 um. Samla minst 3 intilliggande sektioner vid varje serienivå.

4. TUNEL-analys bakdelen avsnitt med ett kommersiellt tillgängligt kit (alla steg vid rumstemperatur om inte noterat)

  1. Tina diabilder med sektioner till rumstemperatur och torka över natten eller under helgen.
  2. Rehydrera avsnitt från immersing glasen i PBS under 2 x 10 min i ett Coplin-kärl. Torka med en lab torka, ta bort så mycket vätska runt avsnittet som möjligt.
  3. Permeabilize sektioner
    1. Använd antingen en icke-proteolytiska, saponin-baserade kommersiella reagens eller 0,5% Tween20 och 0,05% Triton X100 i PBS.
    2. Placera glida in en fuktkammare. En enkel fuktighetskammare är en tom pipettspets låda med ett tätt lock, med bara tillräckligt med vatten tillsätts för att täcka botten av lådan.
    3. Pipett tillräckligt reagens på bilden för att täcka avsnittet (50 pl är tillräckligt för neonatal mus lemmar). Inte pipett direkt på avsnittet, som upprepad omskakning kan orsaka avsnittet för att lyfta från glaset.
    4. Använda trubbig spets pincett, placera en liten rektangel av parafilm ovanpå avsnitt för att sprida ut droppe reagens och helt täcka avsnittet. Om några bubblor bildas under parafilm, lyft försiktigt bort det, torrt, och återanvända.
    5. Inkubera objektglasen med permeabilisation reagens för en timme i en täckt fuktkammare. Om avsnitten börjar lyfta från bilden, kan permeabilization tiden minskas till 30 minuter.
    6. Tvätta objektglasen i PBS i en Coplin burk 2 x 5 min. Parafilm rektanglarna bör flyter upp och kan sedan avlägsnas och kasseras.
    7. Med hjälp av en lab torka, torka så mycket vätska runt avsnitten som möjligt.
  4. TdT-förmedlad DNA-paus märkning
    1. Följ kit instruktioner för att göra 1x TdT märkning buffert, pipett tillräckligt buffert märkning på bilden för att täcka vävnadssnitt (50 pl är tillräckligt för neonatal mus lemmar). Inkubera i fuktighetskammaren för 5 minuter. Alternativt, sänk bilden i TdT märkning buffert i ett coplinkärlet.
    2. Följ kit instruktioner för att göra TdT märkning mix. Satsen innehåller kobolt, magnesium, och mangankatjoner; mangankatjonen fungerar bra på en mängd olika vävnader, inkluderande skelettmuskler, nervsystemet Tissderingar, lever, hud och ben.
    3. För en positiv kontroll, lägg DNas (märkt "nukleas" i satsen) om märkning mix TdT. Alternativt förbehandla en positiv styrsektion med DNas i nukleas-buffert under 1 h vid 37 ° C, enligt kit instruktioner. Håll DNas lösning och DNas-behandlade sektioner ifrån andra experimentella sektioner för att förhindra korskontaminering.
    4. För en negativ kontroll, utelämnar TdT enzym från mixen märkning.
    5. Använd ett labb torka för att ta bort så mycket TdT märkningsbuffert från bilden som möjligt. Pipett TdT märkningsblandning på objektglaset (50 | il per sektion), täck med en ny rektangel av parafilm, och inkubera i fuktkammare vid 37 ° C under 1 h.
    6. Följ kit instruktioner för att göra 1x stoppbuffert. Använd ett labb torka ta bort TdT märkning mix från bilden och lägga 200-300 l stoppbuffert för att täcka vävnadssnittet och inkubera i fuktkammare i 5 min. Al nativt, sänk bilden i stoppbuffert i en Coplin burk.
    7. Tvätta sliden 2 x 2 min i PBS. Använd ett labb torka för att ta bort så mycket PBS från bilden som möjligt.
  5. Fluorescerande märkning
    1. Följ kit instruktioner att förbereda fluorescein märkningslösning för att märka dNTP vid DNA-brott. Pipett lösning på objektglaset (50 ^ per avsnitt), täck med en ny rektangel av parafilm och inkubera i fuktkammare i 20 minuter.
    2. Tvätta objekt under 2 min i PBS i ett Coplin-kärl. Använd ett labb torka för att ta bort så mycket PBS som möjligt från bilden.
    3. Späd Hoechst 33258 kärn fläcken till 1 pg / ml i PBS och pipett på objektglaset (100-200 pl är tillräcklig för att täcka avsnitt). Inkubera i fuktighetskammaren för 5 minuter.
    4. Tvätta 3x under 5 min i PBS.
    5. Täckglas med antifade fluorescens monterings medier och försegla kanterna med nagellack.
jove_title "> 5. Digital Image Acquisition

  1. Förvärva bilder med hjälp av en konventionell fluorescerande mikroskop med DAPI, FITC och Texas Red filter (eller motsvarande). Använd en högre förstoring mål (20X eller 40X) för att kontrollera att märkningen var framgångsrik och kärnor (intakta eller fragmente) märktes. En 10X mål är tillräckligt för kvantifiering av TUNEL-positiva puncta.
  2. Samla bilder av Hoechst färgning, TUNEL färgning och autofluorescent signal som tre separata falskt färgkanaler kombineras i en bild. Om Tunel fluoroforen etiketten är grön, bild autofluorescent signal i rött filter, och vice versa.
    1. Håll alla avbildningsinställningar likvärdiga mellan bilderna för efterföljande tröskel och kvantifiering. För varje filter, förinställda och spela exponeringstider, gain, och binning (ingen binning är bäst); Använd inte automatiska exponeringsinställningar eller gain.
    2. Använd trial-and-error för att hitta exponering och förstärkningsinställningar som bäst fångar olika intensitet i alla färgade diabilder. Se till att det inte finns några mättade pixlar i de förvärvade bilderna, eftersom detta kommer partiskhet kvantifiering.
  3. Ta bilder av hela muskelgruppen av intresse. Detta kan kräva flera bilder som ska "sys" ihop.

6. Bildanalys

  1. Använd kommersiellt tillgängliga bildanalys program för att analysera digitala bilder av TUNEL färgning. Analys med hjälp av kommersiell programvara visas här. Alternativt kan den fria programvaran ImageJ från NIH användas för att analysera TUNEL färgning.
  2. Stain en sektion intill den TUNEL-färgade sektionen med hematoxylin och eosin (H & E) och ta en fullständig sektion digital bild med en konventionell ljusfältsmikroskop. Använd denna H & E bild i kombination med en anatomi atlas 5,18,19 att spåra de anatomiska strukturerna som ska kvantifieras.
  3. Med Tunel kanalen avstängd, spåra manuellt konturerna av den yta som skall kvantifieras med hjälpHoechst och autofluorescens kanaler för vägledning. Konvertera den spårade området till en mask (en uppsättning utvalda pixelkoordinater som skall analyseras).
  4. Slå på Tunel-kanalen. Använda intensiteten tröskelfunktionen i bildanalysprogram, ställ in lägre tröskel för att utesluta all autofluorescens signal.
  5. Applicera samma tröskelinställningar för alla bilder i studien uppsättningen. Konvertera tröskel markeringar i masker.
  6. För varje bild, kombinera muskelområdet masken och Tunel masken. Den nya kombinationen mask kommer att representera TUNEL signalen inom spårade muskeln enda område.
  7. Utför mask kvantifiering på kombinationen mask för att bestämma antal objekt och objekt område av TUNEL signalen inom den spårade muskelområdet. Utför detta med Particle Analyzer funktion i ImageJ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Med framgångsrik färgning, bör TUNEL-positiva signalen vara tillräckligt ljust för att isolera från autofluorescens genom att ställa trösklar intensitet. TUNEL-positiva objekt på låg förstoring kan visas som ljusa oregelbundna skärvor i skelettmuskulaturen (Figur 1A). Men vid högre förstoring, bör observeras några TUNEL-positiva objekt med den klassiska apoptotiska morfologi, om typ celldöd inblandade är apoptos (Figur 1B). Den positiva kontrollen (DNas lagt) bör uppvisa riklig TUNEL-positiv signal, fördelade jämnt över alla vävnader i avsnittet (Figur 1C). Den negativa kontrollen (TdT enzym utelämnats från reaktion) ska ge lågintensiv bakgrund och autofluorescent signal enbart (Figur 1D). Hud erbjuder en intern positiv kontroll i hela bensektioner, eftersom denna vävnad har en hög hastighet av normal apoptos (Figur 1A).

Röda blodceller, ben, och endotelceller kan bidra signifikant autofluorescent signal (Figur 2). Det är tillrådligt att bilden varje avsnitt i en separat kanal utan fluorescerande märkning för att säkerställa att autofluorescens inte misstas för en positiv TUNEL signalering. Sann TUNEL-positiv signal bör ha mycket högre intensitet än autofluorescens, så att den kan isoleras genom att ställa bildintensitetströsklar (Figur 2A, mellersta raden). Alternativt kan autofluorescent kanalen digitalt subtraheras från Tunel kanalen för att ge TUNEL-positiv signal (Figur 2A, nedersta raden).

Märkningen metoden TUNEL beskrivs här har använts för att kvantifiera skelettmuskulaturen celldöd i en musmodell av SMA 10. TUNEL märkningen visar en ökning av antalet apoptotiska profiler i benmusklerna från 5 dagar gamla SMA möss, jämfört med kull kontroller (Figur 3A). Ökningen av apoptos ärkvantifierbar genom metoden beskriven ovan, vilket tyder på statistiskt signifikanta skillnader i flera muskelgrupper (figur 3B).

Figur 1
Figur 1: Representant TUNEL märkning av mus bakbenen muskler. (A) TUNEL-märkta tvärsektion av mus bakben visande tibialis anterior muskeln, skenben, och hud. TA - tibialis anterior, FDL - flexor digitorum longus, Edl - extensor digitorum longus. Grön - Tunel, blå - kärnor, röd - autofluorescent signal. Prickade linjer avgränsa muskelområden för kvantifiering. Hud angränsande bakben muskler ger en intern positiv kontroll för TUNEL märkning. Skala bar = 200 nm. (B) Representativa hög förstoring bilder identifierar Tunel-positiva strukturer (grön) i embryonala dag 13 mus skelettmuskel som apoptotiska kärnor. Skalstreck = 10 | im. A och B modifierad från Fayzullina och Martin 2014 10. (C) Tvärsnitt av mus bakbens TUNEL-märkta efter DNas-behandling för att tjäna som en positiv kontroll. De flesta kärnor har ljus TUNEL märkning. Skalstreck = 50 | im. (D) Tvärgående sektion av samma mus bakbenen såsom visas i C (halv intill sektionen i C) TUNEL-märkta med TdT enzym utelämnad för att tjäna som en negativ kontroll. Det finns ingen ljus TUNEL-positiv signal; den enda gröna signalen är autofluorescens som detekteras genom colocalization med signalen i den röda kanalen. Skala bar = 50 nm. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.

2 "fo: innehålls width =" 6in "src =" / filer / ftp_upload / 52211 / 52211fig2highres.jpg "width =" 600 "/>
Figur 2: Vävnads autofluorescens måste beaktas och undantas från kvantifiering vid analys TUNEL märkning. (A) Mus bakbens tvärsnitt med TUNEL märkning och autofluorescens: ursprungliga bilden (övre raden), samma bild med justerade trösklar (mellersta raden), och samma bild med autofluorescens (röd) kanal subtraheras (nedersta raden). Tröskel eliminerar de flesta röda blodkroppar och endotelceller autofluorescens men inte färgnings artefakt (pilspets, mellersta raden). Kanal subtraktion eliminerar också färgning artefakt (pilspets, nedersta raden). Grön - Tunel, röd - autofluorescens, blå - kärnor. Skalstreck = 100 | im. Grå rektangel skisserar område förstorat i B. (B) Högre förstoring bild av röda autofluorescens panel i A. Röda blodkroppar och vissa endotelceller (pilar) och en Tissue färgning artefakt (pilspets) autofluoresce i både röda och gröna fluorescens filter. Skala bar = 50 nm. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3: TUNEL märkning visar celldöd i skelettmuskulaturen av neonatala SMA möss Lägre bakbenen muskler från SMA möss vid postnatal dag 5 märktes med TUNEL metoden (A) TUNEL märkning visar flera apoptotiska profiler i flera muskelgrupper i SMA musen.. muskel (höger) jämfört med samma kull kontroll (vänster). Grön - Tunel, blå - Hoechst (kärnor), röd - autofluorescens. Prickade linjer avgränsa de muskelområdena kvantifierade. TA - tibialis anterior, FDL - flexor grävaitorum longus, Edl - extensor digitorum longus. Skala barer = 200 nm. (B) TUNEL märkning kvantifierades det totala pixelområde TUNEL signal normaliserad till total pixelområde muskler. Medel ± standardfel visas, n = 4-5 möss. Statistisk signifikans mellan SMA och kontroll för varje muskelgrupp (en-tailed t-test): * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001. Denna siffra har modifierats Fayzullina och Martin 2014 10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En metod för att upptäcka och kvantitativt analysera DNA-skador-associerad apoptos i mus skelettmuskel beskrivs. Förfarandet omfattar vävnads skörd, TUNEL färgning, digital bild förvärv, och bildanalys. Det behövs gemensamma histologiska förnödenheter och verktyg, och en speciell kommersiella Tunel kit är nödvändigt. De väsentliga stora utrustnings saker som behövs är en kryostat, epifluorescent mikroskop med digital bildfunktion samt datasystem för bildanalys.

Försöksledaren bör vara medvetna om potentiella fallgropar. Vävnads autofluorescens är ett stort problem i fluorescens avbildning. I unperfused djur, kommer resterande röda blodkroppar bidrar ganska hög autofluorescent signal. Endotelceller kan också betydligt autofluorescerande. Därför är det viktigt att bekräfta att autofluorescens inte misstas för TUNEL-positiv signal. Denna bedömning är enkelt genom att ta en bild i en kanal utan fluorophore, som skall användas för jämförelse och eventuell subtraktion från TUNEL-positiva kanal. På detta sätt är fluorescensbaserade TUNEL metoden överlägsen kolorimetriska bright mikroskopimetoder som inte erbjuder en intern kontroll för bakgrundsfärgning.

Vävnads fixering kommer att ha en betydande inverkan på framgången för TUNEL märkning. Det är bäst att minimera fixering tid i paraformaldehyd, inte överstiga 24 timmar. Embryonala och neonatal vävnad kräver fixeringstider betydligt kortare än 24 timmar.

När TUNEL märkning är framgångsrik, bör TUNEL-positiv signal vara mycket högre än bakgrunds autofluorescens, så att signalen kan lätt isoleras genom intensitetströskelgrind använder bildanalys mjukvara. Antigenåtervinning med standardprotokollet för uppvärmning i citratbuffert 27,35 kan något förbättra låg TUNEL signal om uppvärmningstiden hålls till ett minimum (5 min), men denna förbehandling tiods för att minska TUNEL signal om uppvärmning förlängs under längre perioder (t.ex. 20 minuter vid 95 ° C). Antigenåtervinning kommer att öka bakgrunden autofluorescens och falska positiva, och därmed kan upphäva eventuella vinster i signal-brusförhållande från ökade TUNEL signal.

De signalmätningar TUNEL måste normaliseras antingen till den totala muskelområdet kvantifierades eller till antalet kärnor per area kvantifierades. Eftersom TUNEL mäter apoptotiska kärnor, skulle den ideala normalisering vara total kärnor. Men även i relativt tunna (10 pm) muskelsektioner, de myofibers och kärnorna är så många och packade så tätt, att det är omöjligt att automatiskt räkna Hoechst-färgade kärnor av tröskel och partikelseparationsalgoritmer. Manuell räkning är också mycket arbetskrävande och felaktig. Den genomförbara alternativet är att normalisera till total muskelområdet.

Tunel analys användas med lämplig vävnadsbearbetningtekniker och positiva och negativa kontroller, är en relativt snabb, reproducerbar, kvantitativ metod för att detektera DNA-skada och celldöd i vävnad. Den kan användas för att bekräfta apoptos som en patologisk mekanism för att identifiera drabbade celltyper, och för att bedöma effekten av terapeutiska behandlingar. Detta förfarande kommer att vara av värde för forskare inom områdena skelettmuskulaturen sjukdomar och skador, inklusive SMA, ALS, muskeldystrofi, toxin-inducerad myopati, och träningsfysiologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% Paraformaldehyde in phosphate buffered saline Electron Microscopy Sciences 19202 For procedures described here, 4% solution was prepared fresh from powder. Paraformaldehyde from any supplier may be used. Prepared formaldehyde solution should be stored at 4 °C and should not be used after its expiration date (up to several months). Paraformaldehyde is a carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling paraformaldehyde.
Sucrose Sigma S0389 Used for cryoprotecting tissue before freezing. Sucrose from any supplier may be used.
O.C.T. compound Tissue-Tek 4583 Embedding medium for cryosectioning.
Cryostat Leica CM 3050S A Leica CM3050S cryostat was used for the preparations described here. Any cryostat capable of cutting 10 μm sections may be used.
Glass slides, 25 x 75 x 1 mm Fisher 12-552-3 Slides from any supplier may be used.
Gelatin Sigma G-9391 Gelatin is used to promote tissue section adhesion to glass slides. To coat glass slides with gelatin, dissolve 2.75 g gelatin and 0.275 g chrome alum in 500 ml distilled water, warm to 60 °C, dip slides for several seconds, and let dry. Gelatin from any supplier may be used. Alternatively, gelatin-precoated slides may be purchased.
Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate (chrome alum) Sigma 243361 Chrome alum is added to gelatin solution to promote tissue adhesion on glass slides. It is a possible carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling chrome alum.
Vectabond tissue adhesion reagent Vector Labs SP-1800 Optional substrate for better tissue adhesion to glass slides; gelatin-coated slides may be used instead.
Tween20 Sigma P9416 A detergent used to permeabilize tissue. Tween20 from any supplier may be used.
Triton X100 Sigma T8787 A detergent used to permeabilize tissue. Triton X100 from any supplier may be used.
TACS 2 TdT fluorescein in situ apoptosis detection kit Trevigen 4812-30-K Commercial kit for fluorescence-based TUNEL labeling.
DNase/nuclease Trevigen 4812-30-K (included with kit)
DNase/nuclease buffer Trevigen 4812-30-K (included with kit)
10x phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 Amresco 780 Make 1x PBS for washes and dilutions. PBS from any supplier may be used.
DNase-free water Quality Biologicals 351-029-131 Water from any supplier may be used.
Hoechst 33258 Sigma 94403 Nuclear dye. Any blue fluorescent nuclear dye may be used. As a DNA-binding dye, Hoechst is a suspected carcinogen and should be handled with protective equipment to minimize skin contact.
Parafilm M multiple 807 Any other hydrophobic film or cover slip may be used. Available from multiple suppliers.
Fluorescent microscope with digital camera  --  -- Any fluorescent microscope capable of digitally capturing red, green, and blue fluorescence in separate channels may be used.
Vectashield antifade media Vector Labs H-1000 Antifade media from any supplier may be used.
glass coverslips, No.1 thickness Brain Research Labs 2222-1 Cover slips from any supplier may be used. The smallest size of 22 x 22 mm is sufficient for neonatal mouse leg sections.
Nail polish Ted Pella 114-8 Used to seal coverslips. Nail polish from any supplier (including regular retailers) may be used. Avoid using nail polish with color or additives that may reflect light during fluorescent imaging.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ansari, B., Coates, P. J., Greenstein, B. D., Hall, P. A. In situ end-labelling detects DNA strand breaks in apoptosis and other physiological and pathological states. 170 (1), 1-8 (1993).
  2. Ben-Izhak, O., Laster, Z., Akrish, S., Cohen, G., Nagler, R. M. TUNEL as a tumor marker of tongue cancer. Anticancer Res. 28 (5B), 2981-2986 (2008).
  3. Colecchia, M., et al. Detection of apoptosis by the TUNEL technique in clinically localised prostatic cancer before and after combined endocrine therapy. 50 (5), 384-388 (1997).
  4. Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Mol. Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).
  5. Delaurier, A., et al. The Mouse Limb Anatomy Atlas: an interactive 3D tool for studying embryonic limb patterning. 8, 83 (2008).
  6. Torres, C., Munell, F., Ferrer, I., Reventos, J., Macaya, A. Identification of necrotic cell death by the TUNEL assay in the hypoxic-ischemic neonatal rat brain. Neurosci. Lett. 230 (1), 1-4 (1997).
  7. Didenko, V. V. In Situ Detection of DNA Damage : Methods and Protocols. , Humana Press. 978-970 (2002).
  8. Edelman, J. C., Edelman, P. M., Kniggee, K. M., Schwartz, I. L. Isolation of skeletal muscle nuclei. J. Cell Biol. 27 (2), 365-378 (1965).
  9. Facchinetti, A., Tessarollo, L., Mazzocchi, M., Kingston, R., Collavo, D., Biasi, G. An improved method for the detection of DNA fragmentation. J. Immunol. Methods. 136 (1), 125-131 (1991).
  10. Fayzullina, S., Martin, L. J. Skeletal muscle DNA damage precedes spinal motor neuron DNA damage in a mouse model of spinal muscular atrophy (SMA). PLoS.One. 9 (3), e93329 (2014).
  11. Ferrer, I., et al. Naturally occurring cell death in the developing cerebral cortex of the rat. Evidence of apoptosis-associated internucleosomal DNA fragmentation. Neurosci. Lett. 182 (1), 77-79 (1994).
  12. Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J. Cell Biol. 119 (3), 493-501 (1992).
  13. Gown, A. M., Willingham, M. C. Improved detection of apoptotic cells in archival paraffin sections: immunohistochemistry using antibodies to cleaved caspase 3. J. Histochem. Cytochem. 50 (4), 449-454 (2002).
  14. Hara, A., et al. Neuronal apoptosis studied by a sequential TUNEL technique: a method for tract-tracing. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4 (2), 140-146 (1999).
  15. Harn, H. J., et al. Apoptosis occurs more frequently in intraductal carcinoma than in infiltrating duct carcinoma of human breast cancer and correlates with altered p53 expression: detected by terminal-deoxynucleotidyl-transferase-mediated dUTP-FITC nick end labelling (TUNEL). Histopathology. 31 (6), 534-539 (1997).
  16. Hsieh-Li, H. M., et al. A mouse model for spinal muscular atrophy. Nat. Genet. 24 (1), 66-70 (2000).
  17. Huerta, S., Goulet, E. J., Huerta-Yepez, S., Livingston, E. H. Screening and detection of apoptosis. J. Surg. Res. 139 (1), 143-156 (2007).
  18. Iwaki, T., Yamashita, H., Hayakawa, T. A color atlas of sectional anatomy of the mouse. 1, 1st edn, Braintree Scientific. Japan. (2001).
  19. Kaufman, M. H. The atlas of mouse development. , 1st edn, Academic Press. London. (1992).
  20. Koppen, G., Angelis, K. J. Repair of X-ray induced DNA damage measured by the comet assay in roots of Vicia faba. Environ. Mol. Mutagen. 32 (2), 281-285 (1998).
  21. Kuehl, L. Isolation of skeletal muscle nuclei. Methods Cell Biol. 15, 79-88 (1977).
  22. Kuo, L. J., Yang, L. X. Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).
  23. Labat-Moleur, F., et al. TUNEL apoptotic cell detection in tissue sections: critical evaluation and improvement. J. Histochem. Cytochem. 46 (3), 327-334 (1998).
  24. Modak, S. P., Bollum, F. J. Detection and measurement of single-strand breaks in nuclear DNA in fixed lens sections. Exp. Cell Res. 75 (2), 307-313 (1972).
  25. Naruse, I., Keino, H., Kawarada, Y. Antibody against single-stranded DNA detects both programmed cell death and drug-induced apoptosis. Histochemistry. 101 (1), 73-78 (1994).
  26. National Research Council (US) Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th edn, National Research Council. Washington, D.C.. (2011).
  27. Negoescu, A., et al. In situ apoptotic cell labeling by the TUNEL method: improvement and evaluation on cell preparations). J. Histochem. Cytochem. 44 (9), 959-968 (1996).
  28. Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 123 (1), 291-298 (1984).
  29. Phanithi, P. B., Yoshida, Y., Santana, A., Su, M., Kawamura, S., Yasui, N. Mild hypothermia mitigates post-ischemic neuronal death following focal cerebral ischemia in rat brain: immunohistochemical study of Fas, caspase-3 and TUNEL. Neuropathology. 20 (4), 273-282 (2000).
  30. Portera-Cailliau, C., Price, D. L., Martin, L. J. Excitotoxic neuronal death in the immature brain is an apoptosis-necrosis morphological continuum. J. Comp Neurol. 378 (1), 70-87 (1997).
  31. Portera-Cailliau, C., Price, D. L., Martin, L. J. Non-NMDA and NMDA receptor-mediated excitotoxic neuronal deaths in adult brain are morphologically distinct: further evidence for an apoptosis-necrosis continuum. J. Comp Neurol. 378 (1), 88-104 (1997).
  32. Ravi, D., Ramadas, K., Mathew, B. S., Nalinakumari, K. R., Nair, M. K., Pillai, M. R. De novo programmed cell death in oral cancer. Histopathology. 34 (3), 241-249 (1999).
  33. Sakaki, T., Kohmura, E., Kishiguchi, T., Yuguchi, T., Yamashita, T., Hayakawa, T. Loss and apoptosis of smooth muscle cells in intracranial aneurysms. Studies with in situ DNA end labeling and antibody against single-stranded DNA. Acta Neurochir.(Wien). 139 (5), 469-474 (1997).
  34. Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: past, present, and future. J. Histochem. Cytochem. 45 (3), 327-343 (1997).
  35. Shi, S. R., Imam, S. A., Young, L., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry under the influence of pH using monoclonal antibodies. J. Histochem. Cytochem. 43 (2), 193-201 (1995).
  36. Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp. Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).
  37. Sirvent, J. J., Aguilar, M. C., Olona, M., Pelegri, A., Blazquez, S., Gutierrez, C. Prognostic value of apoptosis in breast cancer pT1-pT2). A TUNEL, p53, bcl-2, bag-1 and Bax immunohistochemical study. Histol.Histopathol. 19 (3), 759-770 (2004).
  38. Skyrlas, A., Hantschke, M., Passa, V., Gaitanis, G., Malamou-Mitsi, V., Bassukas, I. D. Expression of apoptosis-inducing factor (AIF) in keratoacanthomas and squamous cell carcinomas of the skin. Exp. Dermatol. 20 (8), 674-676 (2011).
  39. Smith, M. D., Weedon, H., Papangelis, V., Walker, J., Roberts-Thomson, P. J., Ahern, M. J. Apoptosis in the rheumatoid arthritis synovial membrane: modulation by disease-modifying anti-rheumatic drug treatment. Rheumatology.(Oxford). 49 (5), 862-875 (2010).
  40. Stadelmann, C., Lassmann, H. Detection of apoptosis in tissue sections). Cell Tissue Res. 301 (1), 19-31 (2000).
  41. Schans, G. P., van Loon, A. A., Groenendijk, R. H., Baan, R. A. Detection of DNA damage in cells exposed to ionizing radiation by use of anti-single-stranded DNA monoclonal antibody. Int. J. Radiat. Biol. 55 (5), 747-760 (1989).
  42. Watanabe, I., et al. Detection of apoptotic cells in human colorectal cancer by two different in situ methods: antibody against single-stranded DNA and terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end-labeling (TUNEL) methods. Jpn. J. Cancer Res. 90 (2), 188-193 (1999).
  43. Watanabe, T., et al. Apoptosis signal-regulating kinase 1 is involved not only in apoptosis but also in non-apoptotic cardiomyocyte death. Biochem. Biophys. Res. Commun. 333 (2), 562-567 (2005).
  44. Yaoita, H., Ogawa, K., Maehara, K., Maruyama, Y. Attenuation of ischemia/reperfusion injury in rats by a caspase inhibitor. Circulation. 97 (3), 276-281 (1998).

Tags

Fysiologi TUNEL fluorescens skelettmuskel DNA-skador bildanalys histologi SMA motorneuronsjukdom
Detektion och analys av DNA-skador i Mouse skelettmuskulatur<em&gt; In situ</em&gt; Använda TUNEL metoden
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fayzullina, S., Martin, L. J.… More

Fayzullina, S., Martin, L. J. Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method. J. Vis. Exp. (94), e52211, doi:10.3791/52211 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter