Abstract
Визуализация нейронных проекций полнометражных эмбрионов необходимо получить представление о том, как у млекопитающих развивать нейронных сетей. Здесь мы опишем метод маркировать на месте подмножество спинной ганглий корень (DRG) аксонов прогнозов для оценки их фенотипические характеристики, используя несколько генетически модифицированных линий мышей. В TrkA-положительных нейронов нейроны ноцицептора, предназначенные для передачи сигналов боли. Мы используем мыши линии TrkA taulacZ для обозначения траектории всех TrkA-положительных периферийных аксонов в неповрежденной эмбриона мыши. Мы дополнительно разводить TrkA taulacZ линию на Bax нулевой фон, который, по существу отменяет апоптоза нейронов, с целью оценки роста, связанных с вопросы независимо от возможных последствий генетических манипуляций на выживание нейронов. Впоследствии, генетически модифицированные мыши, представляющие интерес, разводят с TrkA ЦаулACZ / Bax нулевая линия и готовы для исследования с использованием методов, описанных в данном документе. Данная презентация содержит подробную информацию о планах мыши размножения, генотипирование на момент вскрытия, подготовки ткани, окрашивание и очистки, чтобы для визуализации полнометражных аксонов траекторий в целом монтажа подготовки.
Introduction
Установление точного нейронных сетей представляет собой сложный процесс развития необходимы для функциональности нервной системы. Нарушение этого процесса приводит к нейронной дисфункции, который был вовлечен в неврологических заболеваний человека 1-3. Для изучения основополагающих молекулярных механизмов роста аксонов и целевой иннервации у млекопитающих, мы разработали протокол для визуализации аксонов траектории TrkA-выражения сенсорных нейронов, используя комбинацию из двух генетически модифицированных линий мышей.
TrkA является рецептором для фактора роста нервов NGF и функциональный маркер ноцицептивных сенсорных нейронов 4. TrkA высоко экспрессируется в ноцицептивных нейронов во время раннего развития и посредником NGF-зависимое выживание нейронов, роста аксонов, разветвление и целевой иннервации 5-9. У мышей TrkA taulacZ, дикого типа гена TrkA заменен экспрессии taulacZ сassette 10, таким образом, что аксонов морфологии предполагаемых TrkA-позитивных нейронов могут быть визуализированы с помощью β-гал (X-GAL) окрашивания 11. Использование гетерозиготную линию TrkA taulacZ / WT, мы можем рассмотреть факторы, которые могут регулировать или помешать с развитием сенсорных афферентных проекций в естественных условиях.
Кроме того, выражение TrkA отсутствует у гомозиготных мышей TrkA taulacZ / taulacZ, которые, следовательно, могут быть использованы для оценки роста аксонов способствуя механизмов в отсутствие ФРН сигнализации / TrkA. С ноцицептивных нейронов зависит от NGF / TrkA сигнализации не только для роста аксонов, но и для выживания, мы используем другую линию мыши, не имея проапоптотического ген Bax, ингибируют апоптоз в эмбриональных нейронов DRG, спасая их от гибели клеток, что в противном случае наблюдается при отсутствии сигналов TrkA. Вах - / - фон 12 Таким образом, позволяет molecuLAR рассечение пути, непосредственно затрагивающих аксонов 7-9,13-15 роста сигнализации. В TrkA - / -: Вах - / - мышей, DRG нейроны выжить, но сенсорная афферентная иннервация в коже полностью отменена 14,15. Мы можем избирательно активировать сигнальные пути, чтобы определить их соответствующие взносы в развитие аксонов прогнозов. Полезность этого метода является то, что он позволяет оценить изменения в аксонов фенотипов роста, когда различные генетические модификации разводят на TrkA taulacZ / taulacZ: Вах - / - или TrkA taulacZ / WT: Вах - / - фоны.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры соответствовали требованиям Руководства NIH для использования и ухода за лабораторными животными. Протокол животное было одобрено IACUC в Weill Cornell Medical College.
1. Подготовка ткани
- Эвтаназии приурочен беременности самок смещения шейных позвонков 15. Рассеките эмбриональных E16 - E18 эмбрионов из тайм-беременности самок и место эмбрионов индивидуально в лунки блюдо 6-луночный, заполненных холодной фосфатным буферным солевым раствором (PBS).
- Промойте эмбрионы в холодной PBS.
- Удалить небольшую часть амниотической мембраны эмбриона и поместить в предварительно подготовленный протеиназы К раствору для последующего генотипирования. С другой стороны, если амниотической мембраны теряется, удалить небольшую часть от кончика хвоста эмбрионов и поместить его в раствор протеиназы К
- Совать отверстия в коже по всему эмбриона с использованием насекомых булавками (по крайней мере 100 с каждой стороны).
- Удалить PBS и медленно добавить свежий 2% параформальдегида (PFA),рН 7,4, к колодцу.
- Осторожно встряхивают в течение 2 ч при 4 ° С.
- Промыть эмбрионы дважды в PBS и хранить не в PBS при 4 ° С до окрашивания.
2. Генотипирование
- Погрузитесь амниотической мембраны или эмбриона хвосты протеиназы К смеси в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Выдержите при 56 ° С в течение 10 мин.
- Экстракт ДНК с использованием коммерчески доступного набора для очистки ДНК.
- Взять 0,5 мкл общего объема 200 мкл очищенных геномной ДНК-раствор, объединить его с 0,5 мкл каждого из генов конкретного смыслового и антисмыслового праймеров (10 мкМ), 2 мкл дНТФ Mix (2,5 мМ дАТФ, дЦТФ, дГТФ и дТТФ) , 0,2 мкл Taq полимеразы (5 ед / мкл) и 2 мкл ПЦР буфера (10x), добавляют H 2 O до полного объема 20 мкл.
Примечание: Последовательности праймеров следующие (таблица 1):
TrkA: TrkA_F: GCG GGC GCC GCC GCG ATG, TrkA_R: GAA GCC GCC ТГК GCG GCT CTG CCA GGG TG; ПЦР осколочнаяДлина ния: 400 пар оснований (п.о.).
Вах: In5R: GTT GAC CAG AGT GGC GTA Г.Г., Ex5F: TGA TCA GAA CCA TCA Т.Г., NeoR: CCG СТТ ССА ТТГ CTC AGC GG; Длина ПЦР-фрагмента: дикого типа, 304 BP; Вах NULL, 507 б.п..
TauLacZ: lacZup: ACA ACG TCG TGA GTG GGA AAA, lacZdown: ATC AAC ATT AAA TGT GAG CGA G; ПЦР длины фрагмента: 360 пар. - Запуск ПЦР со следующей программой для TrkA: Шаг 1: 1 мин при 95 ° C, шаг 2: 10 сек при 95 ° C, шаг 3: 20 сек при 68 ° C, шаг 4: 30 сек при 72 ° C. Повторите шаги 2 - 4 для 40 циклов.
- Для LacZ и Bax, запустить ПЦР со следующей программой: шаг 1: 1 мин при 95 ° С, шаг 2: 10 с при 95 ° С, шаг 3: 1 мин при 54 ° С, Шаг 4: 1 мин при 72 ° C, повторите шаги 2 - 4 для 35 циклов.
- Образцы Выполнить ПЦР на 2% агарозном геле при 100 В в 1x Трис-ацетат-ЭДТА буфере в течение 20 мин с полосу ДНК лестницы, чтобы оценить фрагментов длины.
- Анализ эмбрионов на наличие дикого типа TrkA, TРКА-tauLacZ и Bax нулевые аллели. Генотипы экспериментальных эмбрионов TrkA taulacZ / вес: Вах - / - и TrkA taulacZ / taulacZ: Вах - / -, в зависимости от экспериментальных вопросов. Эмбрионы, лишенные репортеру tauLacZ будет отрицательным для окрашивания аксонов и, следовательно, может служить в качестве отрицательного контроля для калибровки процесса окрашивания.
3. эмбрионов Окрашивание
- Использование коммерческого набора для окрашивания LacZ с некоторыми модификациями, как описано ниже в разделах 3.2 - 3.8. Вот, используйте комплект Millipore.
- Погрузитесь эмбрионов в буфере А, по крайней мере, 1 ч, встряхивая осторожно при комнатной температуре.
- Непосредственно погрузиться эмбрионов в буфере B, по крайней мере, 15 минут, встряхивая осторожно при комнатной температуре.
- В то время как эмбрионы в буфере A / B, предварительно теплой ткани основного раствора при 37 ° С. Используйте 5 мл ткани базы раствора на эмбрион.
- В то время как эмбрионы в буфере A / B, подготовки свежего 5-Bromo- 4- хлор-3-индолил α-D-галактопиранозид (X-Gal) в концентрации 40 мг / мл в 100% диметилсульфоксиде (ДМСО).
- Развести X-гал в подогретого ткани исходного раствора с концентрацией 1 мг / мл и добавляют 5 мл X-Gal / ткани базовой смеси в стекл нный сцинтилл ционный флакон.
- Трансфер эмбрионов в стеклянный сцинтилляционный флакон, содержащий X-гал / ткани основной смеси. Уплотнение крышки парафильмом и инкубировать при 37 ° С в течение ночи, проверка на наличие синего красителя.
- Эмбрионы Postfix со свежими 4% PFA, рН 7,4. Осторожно встряхивают в течение 4 ч при 4 ° С.
- Промыть эмбрионы дважды в холодной PBS.
4. Ткань Обезвоживание и посредничества
- Место эмбрионов в 50% метанол / 50% PBS смеси в течение 30 мин при комнатной температуре, встряхивания в стеклянных флаконах.
- Продолжать обезвоживают в 75% метаноле / 25% PBS в течение 30 мин при комнатной температуре, встряхивая в стеклянных флаконах.
- Продолжить для обезвоживания в 90% метанола / 10% РБС в течение 30 мин при комнатной температуре, встряхивая в стеклянных флаконах.
- Продолжать обезвоживают в 100% метаноле в течение 30 мин (2х) при комнатной температуре, встряхивая в стеклянных флаконах.
- В то время как эмбрионы дегидратации, подготовить 1: 1 (по объему) смеси спирта и бензоил бензоат бензоила.
ПРИМЕЧАНИЕ: бензоила алкоголя и бензоил бензоат является токсичным. - Погрузить эмбрионов в 1: 1 (по объему) смесь из 100% метанола: 100% Babb в течение 15 мин. Использовать стекло только потому, что Бабб будет растворяет пластик.
- Погрузитесь эмбрионов в 100% Бабб полностью очистить ткань и визуализировать окрашивание X-гал в очищенном эмбриона.
Примечание: изображение как можно быстрее, так как X-Gal пятна будет исчезать в течение долгого времени.
5. Всего горе изображений
- Стабилизация эмбрион, погруженный в 100% Бабб на соответствующих углов для фотографии с помощью металлических щипцов. Освещать используя комбинацию UP-света и под-света Источники света.
- Получение изображений с рассекает микроскопомоснащен цифровой камерой. Возьмите несколько экспозиций светлом поле в пяти последовательных фокальных плоскостях 0,5 мм друг от друга вдоль оси Z. Время экспозиции и диафрагмы может меняться в зависимости от освещения и камеры спецификации и должны быть оптимизированы для каждой установки.
- Используйте стандартное программное обеспечение для обработки изображений процесс нанесения изображения и создавать фотомонтажи.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Генотипы TrkA WT / taulacZ: Вах - / - и TrkA taulacZ / taulacZ: Вах - / - эмбрионы могут быть однозначно определено с помощью стандартных ПЦР генотипирование (Рисунок 1). X-Gal окрашивание отображает подробную периферийных аксонов беседки подкожно, обычно окрашенных эмбрионов (фиг 2, 3, а), и в течение эмбриона после очистки ткани (фиг 3б, 4).
Мы разводили в TrkA WT / taulacZ: Вах - / - линия с мышей, несущих конститутивно активируемые киназы B-Raf (V600E) мутацию (LSL-kaBraf 16) под контролем нейрон-специфический промотор нестина 17, чтобы получить LSL- kaBraf: TrkA taulacZ / taulacZ: Вах - / - мышей. В этих эмбрионов который полностью лишены TrkA сигнализации, морфология ноцицепторной периферийных выступов, тем не менее разработал почти нормально и (рис 4). Это демонстрируютГлавной функцией са для B-Raf сигнализации в периферической роста аксонов, а также показывает, что выживание и рост аксонов-продвижения функции сигнализации TrkA могут быть разделены с Вах - / - генетический фон замен за потерю TrkA-зависимой выживаемости сигнализации ,
Рисунок 1: генотипирование трансгенных мышей Типичные изображения агарозном геле.. Пример 1: TrkA WT / taulacZ: Вах WT / - образец 2: TrkA taulacZ / taulacZ: Вах - / -, образец 3: TrkA WT / taulacZ: Вах - / -.
Рисунок 2: E18.5 TrkA WT / taulacZ мыши окрашивали X-Gal Axon прогнозы от тройничного ганглиев в туловище и слух.d приведены в неубранный эмбриона. Масштабная линейка: 1 мм.
Рисунок 3:. E18.5 TrkA WT / taulacZ мыши окрашивали X-Gal (А) и после (б) после очистки с Бабб прогнозам от ДРГ в середине торса показано на рисунке. Масштабная линейка: 2 мм.
Рисунок 4: E16.5 LSL-kaBraf: TrkA taulacZ / taulacZ: Вах - / -.: Нестин-Cre эмбриона мыши окрашивали X-Gal и сбрасываются с Бабб kaBraf кодирует киназы активированного B-Raf киназы белка, B-RAF V600E. Выражение КАБ-RAF в DRG нейронов в результате полной длины, недалеко от нормального расширения аксонов при отсутствии сигналов TrkA. Масштабная линейка: 1 мм. Для более изображений, включая элементы управления, см. 15, рис2.
| Праймеры, используемые для ПЦР генотипирование | ||
| 1 | TrkA | Размер фрагмента ДНК: 400 б.п. |
| TrkA_F | GCG GGC GCC GCC GCG ATG | |
| TrkA_R | GAA GCC GCC ТГК GCG GCT CTG CCA GGG TG | |
| 2 | Вах | Размер фрагмента ДНК: 304 б.п. (дикий тип), 507 б.п. (Bax NULL) |
| In5R | GTT GAC CAG AGT GGC GTA GG | |
| Ex5F | TGA TCA GAA CCA TCA TG | |
| NeoR | CCG СТТ ССА ТТГ CTC AGC GG | |
| 3 | TauLacZ | Размер фрагмента ДНК: 360 б.п. |
| lacZup | ACA ACG TCG TGA GTG GGA AAA | |
| lacZdown | ATC AAC ATT AAA TGT GAG CGA G | |
Таблица 1: Праймеры, используемые для ПЦР генотипирование.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанный выше X-гал процедура окрашивания эмбриональных мышей TrkA taulacZ позволяет быстро и детальной визуализации на большие расстояния аксонов прогнозов в интактном фиксированной эмбриона. Из-за Вах нулевой фоне этих мышей позволит для зондирования механизмы, которые могут способствовать как росту аксонов и выживание нейронов сигнализации. Спаривание с трансгенными или мышей с нокаутом интересов позволяет комплексной оценки аксонов фенотипов и может служить полезным руководством для будущих экспериментов для изучения аксонов сигналы роста в более подробной форме. Основная задача для в естественных условиях аксонов исследований роста является время, чтобы подготовиться ткани Разделы и оценить сложные фенотипы растущих аксонов, которые могут быть затронуты в нескольких способов, с помощью какой-либо одной генетической манипуляции. TrkA taulacZ / taulacZ: Вах - / - линия позволяет оценить все последствия генапроцентов по развитию периферической ноцицепторной аксона.
Методика ограничивается визуализации ноцицептора аксонов траекторий, которые обычно экспрессируют TrkA на ранних стадиях развития. В дополнение к периферических болевых рецепторов, то можно представить себе симпатические и базальные проекции переднего мозга холинергические; Однако это потребует конкретный оптимизации методов окрашивания
Ткань очистка является ключевым шагом в методике, описанной здесь. Это позволяет детальную оценку более глубоких выступов в целом монтажа подготовки и, таким образом потенциального идентификации различных фенотипов. Люминесцентные журналисты, такие как TdTomato или GFP журналистам 18,19, может предложить четкость при определенных условиях, однако это трудно приобрести весь-Смонтировать образ, потому что мы обнаружили, что в отличие от окрашивания X-гал, флуоресцентные сигналы существенно бледнеет в течение Процедура ткани безналичный расчет. DiIОкрашивание также широко используется для аксона маркировки 20; его недостатки в том, что она не может выборочно пометить определенный подтип аксонов, такие как ноцицептора волокон здесь, и трудно полностью маркировать длинные траектории на периферии.
Таким образом, мы предлагаем протокол, который использует комбинацию из двух генетически модифицированных линий мышей, чтобы рутинную визуализации полных беседок ноцицептивных аксонов в эмбрионе мыши.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить доктора Луи Рейхардт для мышей TrkA taulacZ и д-р Аннет Markus для проницательного обсуждения и предложений. Эта работа была поддержана запуска средства из Берк Фонда, а также Уайтхолл исследовательского фонда грант 2010-08-61, исследовательский грант от Крылья для жизни фонда (WFL-US-028/14), грант ZB1-1102-1 от Кристофер и Дана Рив Фонд и гранты 1R01EY022409 и 3R01EY022409-01S1 из Национального института глаза, к JZ. KJo является членом Голдсмит.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6418 | |
| PBS | Life Tech | 10010-023 | |
| Tissue Rinse Solution A | Millipore | BG-6-B | |
| Tissue Rinse Solution B | Millipore | BG-7-B | |
| Tissue Stain Base Solution | Millipore | BG-8-C | |
| X-gal | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| Glass scintiallation vial | Kimble Chase | 74500-20 | |
| Incubator | Labline | Model 120 | |
| Insect pins | FST | 26000-30 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| 6-well dish | USA Scientific | CC7672-7506 | |
| Primers | IDT | custom DNA primers | |
| Takara dNTP mixture | Takara | 4030 | |
| Takara LA buffer | Takara | RR002A | |
| Takara LA Taq | Takara | RR002A | |
| PCR machine | Bio-Rad | DNA Engine Dyad | |
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | B-1042 | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B-6630 | |
| Dissecting microscope | Leica | M205A | |
| Camera | Leica | DFC310FX | |
| Ring light | Leica | MEB110 | |
| Photoshop | Adobe | Photoshop 4.0 |
References
- Verze, L., et al. Cutaneous innervation in hereditary sensory and autonomic neuropathy type IV. Neurology. 55, 126-128 (2000).
- Sethna, N. F., Meier, P. M., Zurakowski, D., Berde, C. B. Cutaneous sensory abnormalities in children and adolescents with complex regional pain syndromes. Pain. 131, 153-161 (2007).
- Uceyler, N., et al. Small fibers in Fabry disease: baseline and follow-up data under enzyme replacement therapy. J Peripher Nerv Syst. 16, 304-314 (2011).
- Reichardt, L. F., Mobley, W. C. Going the distance, or not, with neurotrophin signals. Cell. 118, 141-143 (2004).
- White, F. A., et al. Synchronous onset of NGF and TrkA survival dependence in developing dorsal root ganglia. J Neurosci. 16, 4662-4672 (1996).
- Farinas, I., Wilkinson, G. A., Backus, C., Reichardt, L. F., Patapoutian, A. Characterization of neurotrophin and Trk receptor functions in developing sensory ganglia: direct NT-3 activation of TrkB neurons in vivo. Neuron. 21, 325-334 (1998).
- Markus, A., Zhong, J., Snider, W. D. Raf and akt mediate distinct aspects of sensory axon growth. Neuron. 35, 65-76 (2002).
- Kuruvilla, R., et al. A neurotrophin signaling cascade coordinates sympathetic neuron development through differential control of TrkA trafficking and retrograde signaling. Cell. 118, 243-255 (2004).
- Zhong, J., et al. Raf kinase signaling functions in sensory neuron differentiation and axon growth in vivo. Nature. 10, 598-607 (2007).
- Bulfone, A., et al. An olfactory sensory map develops in the absence of normal projection neurons or GABAergic interneurons. Neuron. 21, 1273-1282 (1998).
- Moqrich, A., et al. Expressing TrkC from the TrkA locus causes a subset of dorsal root ganglia neurons to switch fate. Nature. 7, 812-818 (2004).
- Knudson, C. M., Tung, K. S., Tourtellotte, W. G., Brown, G. A., Korsmeyer, S. J. Bax-deficient mice with lymphoid hyperplasia and male germ cell death. Science. 270 (5233), 96-99 (1995).
- Lentz, S. I., Knudson, C. M., Korsmeyer, S. J., Snider, W. D. Neurotrophins support the development of diverse sensory axon morphologies. J. Neurosci. 19, 1038-1048 (1999).
- Patel, T. D., Jackman, A., Rice, F. L., Kucera, J., Snider, W. D. Development of sensory neurons in the absence of NGF/TrkA signaling in vivo. Neuron. 25, 345-357 (2000).
- Donovan, K. J., et al. B-RAF kinase drives developmental axon growth and promotes axon regeneration in the injured mature CNS. The Journal of experimental medicine. 211, 801-814 (2014).
- Mercer, K., et al. Expression of endogenous oncogenic V600EB-raf induces proliferation and developmental defects in mice and transformation of primary fibroblasts. Cancer research. 65, 11493-11500 (2005).
- Tronche, F., et al. Disruption of the glucocorticoid receptor gene in the nervous system results in reduced anxiety. Nature genetics. 23, 99-103 (1999).
- Madisen, L., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing. Nat Neurosci. 15, 793-802 (2012).
- Feng, G., et al. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Schmidt, H., Rathjen, F. G. DiI-labeling of DRG neurons to study axonal branching in a whole mount preparation of mouse embryonic spinal cord. J Vis Exp. , (2011).
