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रिमोट अंग इस्केमिक शर्त: कृन्तकों में एक न्यूरोप्रोटेक्टिव तकनीक

Published: June 2, 2015 doi: 10.3791/52213
Automatic Translation
1
1Discipline of Physiology and Bosch Institute, Sydney Medical School, University of Sydney

Summary

रिमोट इस्कीमिक शर्त (आरआईपी) हानिकारक तनाव के खिलाफ कंडीशनिंग ऊतकों की एक विधि है। हम 5-10 मिनट के लिए एक रक्तदाबमापी कफ inflating द्वारा, पिछले अंग पर रिमोट ischemia के एक विधि की स्थापना की है। आरआईपी के न्यूरोप्रोटेक्टिव क्षमताओं कृन्तकों में रेटिना अध: पतन का एक मॉडल में प्रदर्शन किया गया है।

Abstract

Sublethal ischemia के प्रभावित ऊतकों में अंतर्जात तंत्र की upregulation के माध्यम से बाद में, और अधिक गंभीर ischemia के खिलाफ ऊतकों की रक्षा करता है। Sublethal ischemia के भी दूरदराज के ऊतकों में सुरक्षा तंत्र upregulate दिखाया गया है। स्तनधारियों के पिछले अंग में ischemia के (5-10 मिनट) का एक संक्षिप्त अवधि के मस्तिष्क, फेफड़े, दिल और रेटिना में आत्म रक्षात्मक प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करता है। प्रभाव दूरस्थ इस्कीमिक शर्त (आरआईपी) के रूप में जाना जाता है। यह महत्वपूर्ण अंगों की रक्षा करने का एक उपचारात्मक आशाजनक तरीका है, और हृदय और मस्तिष्क की चोटों के लिए क्लिनिकल परीक्षण के तहत पहले से ही है। एक चूहे की विशेष रूप से पिछले अंग - - इस्कीमिक इस प्रकाशन एक अंग बनाने का एक नियंत्रित, कम आक्रामक विधि को दर्शाता है। मानव नवजात शिशुओं में उपयोग के लिए विकसित एक रक्तचाप कफ एक पुस्तिका रक्तदाबमापी से जुड़ा है और पिछले अंग के ऊपरी हिस्से के चारों ओर 160 एमएमएचजी दबाव लागू करने के लिए प्रयोग किया जाता है। त्वचा के तापमान का पता लगाने के लिए बनाया गया एक जांच ischemi सत्यापित करने के लिए प्रयोग किया जाता हैएक, पैर की धमनियों के दबाव प्रेरित रोड़ा की वजह से त्वचा के तापमान में गिरावट, और कफ की रिहाई के बाद जो तापमान में वृद्धि की रिकॉर्डिंग के द्वारा। आरआईपी का यह तरीका उज्ज्वल प्रकाश प्रेरित नुकसान और अध: पतन के खिलाफ चूहा रेटिना को संरक्षण देता है।

Introduction

सबसे का अस्तित्व, शायद सभी, चयापचय तनाव का सामना करने के ऊतकों sublethal ischemia के 1,2 की अवधि के साथ पूर्व कंडीशनिंग द्वारा सुधार किया जा सकता है। व्यावहारिक दृष्टि से इस्केमिक शर्त (आईपी) ऊतक अनुभवों को इस तरह के एक बाद इस्कीमिक अपमान के रूप में और अधिक गंभीर तनाव, पहले sublethal ischemia के लिए ऊतक के लिए जोखिम है। पशु मॉडल में, आईपी मस्तिष्क, रेटिना, हृदय और फेफड़ों को 3-6 करने के लिए हड़ताली सुरक्षा प्रदान करता है। तदनुसार, स्ट्रोक रोगियों में टिप्पणियों पिछले क्षणिक इस्कीमिक हमलों और बेहतर नैदानिक ​​परिणामों 7,8 के बीच एक कड़ी दिखाया। आईपी ​​भी गैर इस्कीमिक चोटों 9 से रेटिना फोटोरिसेप्टर सुरक्षा करता है।

विविध ऊतकों और चोटों में आईपी के प्रभाव को यह सब ऊतकों में मौजूद सेल अस्तित्व का एक सहज तंत्र को सक्रिय कर रहा है कि पता चलता है। मायोकार्डियम के इस्केमिक शर्त upregulation के माध्यम से सुरक्षात्मक प्रभाव है सुझाव दिया गया हैएडेनोसाइन की रिहाई के माध्यम से या माइटोकॉन्ड्रियल एटीपी पोटेशियम चैनल 10,11 के उद्घाटन के माध्यम से कई चयापचय मार्ग को विनियमित करने के लिए जाना जाता है हाइपोक्सिया inducible कारक (HIF), के। एडेनोसाइन रिहाई और एटीपी पोटेशियम चैनल तारीख को इस्कीमिक कंडीशनिंग के न्यूरोप्रोटेक्टिव तंत्र की जांच विरोधी excitotoxicity, विरोधी apoptotic और विरोधी भड़काऊ रास्ते 12,13 के लिए संशोधन पर ध्यान केंद्रित किया गया है, मस्तिष्क ischemia में फंसा है, लेकिन कर रहे हैं। कुल मिलाकर, न्यूरॉन्स की रक्षा करने के लिए इस्कीमिक कंडीशनिंग के आणविक प्रक्रिया की समझ सीमित है।

रिमोट इस्कीमिक शर्त के प्रयास भी कम महत्वपूर्ण ऊतकों में ischemia के द्वारा पैदा दूर गंभीर रूप से महत्वपूर्ण अंगों (हृदय, मस्तिष्क, फेफड़े) हालत के लिए। पिछले अंग का उपयोग कर दूरस्थ इस्कीमिक शर्त (आरआईपी) स्ट्रोक 14-17 के कृंतक मॉडल में न्यूरोप्रोटेक्टिव होने का प्रदर्शन किया गया है। हमारे द्वारा वर्णित विधि एक सरल, विश्वसनीय और गैर इनवेसिव prot प्रदान करता हैआरआईपी उत्प्रेरण के लिए ocol।

चीर प्रोटोकॉल के विशाल बहुमत के ऊपरी पिछले अंग में स्थित और्विक धमनी को आसानी से पहचाना और शल्य चिकित्सा clamping और बंधन आवेदन के लिए पहुँचा जा सकता है, शायद क्योंकि पिछले अंग शामिल है। मस्तिष्क और त्वचा की सुरक्षा के अध्ययन के लिए आक्रामक अंग इस्कीमिक अध्ययन में, ischemia के कमर स्नायुबंधन से और्विक धमनी को अलग करने और और्विक धमनी 2,15,18 clamping से प्रेरित है।

अंग cuffing या और्विक धमनी या तो क्लेम्पिंग से उत्पन्न ischemia के एक नाड़ी की हानि, कमी oxygenation में और त्वचा के तापमान में एक बूंद सहित अंग में परिवर्तन के द्वारा पुष्टि की गई है। रिमोट ischemia के लेजर डॉपलर अल्ट्रासाउंड या डॉपलर 17-19 का उपयोग करके नाड़ी के नुकसान से इसकी पुष्टि की जा सकती है। त्वचा तापमान संबंध 20,21 गैर रेखीय है, हालांकि डॉपलर करने के लिए विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। सही तापमान रिकॉर्डिंग प्रयोगशालाओं और सकते में आम हैंआसानी से दूरदराज के इस्कीमिक पढ़ाई में शामिल किया जा।

सर्जरी clamping और्विक के लिए एक वैकल्पिक एक बंधन का उपयोग कर ischemia के प्रेरण है। बंधन आवेदन पोत clamping के साथ हासिल की है कि तुलनीय ischemia के उत्पादन; Kutchner एट अल। एक गैर इनवेसिव बंधन को clamping आक्रामक और्विक धमनी की तुलना में और दोनों तरीकों त्वचा फ्लैप ischemia के 18 में से एक प्लास्टिक सर्जरी मॉडल में अंग में रक्त के प्रवाह और कम त्वचा को नुकसान रुका पाया। पैर या हाथ या तो Cuffing और सिस्टोलिक रक्तचाप से ऊपर के लिए कफ दबाव जुटाने सूअर और मनुष्य 17,19,22 में इस्कीमिक क्षति के खिलाफ रक्षात्मक होना पाया गया है।

विभिन्न बंधन इस्कीमिक एक रक्तचाप कफ या एक इलास्टिक बैंड 17,22,23 के उपयोग में शामिल दूरदराज के उत्प्रेरण के लिए दृष्टिकोण। हालांकि, ischemia के लिए प्रेरित करने के लिए एक इलास्टिक बैंड के उपयोग के एक असुरक्षित विधि, में दबाव का एक अनियमित राशि के लिए संभावित जन्म देने के है500 एमएमएचजी से ऊपर दबाव बढ़ जाता है साथ अंग, मनुष्य के 24 में दर्ज किया जा रहा है। इसके अलावा, एक इलास्टिक बैंड का उपयोग करते हुए अंग ischemia के इवांस नीले रंग की डाई, myofiber पारगम्यता 25 के एक vivo में मार्कर द्वारा मूल्यांकन के रूप में, बैंड 23 से हटाने के बाद चूहों में पेशी नुकसान होता है। इसके विपरीत, बंधन को एक नियंत्रित दबाव की डिलीवरी एक रक्तदाबमापी 17,19,22,26 से जुड़े रक्तचाप कफ का प्रयोग कर प्राप्त किया जा सकता है।

इस अध्ययन में, फोटोरिसेप्टर अध: पतन का एक प्रकाश चोट मॉडल दूरस्थ इस्कीमिक शर्त के न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभावकारिता का प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। रिमोट ischemia के प्रकाश की चोट से ठीक पहले प्रेरित किया, और रेटिना समारोह परीक्षण के द्वारा की पुष्टि के रूप में बाद फोटोरिसेप्टर अध: पतन को रोका गया था। साथ वीडियो गैर इनवेसिव दूरस्थ ischemia के आवेदन का प्रदर्शन करेंगे।

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Protocol

आचार बयान: प्रोटोकॉल 5657 # एईसी सिडनी विश्वविद्यालय के पशु की देखभाल के दिशा निर्देशों, इस प्रकार है। अनेस्थेसिया पशु आचार समिति (सिडनी विश्वविद्यालय, एईसी # 5657) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. उपकरण तैयारी

  1. वास्तविक समय त्वचा के तापमान पर नज़र रखने का उपयोग करें। कंप्यूटर पर स्विच, और डाटा अधिग्रहण हार्डवेयर।
  2. ओपन तापमान रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर और तापमान ° 30-35 के बीच सी को स्थापित करने और हर 100 मिसे के लिए नमूने की आवृत्ति को समायोजित।
  3. वैकल्पिक: कोर तापमान सुनिश्चित करने के लिए डालें गुदा थर्मामीटर 37.5 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर बनी हुई है।

मैनुअल रक्तदाबमापी 2. कैलिब्रेशन

  1. एक 250-550 जी चूहे के लिए एक आकार 2 कफ sphygmomanometer.Use करने के लिए नवजात हाथ कफ कनेक्ट करें। एक एडाप्टर रक्तदाबमापी को कफ ट्यूबिंग कनेक्ट करने के लिए आवश्यक हो सकता है।
  2. या तो हवा रिलीज वाल्व ढीला या अनुकूलन से कफ ट्यूबिंग रखती द्वारा कफ खंडनया। कोई दबाव सुनिश्चित करें ट्यूबिंग में रहता है और दबाव नापने का यंत्र सुई अंडाकार / आयत के अंदर शून्य पर टिकी हुई है।
  3. ट्यूबिंग, दबाव नापने का यंत्र और कफ के बीच दबाव की जाँच करें। यह दबाव नापने का यंत्र पर 100 एमएमएचजी पढ़ता है जब तक मुद्रास्फीति बल्ब की कोमल पंपों के साथ कफ फुलाना। दबाव लगातार बना रहता है सुनिश्चित करें। धीरे-धीरे हवा रिलीज मूल्य खोलने से कफ खंडन करना।

3. पशु तैयारी

नोट: अंधेरे रूपांतरण की आवश्यकता प्रकाश की चोट से गुजरना करने के लिए दूरदराज ischemia के पहले की रात कर रहे हैं कि पशु। प्रकाश क्षति के दौर से गुजर पशु अंधेरे पालन (12 घंटा प्रकाश: अंधेरे चक्र (5 लक्स)) की आवश्यकता

  1. जाग या anesthetised कृन्तकों में या तो दूरदराज के ischemia के प्रदर्शन करना। जानवरों के लिए एक स्वस्थ मांसपेशियों टोन है कि सुनिश्चित करें। पर्याप्त पेशी मौजूद है इस बात की पुष्टि करने के लिए ऊपरी पिछले अंग बन्द रखो द्वारा इस सुनिश्चित करें। प्रकाश की चोट के खिलाफ चीर प्रेरित संरक्षण उम्र के 6 महीने तक आसीन चूहों में परीक्षण किया गया है।
  2. अनुसंधान के लिए Anesthetised तैयारीआईपी
    1. 60 मिलीग्राम / किग्रा ketamine और 5 मिलीग्राम / किग्रा xylazine की intraperitoneal इंजेक्शन के साथ चूहों इंजेक्षन। पैर का विस्तार और पैर के नीचे पर त्वचा बन्द रखो द्वारा संज्ञाहरण की गहराई से जाँच करें। यह गहरा anesthetised है अगर जानवर कोई पलटा है। संज्ञाहरण के तहत whilst के कॉर्निया सूखापन से बचने के लिए कृत्रिम आँसू लागू करें।
    2. एक गर्मी पैड या 37.5 डिग्री सेल्सियस के एक निरंतर शरीर का तापमान बनाए रखने के लिए पानी हीटर ट्यूबिंग परिसंचारी पर या तो चूहों रखें। निचले अंगों 'पैर पैड का सामना करना पड़ के साथ प्रवण स्थिति में चूहे स्थिति। या तो सही है या छोड़ दिया अंग दूरस्थ ischemia के गुजरना सकता है।
  3. आरआईपी के लिए जाग तैयारी
    नोट: पशु प्रयोगों के दो लोगों की आवश्यकता जाग। एक व्यक्ति पशु restrains और दूसरे व्यक्ति का मार्गदर्शन रक्तदाबमापी चल रही है। प्रयोगकर्ताओं संयम संचालकों को चोट का खतरा बढ़ जाता प्रक्रिया के रूप में प्रदर्शन करने के लिए आश्वस्त किया जाना चाहिए। दूरस्थ ischemia के दौर से गुजर चूहों टी वातानुकूलित किया जाना चाहिएओ पुस्तिका संयम। सहल ज्ञान के दिशा निर्देशों के आधार पर मार्गदर्शन संयम सप्ताह की एक संख्या से अधिक 5 मिनट की एक अधिकतम करने के लिए 30 सेकंड से प्रगति होनी चाहिए। पुस्तिका संयम लिए जलवायु का अभ्यस्त करने के लिए असफल कि डरपोक जानवरों जाग प्रयोग से बाहर रखा जाना चाहिए। अन्त में, पुस्तिका संयम सही ढंग से चीर अध्ययन के परिणामों की व्याख्या करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए पशुओं को तनाव (और संभवत: एक अध्ययन के घालमेल कर दिया परिचय) और एक दिखावा पलटन (सूजन बिना कफ की नियुक्ति) पैदा होने की संभावना है।
    1. एक 15 सेमी x 30-50 सेमी टुकड़ा में एक तौलिया कट और हिंद अंग के ऊपर से सिर को कवर, चूहे की रीढ़ की हड्डी को सीधा छोटी किनारे जगह है।
    2. चूहे के धड़ के तहत कम बढ़त कसकर टक और तौलिया के शेष लंबी बढ़त के साथ चूहे रैप करने के लिए शुरू करते हैं। एक लापरवाह स्थिति में हाथ के नीचे लपेटा जानवर सुरक्षित। चूहे बाएं हाथ के तहत आयोजित किया जाता है, तो तौलिया से चूहे की सही अंग मुक्त।

4. आवेदन ओएफ त्वचा तापमान जांच

  1. Ischemia से गुजरना और लुटेरा त्वचा पर जांच करने के लिए जगह है, जो चूहे के पैर बढ़ाएँ। तापमान जांच और त्वचा के बीच संपर्क को अधिकतम करने के लिए त्वचा जांच की स्थिति। मजबूती लुटेरा की जांच धक्का और कागज टेप के साथ जांच प्रत्यय।
  2. तापमान रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर पर नज़र रखने के तापमान से त्वचा जांच नियुक्ति की जाँच करें। त्वचा का तापमान 30-34 डिग्री सेल्सियस के बीच है और स्थिर बनी हुई है कि सुनिश्चित करें। 1-2 मिनट के लिए त्वचा के तापमान पर नज़र रखें। तापमान अस्थिर या 30 डिग्री सेल्सियस से नीचे है अगर त्वचा जांच समायोजित करें।

5. रिमोट Ischemia

  1. कफ खंडन करना और हवा के दबाव वाल्व बंद कर दिया है सुनिश्चित करते हैं। पैर बढ़ाएँ और शिथिल ऊपरी पिछले अंग पर कफ घेरना। स्थिति में ढीला कफ रखने के लिए पैर और कम अंक का विस्तार करने की तर्जनी और अंगूठे का प्रयोग करें।
  2. जाग जानवरों incre 160 एमएमएचजी करने के लिए, और में anesthetised जानवर के कफ का दबाव बढ़ा180 एमएमएचजी को कफ दबाव एएसई।
    नोट: चूहों के anesthetised रक्तचाप 120-140 एमएमएचजी से लेकर और जब होश में 160 एमएमएचजी से उगता है। सही दबाव पहुँच जाता है एक बार टाइमर और पैर तापमान रिकॉर्डिंग शुरू।
    नोट: पैर तापमान लगातार दबाव के 5 मिनट के बाद 2 डिग्री सेल्सियस से छोड़ देना चाहिए।
  3. Ischemia के दौरान जानवर "घुटने के ऊपर" कफ की स्थिति बनाए रखें। गिरफ्तार दबाव कुछ ही मिनटों के बाद ड्रॉप करने के लिए शुरू हो जाएगा, या चूहे के अंग घूम रहा है।
  4. बार बार पंप के वांछित कफ दबाव दोहराए छोटी फट बनाए रखने के लिए छोटी धारा में मुद्रास्फीति बल्ब पंप
  5. रिमोट ischemia के मिनट के बीच 5 और 15 के लिए लगातार दिया जा सकता है। ischemia के reperfusion के प्रोटोकॉल एक बीच 5 मिनट reperfusion के साथ 5 मिनट ischemia के 2 अवधि भी शामिल है।
  6. हवा के दबाव वाल्व ढीला द्वारा कफ दबाव खंडन करना। Ischemia के समर्थक के पाठ्यक्रम पर तापमान परिवर्तन की जाँच करेंtocol। कफ रिलीज।
  7. चोट के प्रयोग के साथ आगे बढ़ें। संज्ञाहरण के प्रभाव के तहत पशु एक गर्मी पैड पर रखा जा करने की आवश्यकता होगी। चल जब तक पशुओं पर नजर रखने के लिए आगे बढ़ें। पशु चलने तक के आवास को वापस नहीं किया जा सकता है।

6. हल्की चोट - रेटिना अध: पतन मॉडल

  1. डार्क जानवरों रातोंरात (12-15 घंटा) अनुकूलन। इसके तत्काल बाद दूरस्थ ischemia के कंडीशनिंग या दिखावा दूरस्थ ischemia के (पशु संयम) भोजन और पानी के साथ Perspex आवास में जगह जानवरों के बाद।
  2. 24 घंटे के लिए सुबह 9 बजे Perspex आवास के ऊपर स्थित फ्लोरोसेंट प्रकाश (1000 लक्स) पर स्विच करें। प्रकाश जोखिम के बाद 7 दिनों के लिए चक्रीय प्रकाश मंद करने के लिए जानवरों वापसी।

7. पोस्ट-दूरस्थ Ischemia प्रक्रियाएं

  1. Electroretinogram (एर्ग) के साथ दृष्टि आकलन:
    नोट: एर्ग सेट-अप और फ्लैश प्रोटोकॉल Brandli और स्टोन 26 का पालन किया।
    1. डार्क रातोंरात जानवरों के लिए अनुकूल (12-15 घंटा)। नीचेलाल रोशनी ketamine और xylazine की intraperitoneal इंजेक्शन (60 मिग्रा / किग्रा और 5 मिलीग्राम / किग्रा, क्रमशः) द्वारा पशुओं anesthetize मंद। Mydriatic (atropine सल्फेट 1.0%), कॉर्निया संवेदनाहारी (proxymetacaine 0.5%)।
    2. कॉर्निया जलयोजन लागू करें (Carbomer बहुलक) आंख के कॉर्निया को तुरंत चला जाता है। कॉर्निया जलयोजन बनाए रखने के लिए 20 मिनट के अंतराल पर आंख जेल लागू करें।
    3. स्थिर एर्ग रिकॉर्डिंग सहायता करने के लिए नेत्रगोलक के चारों ओर एक शिथिल बंधा धागा ड्रा। एक गुदा जांच का प्रयोग तापमान पर नजर रखने और 37-37.5 डिग्री सेल्सियस पर पशु के शरीर का तापमान बनाए रखें।
    4. एक Ganzfeld एकीकृत क्षेत्र के अंदर सिर की स्थिति।
      नोट: Ganzfeld आंखों के लिए एल ई डी से वर्दी कण चमक बचाता है कि एक पूरी तरह से प्रोग्राम प्रकाश उत्तेजना है।
    5. हल्के से कॉर्निया को छू एक कस्टम निर्मित 4 मिमी प्लैटिनम सकारात्मक इलेक्ट्रोड और मुंह में डाला 2 मिमी व्यास एजी / AgCl गोली इलेक्ट्रोड का उपयोग कर electroretinogram रिकॉर्ड। एक स्टेनलेस स्टील सुई करने के लिए दोनों इलेक्ट्रोड संदर्भदुम में subcutaneously डाला।
    6. एक 2 किलोहर्ट्ज़ के अधिग्रहण की दर के साथ 0.3-1,000 हर्ट्ज (-3 DB) का बैंड-पास की स्थापना के साथ रिकॉर्ड का संकेत है, (ई उपकरण)। एक स्थिर एर्ग रिकॉर्डिंग रिकॉर्डिंग शुरू होने से पहले इस विषय में एक 10 मिनट तमोनुकूलन करने के लिए पशु स्थापित हो जाने के बाद।
    7. के रूप में पहले Brandli और स्टोन 26 से वर्णित फ्लैश प्रोटोकॉल का पालन करें।
      1. फ्लैश की अवधि कार्यक्रम (हम चमक अवधि में 1-2 मिसे) का इस्तेमाल किया है, और -4.4 प्रवेश स्काटलैंड का निवासी cd.sm -2 2.0 करने के लिए इसकी तीव्रता निर्धारित किया है। रेटिना समारोह को मापने के लिए उज्ज्वल चमक (2.0 प्रवेश स्काटलैंड का निवासी cd.sm -2, 1 एमएस) का प्रयोग करें। इस अध्ययन में यह नियंत्रण, प्रकाश चोट और चीर के साथ प्रकाश की चोट के बीच तुलना है।

8. TUNEL के परख

  1. Phenobarbital जरूरत से ज्यादा (100 मिलीग्राम / किग्रा) की intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा जानवरों euthanize। आंखों मालूम करना और 4% paraformaldehyde में तय कर लो।
  2. Cyroprotecting से पहले पीबीएस में आंखें धो लेंआँखों में रात भर सूक्रोज 30% में (w / v)। अक्टूबर परिसर में आंखों शामिल करें और एक cryostat का उपयोग 20 माइक्रोन बाण के समान वर्गों में कटौती।
  3. Maslim एट अल के प्रोटोकॉल के बाद DAPI धुंधला के साथ रेटिना वर्गों पर TUNEL के परख प्रदर्शन करते हैं। 27
  4. रेटिना के TUNEL के मामलों के लिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करें। TUNEL के कोशिकाओं को बाहरी परमाणु परत (ONL) से दर्ज किए गए; फोटोरिसेप्टर नाभिक होता है जो रेटिना की सबसे बाहरी परत। इस अध्ययन में, TUNEL के मायने रखता है प्रत्येक उपचार समूह के लिए 5 आंखों के साथ, एक आँख के लिए तीन प्रतियों में किए गए थे।
  5. तुलना सांख्यिकीय समूह के लिए एक तरह से एनोवा का प्रयोग करें नियंत्रण, प्रकाश चोट, और प्रकाश की चोट + चीर चूहों का मतलब है।

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Representative Results

160 एमएमएचजी से ऊपर ऊंचा एक रक्तचाप कफ चित्रा 1 बी में स्पष्ट रूप से देखा के रूप में पिछले अंग में रक्त के प्रवाह को रोकता है। ऊतक oxygenation की कमी के कारण एक ischemia-reperfusion प्रोटोकॉल (चित्रा 2) के लिए जानवर के पैर के तापमान को कम करने में हुई। पैर तापमान (33 डिग्री सेल्सियस) कफ (32 डिग्री सेल्सियस) हवा निकाल रहा था जब बढ़ती कफ दबाव ऊंचाई (31 डिग्री सेल्सियस) के दौरान कोर तापमान की तुलना में कम है और मज़बूती से कम हो गया था। एक एकल 1,000 लक्स प्रकाश की चोट के साथ या दूरस्थ इस्कीमिक शर्त के बिना सूरजमुखी मनुष्य चूहों उठाया मंद करने के लिए दिया गया था। रेटिना समारोह दर्ज की गई और electroretinogram (एर्ग) का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था।

Ligh के बाद 3 चित्र में दिखाया के रूप में एर्ग प्रकाश उत्तेजना के लिए रेटिना के भीतर और बाहर के न्यूरॉन्स से होने वाले बिजली प्रतिक्रियाओं का योग है। एर्ग तरंग phototransduction से उत्पन्न होने वाली एक प्रारंभिक नकारात्मक चोटी है (कम से कम लगभग 10 मिसेटी फ्लैश) लगभग प्रकाश फ्लैश के बाद 80 मिसे) बी लहर करार दिया एक लहर और भीतरी रेटिना (अधिकतम से एक बड़ा सकारात्मक शिखर करार दिया। एक सामान्य मंद से काले अनुकूलित एर्ग चूहे एक उज्ज्वल 2.0 प्रवेश cd.sm -2 फ्लैश (चित्रा 3) के लिए एक बड़ी फोटोरिसेप्टर और भीतर रेटिना प्रतिक्रिया से पता चला उठाया। एर्ग रिकॉर्डिंग फोटोरिसेप्टरों के नुकसान को दर्शाती नियंत्रण करने के लिए आयाम सापेक्ष में एक गंभीर कमी की थी, प्रकाश चोट के बाद एक सप्ताह; 3B चित्रा देखें। Ischemia के ischemia के प्रकाश की चोट से फोटोरिसेप्टरों संरक्षित तुरंत पहले 2 एक्स 5 मिनट की एक reperfusion के प्रोटोकॉल का उपयोग करने के साथ पिछले अंग शर्त। आरआईपी एर्ग आयाम एक लहर सी (चित्रा -3 सी) के लिए एक मामूली कमी के साथ, अकेले प्रकाश की चोट की तुलना में अधिक थे। रेटिना के cryopreserved वर्गों पर टर्मिनल deoxynucleotidyl ट्रांस्फ़्रेज़ dUTP निक अंत लेबलिंग (TUNEL के) परख चीर रिलायंस एनर्जी प्राप्त प्रकाश क्षतिग्रस्त पशुओं में apoptotic कोशिकाओं की कमी की पुष्टि कीकरने के लिए ative नकली इलाज किया प्रकाश चोट जानवर (चित्रा 4)।

चित्रा 1 के रूप में देखा पिछले अंग को ischemia के प्रेरण, कफ का सही स्थान पर निर्भर करता है। "घुटने" नीचे रखा एक कफ प्रकाश की चोट से फोटोरिसेप्टर की रक्षा नहीं करता कम एर्ग आयाम के रूप में परिलक्षित, चित्रा 3 डी में देखते हैं।

अंत में, प्रशासित जब सही ढंग से पिछले अंग ischemia के प्रकाश की चोट से रेटिना न्यूरॉन्स की रक्षा करने में सक्षम था।

चित्र 1
चित्रा 1:। गिरफ्तार स्थान और 160 एमएमएचजी से ऊपर कफ दबाव का असर (ए) कफ दबाव ऊंचाई से पहले पिछले अंग और पैर दिखाता है। (बी) 160 एमएमएचजी से ऊपर कफ दबाव की ऊंचाई के दौरान पैर दिखाता है। "कश्मीर से ऊपर कफ की स्थिति नोट "nee। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। Ischemia के दौरान त्वचा का तापमान कम 160 एमएमएचजी पर 2 एक्स 5 मिनट के लिए पिछले अंग पर कफ के पैर तापमान कफ मुद्रास्फीति के दौरान कम है मुद्रास्फीति की दर। (ए) 2 एक्स 5 मिनट चीर पैर तापमान में परिवर्तन के लिए समूह के औसत दिखाता है। (बी) 2 एक्स 5 मिनट ischemia के लिए अनुरेखण (डिग्री सेल्सियस) एक प्रतिनिधि पैर तापमान दिखाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 3:। 24 घंटा हर्जाना रेटिना के फोटोरिसेप्टर के लिए उज्ज्वल प्रकाश को चीर प्रकाश क्षति चूहों की तुलना में एर्ग में प्रदर्शन के रूप में रेटिना समारोह को बरकरार रखता है एक्सपोजर। एर्ग प्रकाश उत्तेजना के लिए एक बिजली प्रतिक्रिया (microvolts [μV]) के रूप में आंतरिक और बाहरी रेटिना के स्वास्थ्य के उपाय। 2.0 प्रवेश cd.sm करने के लिए सामान्य रेटिना प्रतिक्रिया -2 (ए) में देखा प्रकाश उत्तेजना। एक छोटे एर्ग आयाम (बी) में चमकदार रोशनी परिणामों से फोटोरिसेप्टर नुकसान। आरआईपी प्रकाश की चोट (सी) निम्नलिखित फोटोरिसेप्टरों बचाव करने में सक्षम था। चोट (डी) से फोटोरिसेप्टर की रक्षा नहीं करता चीर के दौरान गलत कफ नियुक्ति। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 4: TUNEL के + सेल मायने रखता है। प्रकाश चोट, चोट + आरआईपी के लिए समूह के परिणाम की तुलना एक बार ग्राफ रेटिना (8,000 मीटर) की संपूर्ण अवधि में गिना रहे थे चीर। TUNEL के + सेल के साथ एपोप्टोसिस में कमी प्रदर्शित करता है। शीर्ष पैनल: TUNEL के + कोशिकाओं के समूह औसत चीर इलाज चूहों के लिए कम थे (210 ± 4.9, एन = 5) अकेले प्रकाश की चोट की तुलना में (255 ± 10, एन = 5), पी <0.01, एक तरह से एनोवा। Undamaged रेटिना (कोई प्रकाश चोट) बहुत कम था (3.0 ± 1.4, एन = 5) apoptotic कोशिकाओं। बेहतर प्रकाश घायल रेटिना के (ए) प्रतिनिधि छवि। (बी) के बेहतर चीर प्रकाश घायल रेटिना के प्रतिनिधि छवि। (सी) अवर प्रकाश घायल रेटिना के प्रतिनिधि छवि। (डी) अवर चीर प्रकाश घायल रेटिना के प्रतिनिधि छवि। इस का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंआंकड़ा।

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Discussion

कृंतक पिछले अंग ischemia के सफलतापूर्वक एक पुस्तिका रक्तदाबमापी के साथ प्रेरित और रेटिना के फोटोरिसेप्टर को neuroprotection पहुंचाने कफ किया गया था। प्रकाश चोट 9,28 से photoreceptors के इस्कीमिक कंडीशनिंग प्रेरित संरक्षण के साथ सुसंगत ढूँढना।

मूलतः, दूरदराज के ischemia के ऊतकों को संक्षिप्त ऑक्सीजन के अभाव का कारण बनता है। इसलिए, दूरदराज के इस्कीमिक शर्त इस्कीमिक कंडीशनिंग या वैकल्पिक रूप से कहा जाता इस्कीमिक सहिष्णुता, hypoxic शर्त है, और कुछ हद तक, anaerobic व्यायाम करने के लिए कई समानताएं हैं। कोशिकाओं या तो सीधे neuroprotection प्रदान करते हैं या बाद के चयापचय तनाव 13 के सहिष्णु बनने के लिए कोशिकाओं को प्रभावित करने वाले प्रोटीन, न्यूक्लीओसाइड और प्रतिलेखन कारक की एक बड़ी विविधता को रिहा द्वारा इस्कीमिक चुनौती का जवाब।

साहित्य में, दूरस्थ ischemia के प्रोटोकॉल durations और आवृत्तियों की एक श्रृंखला को शामिल किया है। हमारी प्रयोगशाला, 10, 5 का परीक्षण कियाऔर सामान्य रेटिना समारोह 26 पर 2 एक्स 5 मिनट ischemia के प्रोटोकॉल। इन प्रोटोकॉल के 2 एक्स 5 मिनट के सामान्य चूहों में सबसे बड़ी एर्ग आयाम परिवर्तन का उत्पादन किया और प्रकाश की चोट के एक मॉडल में परीक्षण करने के लिए चुना गया था। लघु और बार-बार 5 मिनट इस्कीमिक घटनाओं को भी मनुष्यों में स्ट्रोक आवर्ती में निवारक होने के लिए और सूअरों 17,22 में प्रयोगात्मक झटके में रोधगलितांश आकार को कम करने के लिए दिखाया गया है। हालांकि, इस्कीमिक शर्त का सबसे उपयुक्त अवधि का इस्तेमाल किया पशु मॉडल पर निर्भर होने की संभावना है। उदाहरण के लिए, फोकल ischemia के खिलाफ रोधगलितांश आकार में कमी लंबे समय तक 2 एक्स 15 मिनट और 3 एक्स 15 मिनट प्रोटोकॉल में मनाया, लेकिन नहीं 5 एक्स 3 में मिनट प्रोटोकॉल चूहों 15 में किया गया है।

आईपी ​​और इस्कीमिक चोट के बीच के समय में भी प्रभावी neuroprotection के लिए विचार किया जाना चाहिए। दो बार Windows आईपी द्वारा प्रेरित cardioprotection के लिए वर्गीकृत किया गया है। ये IP और बाद 0-12 घंटा होती है, जो "क्लासिक कंडीशनिंग" खिड़की, कर रहे हैंआईपी ​​29 के बाद 3-4 दिन होता है, जो "दूसरी खिड़की",। एक केंद्र स्ट्रोक मॉडल में, चीर क्लासिक और दूसरा Windows 15 के बाहर उन सहित कई समय बिंदुओं को रक्षात्मक होना पाया गया। हालांकि, चीर और आईपी में neuroprotection की समय अवधि की तुलना में है जो कुछ अध्ययन किया गया है।

दूरस्थ ischemia के संरक्षण के लिए एक और विचार यह चोट (शर्त) से पहले लागू या चोट (postconditioning) के बाद किया जाता है कि क्या सहित, कंडीशनिंग का समय है। दूरस्थ ischemia के परीक्षण के बहुमत के अध्ययन हाल ही में दोनों रेटिना और मस्तिष्क न्यूरॉन्स 30,31 के सुरक्षात्मक होना पाया गया होने postconditioning के बावजूद शर्त इस्तेमाल किया गया है।

सारांश में, पिछले अंग इस्कीमिक कंडीशनिंग में neuroprotection की प्रेरण रोग मॉडल, पशु प्रजातियों, ischemia की अवधि, और ischemia के समय के लिए विशिष्ट है। Kaniora एट अल द्वारा एक समीक्षा। पीदूरस्थ प्रजातियों सहित ischemia के प्रोटोकॉल, चीर प्रोटोकॉल, चीर साइटों, चोट मॉडल, चोट के परिणामों और प्रस्तावित सुरक्षा तंत्र 32 की विविधता के बारे में अधिक जानकारी के rovides।

पिछले अंग पर न्यूनतम इनवेसिव कफ दोनों जाग में आरआईपी के लिए अनुमति देता है और जानवरों के शरीर के तापमान को बनाए रखा है प्रदान की है। संवेदनाहृत प्रयोग में, जानवर के शरीर के तापमान को हाइपोथर्मिया को रोकने के लिए बनाए रखा जाना चाहिए। आंतरिक तापमान निगरानी हाइपोथर्मिया या अतिताप के दौर से गुजर पशु को रोकने जाएगा। हाइपोथर्मिया और हाइपरथर्मिया स्ट्रोक मॉडल और प्रकाश की चोट 33-36 दोनों में जाने-माने पूर्व कंडीशनिंग उत्तेजनाओं हैं। प्रस्तुत जौव विधि जिससे शरीर का तापमान घालमेल को रोकने जाग पशुओं में प्रदर्शन किया जा सकता है।

Anesthetics चीर प्रयोग में घालमेल कर दिया है की एक अलग सेट को लागू कर सकते हैं। Isoflurane एटीपी के प्रति संवेदनशील पोटेशियम चर्चा के उद्घाटन के माध्यम से मायोकार्डियम संरक्षण में भाग ले सकता हैannels, इस्कीमिक कंडीशनिंग 37 की रिपोर्ट में एक समान सुरक्षा व्यवस्था। स्ट्रोक मॉडल में रोधगलितांश के आकार isoflurane दिया दिखावा इलाज पशुओं में बड़े रहता है, आणविक तंत्र अंतर्निहित दूरस्थ इस्कीमिक कंडीशनिंग anesthetics के प्रभाव से छिपा हुआ जा सकता है। Ketamine, एक NMDA प्रतिपक्षी, mTOR मार्ग को सक्रिय करने और सीरम 39-41 में BDNF जारी, न्यूरॉन्स के लिए excitotoxicity को रोकने के लिए संभावित सहित विवो 38 में सुरक्षात्मक प्रभाव, की एक भीड़ है। Ketamine मानव में मस्तिष्क आघात निम्नलिखित न्यूरोनल अस्तित्व को बढ़ाने और कृंतक फोटोरिसेप्टर 42,43 में प्रकाश की चोट को कम करने के लिए सूचित किया गया है। जाग रक्तचाप cuffing के साथ दूरदराज के इस्कीमिक कंडीशनिंग के तंत्र की जांच संवेदनाहारी घालमेल से बचना होगा।

प्रभावी पिछले अंग ischemia के कफ का सही स्थान पर निर्भर करता है, कफ दबाव और systo से ऊपर कफ दबाव ऊंचाई की निरंतरताकम electroretinogram (एर्ग) आयाम के रूप में परिलक्षित चित्रा 1 के रूप में देखा एलआईसी रक्तचाप। "घुटने" नीचे रखा एक कफ प्रकाश की चोट से फोटोरिसेप्टर की रक्षा नहीं करता। कफ की स्थिति के आधार कंडीशनिंग में अंतर के कारण और्विक धमनी के लिए मांसपेशियों और निकटता में मतभेद होने की संभावना है। इसके अलावा, जानवरों उम्र, वजन, शरीर का तापमान और लिंग के लिए तय की जानी चाहिए।

सारांश में, दूरदराज के ischemia के मांसपेशियों की चोट से बचा जाता है और जाग या anesthetized प्रयोग के लिए लचीलापन है, जो एक गैर इनवेसिव रक्तचाप कफ, द्वारा प्रेरित किया जा सकता है। रिमोट इस्कीमिक शर्त एक उभरती हुई न्यूरोप्रोटेक्टिव रणनीति है और इस प्रोटोकॉल अपने तंत्र और अनुप्रयोगों में आगे के अध्ययन के लिए सक्षम हो जाएगा।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gold series DuraShock hand aneroid sphygmomanometer Welch Allyn DS56 Manual Sphygmomanometer
Neonate [size 2] 1 tube, 10 pack Welch Allyn 5082-102-1 Limb blood pressure cuff
Luer lock adaptor Welch Allyn 5082-178 Adaptor for neonatal cuff
Thermistor pod AD Instruments ML 309 skin tempertature unit
Skin temperture probe AD Instruments MLT 422/A
Powerlab, 4 channel acquistion hardware AD Instruments PL 35044
Homeothermic blanket system with flexible probe Harvard Appartus 507222F
Towel optional: awake remote ischemia
Isoflo - 100% Isoflurane (250 ml) Abbot Animal Health 05260-05 optional: inhaltion anaesthetic remote ischemia
Ketamil - ketamine 100 mg/ml (50 ml) Troy Laboratories Pty Ltd optional: injectable anaesthetic remote ischemia
Xylium - Xylazine 100 mg/ml (50 ml) Troy Laboratories Pty Ltd optional: injectable anaesthetic remote ischemia

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Brandli, A. Remote Limb Ischemic… More

Brandli, A. Remote Limb Ischemic Preconditioning: A Neuroprotective Technique in Rodents. J. Vis. Exp. (100), e52213, doi:10.3791/52213 (2015).

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