Abstract
La visualización de proyecciones neuronales de larga duración en los embriones es esencial para obtener una comprensión de cómo los mamíferos desarrollan redes neuronales. Aquí se describe un método para etiquetar in situ un subconjunto de ganglios de la raíz dorsal (GRD) proyecciones axón para evaluar sus características fenotípicas utilizando varias líneas de ratones manipulados genéticamente. Las neuronas TrkA-positivo son las neuronas nociceptivas, dedicada a la transmisión de señales de dolor. Utilizamos una línea de ratones TrkA taulacZ para etiquetar las trayectorias de todos los axones periféricos TrkA-positivo en el embrión de ratón intacto. Criamos aún más la línea TrkA taulacZ sobre un fondo nulo Bax, que esencialmente suprime la apoptosis neuronal, a fin de evaluar las preguntas relacionadas con el crecimiento independientemente de los posibles efectos de las manipulaciones genéticas sobre la supervivencia neuronal. Posteriormente, los ratones modificados genéticamente de interés son criados con el TrkA TaullacZ / Bax línea nula y son entonces listo para su estudio usando las técnicas descritas en el presente documento. Esta presentación incluye información detallada sobre los planes de cría de ratón, genotipificación en el momento de la disección, la preparación del tejido, la coloración y el desmonte para permitir la visualización de larga duración trayectorias axonal en la preparación de todo el montaje.
Introduction
Establecimiento de redes neuronales precisos es un complejo proceso de desarrollo esencial para la funcionalidad del sistema nervioso. Perturbación en este proceso conduce a la disfunción neuronal que ha sido implicado en enfermedades neurológicas humanas 1-3. Para estudiar los mecanismos moleculares subyacentes de crecimiento de los axones y la inervación diana en mamíferos, hemos desarrollado un protocolo para visualizar las trayectorias axonales de TrkA-expresión de las neuronas sensoriales usando una combinación de dos líneas de ratones modificados genéticamente.
TrkA es un receptor para el factor de crecimiento nervioso NGF y es un marcador funcional de las neuronas sensoriales nociceptivas 4. TrkA es altamente expresado en las neuronas nociceptivas durante el desarrollo temprano y media la supervivencia de neuronas dependientes de NGF, el crecimiento axonal, la arborización y el objetivo inervación 5-9. En los ratones TrkA taulacZ, el gen TrkA de tipo salvaje se sustituye por una expresión taulacZ cassette 10, de tal manera que la morfología axonal de las neuronas TrkA-positivos putativos se puede visualizar por β-gal (X-gal) tinción 11. Mediante una línea de TrkA taulacZ / WT heterocigóticos, podemos examinar los factores que pueden regular o interferir con el desarrollo de proyecciones aferentes sensoriales en vivo.
Por otra parte, la expresión de TrkA está ausente en ratones homocigotos TrkA taulacZ / taulacZ, que por lo tanto pueden ser utilizados para evaluar el crecimiento del axón promoción de mecanismos en la ausencia de la señalización de NGF / TrkA. Dado que las neuronas nociceptivas dependen de NGF / TrkA señalización no sólo para el crecimiento axonal, sino también para la supervivencia, empleamos otra línea de ratones, que carecen del gen Bax pro-apoptóticos, para inhibir la apoptosis en las neuronas DRG embrionarias, rescatar de la muerte celular que es lo contrario observado en ausencia de la señalización de TrkA. El Bax - / - fondo 12 por lo tanto permite la molecudisección lar de las vías de señalización que afectan específicamente axón 7-9,13-15 crecimiento. En TrkA - / -: Bax - / - ratones, DRG neuronas sobreviven, pero inervación aferente sensorial en la piel es la supresión total de 14,15. Podemos activar selectivamente las vías de señalización para determinar sus respectivas contribuciones al desarrollo de las proyecciones de los axones. La utilidad de este método es que permite la evaluación de los cambios en los fenotipos de crecimiento axonal cuando diferentes modificaciones genéticas se crían en el TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - o TrkA taulacZ / WT: Bax - / - fondos.
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Protocol
NOTA: Todos los procedimientos se ajusten a la Guía del NIH para el uso y cuidado de animales de laboratorio. El animal protocolo fue aprobado por el IACUC en el Weill Cornell Medical College.
1. Preparación del tejido
- La eutanasia hembras cronometrada del embarazo por dislocación cervical 15. Diseccionar embrionarias E16 - E18 embriones de las hembras cronometrada del embarazo y colocar los embriones individualmente en los pocillos de una placa de 6 pocillos, llenos de solución salina tamponada con fosfato fría (PBS).
- Enjuague los embriones en PBS frío.
- Retirar una pequeña porción de la membrana amniótica del embrión y el lugar en una solución de proteinasa K pre-preparado para la posterior determinación del genotipo. Alternativamente, si se pierde la membrana amniótica, retirar una pequeña porción de la punta de la cola del embrión y colocarlo en una solución de proteinasa K
- Hacer agujeros en la piel en todo el embrión utilizando pasadores de insectos (por lo menos 100 por cada lado).
- Retire PBS y poco a poco añadir nuevo máximo de 2% de paraformaldehído (PFA),pH 7,4, al pozo.
- Agite suavemente durante 2 horas a 4 ° C.
- Enjuague embriones dos veces en PBS y almacenar en PBS a 4 ° C hasta que la tinción.
2. Genotipado
- Sumergir membranas amnióticas o de las colas de embriones en proteinasa K mezcla de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Incubar a 56 ° C durante 10 min.
- Extracto de ADN utilizando un kit de purificación de ADN disponible en el mercado.
- Tomar 0,5 l de los totales de 200 l purificados solución de ADN genómico, combinarlo con 0,5 l de cada uno de los cebadores sentido y antisentido de genes específicos (10 mM), 2 l de dNTP Mix (2,5 mM de dATP, dCTP, dGTP y dTTP) , 0,2 Taq polimerasa l (5 U / l) y 2 l de tampón PCR (10x), añadir H 2 O hasta un volumen total de 20 l.
NOTA: Las secuencias de cebador son los siguientes (Tabla 1):
TrkA: TrkA_F: GCG GGC GCC GCC GCG ATG, TrkA_R: GAA GCC GCC TGC GCG GCT CTG CCA GGG TG; Frag PCRción longitud: 400 pares de bases (pb).
Bax: In5R: GTT GAC CAG AGT GGC GTA GG, Ex5F: TGA TCA GAA CCA TCA TG, NeoR: CCG CTT CCA TTG CTC AGC GG; PCR longitudes de los fragmentos: tipo salvaje, 304 pb; Nula Bax, 507 pb.
TauLacZ: lacZup: ACA ACG TCG TGA GTG GGA AAA, lacZdown: ATC AAC ATT AAA TGT GAG CGA G; PCR longitud de los fragmentos: 360 pb. - Ejecutar una PCR con el siguiente programa para TrkA: paso 1: 1 min a 95 ° C, etapa 2: 10 segundos a 95 ° C, paso 3: 20 segundos a 68 ° C, etapa 4: 30 segundos a 72 ° C. Repita los pasos 2-4 para 40 ciclos.
- Para LacZ y Bax, ejecute una PCR con el siguiente programa: paso 1: 1 min a 95 ° C, etapa 2: 10 segundos a 95 ° C, paso 3: 1 min a 54 ° C, etapa 4: 1 min a 72 ° C, repita los pasos 2-4 para 35 ciclos.
- Run muestras de PCR en un gel de agarosa al 2% a 100 V en tampón 1x Tris-acetato-EDTA durante 20 minutos con un carril de escalera de ADN para evaluar longitudes de los fragmentos.
- Analizar los embriones para detectar la presencia de tipo salvaje TrkA, TRKA-tauLacZ y Bax alelos nulos. Los genotipos de los embriones experimentales son TrkA taulacZ / WT: Bax - / - y TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / -, en función de las preguntas experimentales. Los embriones que carecen de la reportero tauLacZ serán negativos para la tinción axonal y por lo tanto pueden servir como controles negativos para calibrar el proceso de tinción.
3. La tinción de embriones
- Utilice un kit comercial para la tinción de lacZ con algunas modificaciones, como se describe a continuación en las secciones 3.2 a 3.8. En este caso, utilice el kit de Millipore.
- Sumerja embriones en Tampón A durante al menos 1 hora, agitando suavemente a temperatura ambiente.
- Directamente sumerja embriones en tampón B durante al menos 15 minutos, agitando suavemente a temperatura ambiente.
- Mientras que los embriones son en Tampón A / B, solución Base de tejidos pre-caliente a 37 ° C. Usar 5 ml de la solución de base de tisú por embrión.
- Mientras que los embriones son en Tampón A / B, preparar fresco 5-bromo- 4- cloro- 3- indolilo α-D-galactopiranósido (X-gal) a una concentración de 40 mg / ml en 100% de sulfóxido de dimetilo (DMSO).
- Diluir X-gal en la solución de base de tisú pre-calentado a una concentración de 1 mg / ml y añadir 5 ml de X-gal / mezcla base de tejido a un vial de centelleo de vidrio.
- Transferencia de embriones a un vial de centelleo de vidrio que contiene mezcla Base X-gal / Tissue. Sellar la tapa con Parafilm y se incuba a 37 ° C durante la noche, la comprobación de la presencia de la mancha azul.
- Embriones Postfix con frescos PFA al 4%, pH 7,4. Agite suavemente durante 4 horas a 4 ° C.
- Enjuague embriones dos veces en PBS frío.
4. Tejido Deshidratación y Compensación
- Coloque los embriones en 50% de metanol / 50% de mezcla de PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente, agitando en los viales de vidrio.
- Continuar para deshidratar en 75% de metanol / 25% PBS durante 30 min a temperatura ambiente, agitando en viales de vidrio.
- Continuar para deshidratar en 90% de metanol / 10% de PBS durante 30 min a temperatura ambiente, agitando frascos de vidrio.
- Continuar para deshidratar en 100% de metanol durante 30 min (2x) a temperatura ambiente, agitando en viales de vidrio.
- Mientras que los embriones se deshidratante, preparar una 1: 1 (v: v) mezcla de alcohol de benzoilo y de benzoato de benzoilo.
NOTA: alcohol de benzoilo y benzoilo benzoato es tóxico. - Sumergir los embriones en el 1: 1 (v: v) mezcla de 100% de metanol: 100% BABB durante 15 min. Sólo utilizar el vidrio porque el BABB se disolverá plástico.
- Sumerja los embriones en el 100% BABB para borrar por completo el tejido y para visualizar la tinción con X-gal en el embrión despejado.
NOTA: La imagen lo más pronto posible porque la mancha X-gal se desvanecerá con el tiempo.
5. todo el montaje de imágenes
- Estabilizar el embrión, inmerso en el 100% BABB, en los ángulos adecuados para la fotografía utilizando pinzas metálicas. Ilumine con una combinación de fuentes hasta la luz y bajo la luz de la luz.
- Adquirir imágenes con un microscopio de disecciónequipado con una cámara digital. Tome varias exposiciones de campo claro en cinco planos focales sucesivas 0,5 mm de separación a lo largo del eje Z. Los tiempos de exposición y diafragmas pueden variar en función de la iluminación y la cámara especificaciones y necesitan ser optimizados para cada configuración.
- Utilice software estándar de procesamiento de imágenes para procesar imágenes superpuestas y generar fotomontajes.
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Representative Results
Los genotipos de TrkA WT / taulacZ: Bax - / - y TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - embriones se pueden determinar de forma inequívoca por genotipo PCR estándar (Figura 1). Tinción pantallas X-gal detallan cenadores axonales periféricos por vía subcutánea en embriones convencionalmente manchadas (Figuras 2, 3a), y en todo el embrión después de la compensación de tejido (Figuras 3b, 4).
Hemos criado la TrkA WT / taulacZ: Bax - / - línea con los ratones que llevan el B-RAF (V600E) mutación quinasa activada constitutivamente (LSL-kaBraf 16) bajo el control del promotor de la nestina neuronal específica 17, para obtener LSL- kaBraf: TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - ratones. En estos embriones, que carecen por completo de señalización TrkA, la morfología de las proyecciones periféricas nociceptivas sin embargo desarrolló casi normalmente (Figura 4). Este demostrarsa función crucial para B-RAF señalización en el crecimiento axonal periférica, y también muestra que la supervivencia y el crecimiento del axón-promover las funciones de la señalización de TrkA se pueden separar, con el Bax - / - fondo genético sustituyendo por la pérdida de TrkA supervivencia dependiente de señalización .
Figura 1: El genotipado de los ratones transgénicos imágenes de gel de agarosa representativos.. Muestra 1: TrkA WT / taulacZ: Bax WT / -, muestra 2: TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / -, la muestra 3: TrkA WT / taulacZ: Bax - / -.
Figura 2: E18.5 TrkA WT / taulacZ ratón tiñó con X-gal proyecciones Axon de los ganglios del trigémino en torso y HEA.d se muestran en un embrión sin declarar. Barra de escala: 1 mm.
Figura 3:. Ratón E18.5 TrkA WT / taulacZ teñido con X-gal (A) antes y (B) después de limpiar con Babb Proyecciones de GRD a mediados de torso se muestran. Barra de escala: 2 mm.
Figura 4: Una E16.5 LSL-kaBraf: TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / -:. Nestin-Cre embrión de ratón teñidas con X-gal y se aclaró con BABB kaBraf codifica una activada por la proteína quinasa RAF B quinasa, B-RAF V600E. Expresión de KAB-RAF en las neuronas DRG resultado de larga duración, cerca de extensión normal axón en ausencia de señalización TrkA. Barra de escala: 1 mm. Para más imágenes, incluyendo los controles, ver ref. 15, la figura2.
| Los cebadores utilizados para la PCR genotipo | ||
| 1 | TrkA | Tamaño de fragmento de ADN: 400 pb |
| TrkA_F | GCG GGC GCC GCC GCG ATG | |
| TrkA_R | GAA GCC GCC TGC GCG GCT CTG CCA GGG TG | |
| 2 | Bax | Tamaño de los fragmentos de ADN: 304 pb (de tipo salvaje), 507 pb (Bax null) |
| In5R | GTT GAC CAG AGT GGC GTA GG | |
| Ex5F | TGA TCA GAA CCA TCA TG | |
| NeoR | CCG CTT CCA TTG CTC AGC GG | |
| 3 | TauLacZ | Tamaño de fragmento de ADN: 360 pb |
| lacZup | ACA ACG TCG TGA GTG GGA AAA | |
| lacZdown | ATC AAC ATT AAA TGT GAG CGA G | |
Tabla 1: Cebadores utilizados para el genotipado PCR.
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Discussion
El procedimiento de tinción X-gal-descrita anteriormente de ratones embrionarios TrkA taulacZ permite la visualización rápida y detallada de las proyecciones de los axones de larga distancia en el embrión intacto fijo. Debido a la nula fondo Bax estos ratones permiten el sondaje de los mecanismos que pueden contribuir tanto al crecimiento del axón neuronal y la supervivencia de señalización. El apareamiento con transgénicos o knockout ratones de interés permite una evaluación completa de los fenotipos axonal y puede servir de guía útil para futuros experimentos para examinar la señalización de crecimiento del axón de una forma más detallada. Un reto importante para los axones in vivo estudios de crecimiento es el momento de preparar el tejido secciones y evaluar los complejos fenotipos de los axones en crecimiento que pueden verse afectados de diversas maneras por cualquier manipulación genética. El TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - line permite la evaluación de todos los efectos de un gende interés en el desarrollo de los axones de los nociceptores periféricos.
La técnica se limita a la visualización de las trayectorias axonales nociceptivas que normalmente expresan TrkA durante las etapas tempranas del desarrollo. Además de los nociceptores periféricos, puede ser posible visualizar proyecciones colinérgicas del cerebro anterior basal y simpáticas; sin embargo, esto requeriría la optimización específica de técnicas de tinción
Aclaración del tejido es un paso clave del protocolo descrito aquí. Permite a la evaluación detallada de las proyecciones más profundas que mienten en los preparativos de montaje enteros y por lo tanto el potencial de identificación de fenotipos distintos. Reporteros fluorescentes, tales como tdTomato o GFP reporteros 18,19, pueden ofrecer claridad visual bajo ciertas condiciones, sin embargo, es difícil de adquirir la imagen de montaje en su conjunto, porque hemos descubierto que, en contraste con la tinción X-gal, las señales fluorescentes se desvanecen sustancialmente durante el procedimiento de compensación de los tejidos. Diltinción también se usa ampliamente para el etiquetado axón 20; sus deficiencias son que no puede etiquetar selectivamente un subtipo específico de los axones como las fibras nociceptivas aquí, y es difícil para etiquetar totalmente trayectorias largas en la periferia.
En resumen, ofrecemos un protocolo que utiliza una combinación de dos líneas de ratones modificados genéticamente para permitir la visualización de rutina de las pérgolas de pleno derecho de los axones nociceptivos en el embrión de ratón.
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Acknowledgments
Los autores desean agradecer al Dr. Louis Reichardt para los ratones TrkA taulacZ y Dr. Annette Markus para el debate profundo y sugerencias. Este trabajo fue apoyado por fondos de puesta en marcha de la Fundación Burke, así como la Fundación Whitehall beca de investigación 2010-08-61, una beca de investigación de Wings for Life Foundation (WFL-US-028/14), conceder ZB1-1102-1 del Christopher & Dana Reeve Foundation, y subvenciones 1R01EY022409 y 3R01EY022409-01S1 del Instituto Nacional del Ojo, a JZ. KJO es un compañero de Goldsmith.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6418 | |
| PBS | Life Tech | 10010-023 | |
| Tissue Rinse Solution A | Millipore | BG-6-B | |
| Tissue Rinse Solution B | Millipore | BG-7-B | |
| Tissue Stain Base Solution | Millipore | BG-8-C | |
| X-gal | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| Glass scintiallation vial | Kimble Chase | 74500-20 | |
| Incubator | Labline | Model 120 | |
| Insect pins | FST | 26000-30 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| 6-well dish | USA Scientific | CC7672-7506 | |
| Primers | IDT | custom DNA primers | |
| Takara dNTP mixture | Takara | 4030 | |
| Takara LA buffer | Takara | RR002A | |
| Takara LA Taq | Takara | RR002A | |
| PCR machine | Bio-Rad | DNA Engine Dyad | |
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | B-1042 | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B-6630 | |
| Dissecting microscope | Leica | M205A | |
| Camera | Leica | DFC310FX | |
| Ring light | Leica | MEB110 | |
| Photoshop | Adobe | Photoshop 4.0 |
References
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