Summary
Pré-condicionamento isquémico remoto (RIP) é um método de tecidos condicionado contra o stress prejudicial. Nós estabelecemos um método de isquemia remoto no membro posterior, inflando um manguito de esfigmomanômetro para 5-10 min. As capacidades neuroprotectoras de PIR foi demonstrada num modelo de degeneração da retina em roedores.
Abstract
Isquemia subletal protege os tecidos contra subsequente isquemia, mais severa a regulação positiva através de mecanismos endógenos no tecido afectado. Isquemia subletal também tem sido demonstrado que regulam positivamente os mecanismos de protecção nos tecidos remotos. Um breve período de isquemia (5-10 min) na pata traseira dos mamíferos induz respostas de auto-proteção no cérebro, pulmão, coração e retina. O efeito é conhecido por pré-condicionamento isquémico remoto (PIR). É uma maneira terapeuticamente promissora de proteger os órgãos vitais, e já está em fase de testes clínicos para o coração e cérebro lesões. Esta publicação mostra, um método minimamente invasivo controlada de fazer um galho - especificamente o membro posterior de um rato - isquêmica. Um medidor de pressão desenvolvido para uso em recém-nascidos humanos está ligado a um medidor de tensão manual e usado para aplicar pressão de 160 mmHg, em torno da parte superior do membro posterior. Uma sonda concebida para detectar a temperatura da pele é utilizado para verificar a ischemium, por registo da queda de temperatura da pele causado pela oclusão induzida por pressão das artérias das pernas, e o aumento da temperatura que segue libertação da braçadeira. Este método de RIP proporciona proteção a retina de ratos contra brilhante dano induzido por luz e degeneração.
Introduction
A sobrevivência da maior parte, talvez todos, os tecidos do rosto de stress metabólico podem ser melhoradas por condicionamento prévio com um período de isquemia subletal 1,2. Pré-condicionamento isquêmico (IP), em termos práticos é a exposição dos tecidos à isquemia sub-letal, antes de as experiências de tecido estressores mais graves, como um insulto isquêmico subseqüente. Em modelos animais, IP fornece protecção notável para o cérebro, retina, coração e pulmões 3-6. Do mesmo modo, observações em pacientes com AVC mostrou uma ligação entre os ataques isquêmicos transitórios anteriores e melhores resultados clínicos 7,8. IP também protege fotorreceptores da retina de lesões não-isquêmica 9.
A eficácia de IP em diversos tecidos e lesões sugere que está a activar um mecanismo inato de sobrevivência de células presente em todo o tecido. Pré-condicionamento isquémico do miocárdio foi sugerido ter efeitos protectores, através da regulação positivado factor de hipóxia indutível (HIF), conhecido para regular muitos processos metabólicos através da libertação de adenosina ou através da abertura de canais de potássio ATP mitocondriais 10,11. Canais de liberação de adenosina e ATP potássio estão envolvidos na isquemia cerebral, mas, as investigações sobre os mecanismos neuroprotectores de condicionamento isquêmico até à data têm sido focados na modificações anti-excitotoxicity, vias anti-apoptóticos e anti-inflamatórios 12,13. Em geral, a compreensão do processo molecular de condicionamento isquémico para protecção dos neurónios é limitada.
Tentativas de pré-condicionamento isquêmico remoto para condicionar órgãos distantes criticamente importantes (coração, cérebro, pulmão), gerando isquemia em tecidos menos críticas. Pré-condicionamento isquémico remoto (RIP), usando o membro posterior foi demonstrado ser neuroprotectores, em modelos de roedores de acidente vascular cerebral 14-17. O método descrito por nós proporciona um prot simples, fiável e não-invasivaOCOL para induzir PIR.
A grande maioria dos protocolos RIP envolvem o membro posterior, presumivelmente porque a artéria femoral localizado no membro posterior superior pode ser facilmente identificado e o acesso para fixação cirúrgica e aplicação torniquete. Em estudos de isquemia dos membros invasivo para o estudo do cérebro e de protecção da pele, isquemia é induzida através da separação da artéria femoral dos ligamentos na virilha e aperto da artéria femoral 2,15,18.
A isquemia resultante do aperto ou da artéria femoral ou cuffing membro foi confirmada por alterações no membro, incluindo uma perda de pulso, diminuição da oxigenação e uma queda na temperatura da pele. Isquemia remoto pode ser confirmada pela perda de pulso através da utilização de Doppler a laser ou ultra-som Doppler 17-19. A temperatura da pele pode ser utilizada como alternativa ao Doppler embora a relação não é linear 20,21. Gravações de temperatura precisas são comuns em laboratórios e lataser facilmente incorporado em estudos isquémicos remotos.
Uma alternativa para a fixação femoral cirurgia é a indução de isquemia através de um torniquete. Garroteamento produz isquemia comparável ao obtido com pinçamento navio; Kutchner et ai. em comparação artéria femoral invasivo de aperto para um torniquete não-invasivo e encontrou os dois métodos interrompido o fluxo de sangue para o membro e reduziu os danos da pele em um modelo de cirurgia plástica de retalho de pele isquemia 18. Cuffing ou a perna ou o braço e aumentar a pressão da braçadeira para acima da pressão arterial sistólica foi encontrada para ser protetor contra o dano isquêmico em suínos e humanos 17,19,22.
Torniquete diferentes abordagens para induzir remoto isquêmico incluem o uso de um manguito de pressão arterial ou um 17,22,23 elástico. No entanto, o uso de uma faixa elástica para induzir isquemia é um método inseguro, potencialmente dar origem a uma quantidade não regulada de pressão nomembro, com aumentos de pressão acima de 500 mmHg a ser gravado em humanos 24. Além disso, a isquemia do membro utilizando uma banda elástica conduz a lesão muscular em ratos, após a remoção da banda 23, como avaliado por Evans Blue Dye, um marcador in vivo de células musculares permeabilidade 25. Em contraste, a entrega de uma pressão controlada para o torniquete pode ser conseguido usando um medidor de pressão ligado a um 17,19,22,26 esfigmomanómetro.
Neste estudo, um modelo de lesão de luz de degeneração de fotorreceptores foi usada para demonstrar a eficácia neuroprotectora de pré-condicionamento isquémico remoto. Remoto isquemia foi induzida imediatamente antes da lesão luz, e impediu subsequente degeneração de fotorreceptores como confirmado por testes de função da retina. O vídeo que acompanha irá demonstrar a aplicação de isquemia remoto não-invasiva.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Declaração de ética: O protocolo segue as diretrizes de cuidados de animais de University of Sydney, AEC # 5657. A anestesia foi aprovado pelo comitê de ética animal (Universidade de Sydney, AEC # 5657).
1. Equipamentos Preparação
- Use rastreamento em tempo real temperatura da pele. Ligue computador e hardware de aquisição de dados.
- Software de gravação de temperatura aberto e ajustar ajuste de temperatura a entre 30-35 ° C e a frequência da amostragem para cada 100 ms.
- Opcional: termômetro retal Inserir para garantir que a temperatura do núcleo permanece estável a 37,5 ° C.
2. Calibração do Manual Sphygmomanometer
- Conecte neonatal braçadeira para sphygmomanometer.Use um manguito de tamanho 2 para um 250-550 g de rato. Um adaptador pode ser necessário ligar o tubo de manguito para o esfigmomanômetro.
- Desinflar o manguito por qualquer afrouxamento da válvula de liberação de ar ou desligar o tubo de manguito da adaptaçãoou. Garantir que não haja pressão permanece na tubulação e a agulha do manômetro repousa em zero dentro do oval / retângulo.
- Verifique a pressão entre tubos, manómetro e braçadeira. Inflar o manguito com bombas suaves do bulbo inflação até que ele lê 100 mmHg no manômetro. Assegurar a pressão permanece constante. Desinflar o manguito abrindo lentamente o valor da liberação do ar.
3. Preparação de animais
Nota: Os animais que devem ser submetidos a lesão luz requerem adaptação escuro a noite antes da isquemia remoto. Animais submetidos a danos leves exigem escuro criação (12 hr luz: ciclo escuro (5 lux))
- Execute isquemia remoto em ambos os roedores acordado ou anestesiados. Certifique-se de que os animais têm um tônus muscular saudável. Garantir isso por beliscar a pata traseira superior para confirmar que não está presente muscular adequado. Proteção induzida por RIP contra a lesão leve foi testado em ratos sedentários até 6 meses de idade.
- Preparação anestesiados para RIP
- Injectar ratos com uma injecção intraperitoneal de 60 mg / kg de cetamina e 5 mg / kg de xilazina. Verifique a profundidade da anestesia através da extensão da perna e que comprime a pele na parte inferior do pé. O animal não tem reflexo se ele está profundamente anestesiado. Aplicar lágrimas artificiais para evitar o ressecamento da córnea, enquanto sob anestesia.
- Coloque ratos em cada uma almofada de calor ou tubos do aquecedor de água de circulação para manter a temperatura corporal constante de 37,5 ° C. Posicione o rato em decúbito ventral com pés de apoio dos membros inferiores para cima. Direito ou membro esquerdo pode sofrer isquemia remoto.
- Awake preparação para RIP
Nota: Awake experimentação animal requer duas pessoas. Uma pessoa restringe o animal ea segunda pessoa opera o esfigmomanômetro manual. Os experimentadores devem estar confiantes para realizar o procedimento de restrição aumenta o risco de ferimentos para os tratadores. Os ratos submetidos a isquemia remoto deve ser condicionada to contenção manual. Dependendo orientações intuitivas contenção manual deve ser progresso de 30 segundos a um máximo de 5 minutos ao longo de um número de semanas. Animais tímidos que não conseguem se aclimatar à contenção manual deve ser excluído da experimentação acordado. Por último, a contenção manual é susceptível de causar estresse (e potencialmente introduzir fatores de confusão para o estudo) para animais e um grupo sham (colocação de manguito sem inflamação) deve ser usado para interpretar com precisão os resultados do estudo RIP.- Cortar uma toalha em uma 15 cm x 30-50 cm de peça e colocar a borda curta perpendicular à lombada do rato, que cobre a cabeça ao topo dos membros posteriores.
- Dobre a borda curta sob o dorso do rato com força e começar a embrulhar o rato com a borda longa remanescente de toalha. Fixe o animal enrolado embaixo do braço em posição supina. Se o rato é realizada sob o braço esquerdo, libertar membro direito do rato a partir da toalha.
4. Aplicação of Temperatura Pele Probe
- Estender a perna do rato, que é submetida a isquemia e colocar a sonda na pele da planta da pata. Posicionar a sonda de pele para maximizar o contacto entre a sonda de temperatura e a pele. Empurre firmemente a sonda na pata e apor a sonda com fita de papel.
- Verifique a colocação da sonda pele, controlando a temperatura no software de gravação de temperatura. Certifique-se de que a temperatura da pele fica entre 30-34 ° C e mantém-se estável. Acompanhe a temperatura da pele por 1-2 min. Ajustar a sonda na pele, se a temperatura é instável ou abaixo de 30 ° C.
5. A isquemia remoto
- Esvaziar a manga e assegurar a válvula de pressão de ar é fechada. Estenda a perna e vagamente cercar a braçadeira no membro posterior superior. Use o dedo indicador e polegar para estender a perna e os dígitos mais baixos para manter a manga na posição afrouxada.
- Aumentar a pressão cuff do animal anestesiado a 160 mmHg, e em animais acordados increase a pressão da braçadeira a 180 mmHg.
Nota: A pressão arterial de ratos anestesiados varia 120-140 mmHg e sobe para 160 mmHg quando estiver consciente. Começar as gravações temporizadas e temperatura pé uma vez que a pressão correcta seja alcançada.
Nota: A temperatura do pé deve cair de 2 ° C após 5 min de pressão constante. - Manter a posição da manga de cima "joelho" do animal durante todo o isquemia. Pressão do balonete começará a cair depois de alguns minutos, ou se o membro do rato está se movendo.
- Repetidamente bombear o bulbo inflação em rajadas curtas para manter a pressão do balonete desejado repetitivo breve explosão de bombeamento
- Isquemia remoto pode ser libertado continuamente para entre 5 e 15 min. O protocolo de reperfusão de isquemia inclui dois períodos de 5 minutos de isquemia com um interveniente 5 min de reperfusão.
- Esvaziar a pressão do balonete, desapertando a válvula de pressão de ar. Verifique a mudança de temperatura ao longo da isquemia prótocol. Solte a braçadeira.
- Continuar com a experimentação lesão. Animais sob o efeito de anestesia terá de ser colocado sobre uma almofada de calor. Continue a acompanhar os animais até ambulatorial. Os animais não podem ser devolvidos à habitação até caminhar.
6. Lesão Light - Degeneração Retinal Modelo
- Escuro adaptar os animais durante a noite (12-15 horas). Imediatamente após isquemia condicionado remoto ou isquemia remoto sham (contenção animal) animais lugar na habitação Perspex com comida e água.
- Ligue iluminação fluorescente (1.000 lux) localizado acima habitação perspex, às 9 horas, durante 24 horas. Após a exposição de luz, retornar os animais para escurecer iluminação cíclico durante 7 dias.
Procedimentos Isquemia 7. Pós-remotos
- Avaliação visão com Eletrorretinograma (ERG):
Nota: O ERG set-up e protocolo de flash seguido Brandli e Pedra 26.- Escuro adaptar animais durante a noite (12-15 h). Debaixodim iluminação vermelha anestesiar os animais por injecção intraperitoneal de cetamina e xilazina (60 mg / kg e 5 mg / kg, respectivamente). Midriático (sulfato de atropina, 1,0%), anestesia corneana (proxymetacaine 0,5%).
- Aplicar a hidratação da córnea (Carbomer polímero) colírio imediatamente na córnea. Aplique gel olho em intervalos de 20 min para manter a hidratação da córnea.
- Desenhar uma linha frouxamente amarrado ao redor do globo ocular para ajudar gravações ERG estáveis. Monitorar a temperatura usando uma sonda retal e manter a temperatura corporal do animal em 37-37,5 ° C.
- Posicionar a cabeça dentro de uma esfera de integração de Ganzfeld.
Nota: O Ganzfeld é um estímulo de luz totalmente programável que fornece uniformes Whit pisca dos LEDs para o olho. - Grave usando o electrorretinograma de 4 mm de platina do eléctrodo positivo feito por encomenda ligeiramente tocar na córnea e um eléctrodo de 2 mm de diâmetro sedimento de Ag / AgCl inseridos na boca. Referência ambos os eléctrodos a uma agulha de aço inoxidávelinserido por via subcutânea na garupa.
- Gravar sinais com ajuste passa-banda de 0.3-1,000 Hz (-3 dB), com uma taxa de aquisição de 2 kHz (AD Instruments). Depois de uma gravação ERG estável é estabelecida assunto o animal a uma adaptação 10 min escuro antes de iniciar as gravações.
- Siga o protocolo de flash como previamente descrito por Brandli e Pedra 26.
- Programar a duração do flash (que usamos flashes 1-2 ms de duração), e defina sua intensidade para -4,4 a 2,0 log scot cd.sm -2. Use flashes brilhantes (2,0 log scot cd.sm -2, 1 ms) para medir a função da retina. Neste estudo é a comparação entre o controle, lesão leve e lesão leve com RIP.
8. Ensaio TUNEL
- Eutanásia animais por injecção intraperitoneal de sobredosagem fenobarbital (100 mg / kg). Enuclear os olhos e corrigir em paraformaldeído a 4%.
- Lavar os olhos em PBS antes cyroprotectingolhos durante a noite em sacarose a 30% (w / v). Incorporar os olhos em composto outubro e corte em 20 mm cortes sagitais, utilizando um criostato.
- Realizar o ensaio TUNEL em secções da retina com coloração DAPI seguindo o protocolo de Maslim et al. 27
- Use microscopia de fluorescência para a contagem de TUNEL da retina. Células TUNEL foram registados a partir de a camada nuclear externa (ONL); a camada mais externa da retina que contém núcleos fotorreceptoras. Neste estudo, as contagens de TUNEL foram feitas em triplicado para cada olho, com cinco olhos para cada grupo de tratamento.
- Use one-way ANOVA para grupo estatística comparar os meios de controle, lesão leve, e de prejuízo + RIP ratos leves.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Um manguito de pressão arterial elevada para acima de 160 mmHg interrompe o fluxo sanguíneo para o membro posterior como pode ser visto claramente na Figura 1B. A falta de oxigenação do tecido resultou numa redução da temperatura do pé do animal por um protocolo de isquemia-reperfusão (Figura 2). A temperatura do pé (33 ° C) foi menor do que a temperatura do núcleo e reduzida de forma fiável durante a elevação da pressão do balonete (31 ° C), aumentando quando a braçadeira foi esvaziado (32 ° C). Um único 1.000 lux lesão leve foi entregue a dim levantou ratos albinos com ou sem pré-condicionamento isquêmico remoto. A função da retina foi gravada e avaliada usando o eletrorretinograma (ERG).
O ERG é o somatório das respostas eléctricos provenientes dos neurónios interiores e exteriores da retina para a estimulação pela luz, como mostrado na Figura 3. A forma de onda do ERG tem um pico negativo precoce decorrente de fototransdução (mínimo de cerca de 10 mseg após light flash) denominou a uma onda e um grande pico positivo da retina interna (máximo de aproximadamente 80 ms depois de o flash de luz) denominou a onda b. O ERG de adaptação ao escuro de um dim normais levantou rato mostrou um grande fotorreceptores e resposta da retina interna a um -2 flash brilhante cd.sm 2,0 log (Figura 3A). Uma semana após lesão leve as gravações ERG teve uma severa redução na amplitude em relação aos controles, refletindo a perda de fotorreceptores; veja a Figura 3B. Pré-condicionamento do membro posterior com isquemia usando um protocolo de reperfusão de 2 x 5 min imediatamente antes da isquemia protegeu os fotorreceptores da lesão leve. As amplitudes RIP ERG foram superiores a lesão luz sozinha, com uma ligeira redução ao ver uma onda (Figura 3C). Desoxinucleotidil transferase dUTP nick rotulagem final Terminal (TUNEL) ensaio em seções criopreservados da retina confirmou uma redução de células apoptóticas em animais danificadas luz recebendo rel RIPAtivE a sham animais tratados com ligeira lesão (Figura 4).
A indução de isquemia de membro posterior baseia-se no posicionamento correcto da braçadeira, como pode ser visto na Figura 1. Um manguito colocado abaixo do "joelho" não protege os fotorreceptores da lesão luz reflectida nas redução na amplitude do ERG, ver Figura 3D.
Em conclusão, quando administrada correctamente a isquemia do membro posterior foi capaz de proteger os neurónios da retina de lesão luz.
Figura 1:. Colocação Cuff e efeito da pressão do balonete acima de 160 mmHg (A) Mostra o membro posterior e pé antes elevação da pressão do balonete. (B) Mostra o pé durante a elevação da pressão do balonete acima de 160 mmHg. Note-se a posição da braçadeira acima da "k nee ". Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:. Pé temperatura é reduzida durante a inflação do manguito inflação do manguito em membro posterior para 2 x 5 min a 160 mmHg redução da temperatura da pele durante a isquemia. (A) mostra a média do grupo para 2 x 5 min RIP pé mudanças de temperatura. (B) Mostra uma temperatura pé representante (° C) rastreamento para 2 x 5 min de isquemia. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
00 "/>
Figura 3:. PIR preserva a função da retina, como demonstrado no ERG em comparação com ratos danos de luz de exposição à luz brilhante durante 24 hr dano, as células fotorreceptoras da retina. O ERG mede a integridade da retina interna e externa, como uma resposta eléctrica (microvolts [mV]) para a estimulação pela luz. A resposta normal da retina para cd.sm 2,0 log -2 estimulação luminosa visto em (A). Danos de fotorreceptores de luz resultados brilhantes em uma menor amplitude do ERG (B). RIP foi capaz de resgatar os fotorreceptores após lesão leve (C). Colocação do manguito incorreta durante RIP não protege fotorreceptores da lesão (D). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
"Width =" 600 4highres.jpg "/>
Figura 4: TUNEL + contagens de células. Um gráfico de barras comparando resultado grupo para lesão leve, lesão + RIP demonstrar a redução da apoptose de células com TUNEL + RIP. Foram contadas ao longo de toda a extensão da retina (8.000 m). Painel superior: grupo média de células TUNEL + RIP foram menores para os ratos tratados (210 ± 4,9, n = 5) em relação à lesão luz sozinho (255 ± 10, n = 5), p <0,01, ANOVA de uma via. Retina danificado (nenhum prejuízo luz) tinha muito baixo (3,0 ± 1,4, n = 5) células apoptóticas. (A) Imagem representativa de luz superior retina feridos. (B) Imagem representativa de RIP-luz superior retina feridos. (C) imagem Representante da luz inferior feridos retina. (D) imagem Representante inferior RIP-luz retina ferido. Por favor clique aqui para ver uma versão maior destafigura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Roedor membro posterior isquemia foi induzida com sucesso com um esfigmomanômetro e algemá entregar neuroproteção para os fotorreceptores da retina. Um achado consistente com o condicionamento induzido proteção isquêmico de fotorreceptores de uma lesão leve 9,28.
Essencialmente, isquemia remoto faz com que a privação breve oxigênio aos tecidos. Assim, o pré-condicionamento isquémico remoto tem muitas semelhanças com o condicionamento isquémico ou alternativamente denominado tolerância isquémico, pré-condicionamento hipóxica, e, em certa medida, o exercício anaeróbico. Células respondem à desafio isquêmica pela liberação de uma grande variedade de proteínas, nucleosídeos e transcrição fatores que quer oferecer neuroproteção direta ou afetam as células se tornam tolerantes a subsequente estresse metabólico 13.
Na literatura, os protocolos de isquemia remotos têm incluído uma gama de frequências e durações. Nosso laboratório testou 5, 10,e 2 x 5 min protocolos de isquemia sobre a função normal da retina 26. Destes protocolos 2 x 5 minutos produziu a maior mudança de amplitude do ERG em ratos normais e foi escolhido para testar num modelo de lesão de luz. Eventos isquémicos 5 min curtos e repetidos têm também mostrado ser preventiva em acidentes vasculares cerebrais recorrentes nos seres humanos e para reduzir o tamanho do enfarte em acidente vascular cerebral experimental em porcos 17,22. No entanto, a duração mais apropriada de pré-condicionamento isquémico é provável que seja dependente do modelo animal usado. Por exemplo, uma redução da dimensão do enfarte contra isquemia focal foi observado em mais de 2 x 15 min e 3 x 15 min protocolos, mas não em 3 x 5 min protocolos em ratos 15.
O tempo entre IP e lesão isquémica também tem de ser considerado para a neuroprotecção eficaz. Duas janelas de tempo foram classificados para protecção cardíaca induzida por IP. Estas são a janela "condicionamento clássico", que ocorre após 0-12 h e IPa "segunda janela", que ocorre 3-4 dias após o IP 29. Em um modelo de acidente vascular cerebral focal, RIP foi encontrado para ser protetora em vários pontos de tempo, incluindo aqueles que estão fora do clássico e janelas do segundo 15. No entanto, há poucos estudos que compararam os períodos de tempo de neuroproteção em RIP e IP.
Uma outra consideração para a proteção isquemia remoto é o timing do condicionamento, incluindo se ela é aplicada antes da lesão (pré-condicionamento) ou após a lesão (pós-condicionamento). A maioria dos testes de isquemia remoto foi utilizado pré-condicionamento, apesar de estudos pós-condicionamento de ter sido recentemente encontrada para ser protetor de ambos os neurônios da retina e cerebrais 30,31.
Em resumo, a indução de neuroprotecção no membro posterior condicionamento isquémico é específico para o modelo de doença, da espécie animal, o período de isquemia, e o tempo de isquemia. Uma revisão por Kaniora et al. pferece mais detalhes sobre a variedade de protocolos remotos isquemia, incluindo a espécie, protocolos RIP, sites de RIP, modelos de lesão, consequências das lesões e mecanismos de proteção propostos 32.
O manguito minimamente invasivo no membro posterior permite RIP em ambos acordados e animais desde que a temperatura do corpo é mantida. Em experimentação anestesiado, a temperatura corporal do animal deve ser mantida para evitar a hipotermia. Monitoramento da temperatura interna irá impedir que o animal submetido a hipotermia ou hipertermia. Hipotermia e hipertermia são bem conhecidas estímulos de pré-condicionamento em ambos os modelos de AVC e lesão leve 33-36. O método JoVE apresentados podem ser realizados em animais acordados, impedindo assim confunde temperatura corporal.
Anestésicos podem introduzir um conjunto diferente de fatores de confusão na experimentação RIP. Isoflurano pode participar de proteção miocárdica por meio da abertura de ch potássio sensível ao ATPannels, um mecanismo de proteção semelhante relatado na condicionamento isquêmico 37. Embora o tamanho do enfarte em modelos de acidente vascular cerebral continua a ser grande em animais tratados de forma simulada os dados de isoflurano, o mecanismo molecular subjacente condicionamento isquémico remoto pode ser mascarado pelos efeitos dos anestésicos. A cetamina, um antagonista de NMDA, tem uma multiplicidade de efeitos protectores in vivo, incluindo o 38 potencial para prevenir a excitotoxicidade neurónios, activam a via mTOR e libertar o BDNF no soro 39-41. A cetamina foi relatado para aumentar a sobrevivência neuronal após trauma cerebral em humanos e reduzir a lesão na luz fotorreceptores roedor 42,43. As investigações sobre o mecanismo de condicionamento isquêmico remoto com cuffing pressão arterial acordado vai evitar confunde anestésicos.
Isquemia dos membros posteriores eficaz baseia-se na colocação correta do manguito, a consistência da pressão do balonete e elevação da pressão do balonete acima sistolic pressão arterial como pode ser visto na Figura 1. Um manguito colocado abaixo do "joelho" não protege os fotorreceptores da lesão luz reflectida nas amplitudes reduzida electrorretinograma (ERG). A diferença no condicionamento com base na posição da braçadeira é provavelmente devido a diferenças na massa muscular e da proximidade à artéria femoral. Além disso, os animais devem ser padronizadas para a idade, peso, temperatura corporal e de gênero.
Em resumo, isquemia remoto pode ser induzida por uma braçadeira de pressão sanguínea não invasiva, o que evita a lesão muscular e tem a flexibilidade de experimentação acordado ou anestesiados. Pré-condicionamento isquêmico remoto é uma estratégia de neuroproteção emergentes e este protocolo irá permitir mais estudos sobre seus mecanismos e aplicações.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gold series DuraShock hand aneroid sphygmomanometer | Welch Allyn | DS56 | Manual Sphygmomanometer |
| Neonate [size 2] 1 tube, 10 pack | Welch Allyn | 5082-102-1 | Limb blood pressure cuff |
| Luer lock adaptor | Welch Allyn | 5082-178 | Adaptor for neonatal cuff |
| Thermistor pod | AD Instruments | ML 309 | skin tempertature unit |
| Skin temperture probe | AD Instruments | MLT 422/A | |
| Powerlab, 4 channel acquistion hardware | AD Instruments | PL 35044 | |
| Homeothermic blanket system with flexible probe | Harvard Appartus | 507222F | |
| Towel | optional: awake remote ischemia | ||
| Isoflo - 100% Isoflurane (250 ml) | Abbot Animal Health | 05260-05 | optional: inhaltion anaesthetic remote ischemia |
| Ketamil - ketamine 100 mg/ml (50 ml) | Troy Laboratories Pty Ltd | optional: injectable anaesthetic remote ischemia | |
| Xylium - Xylazine 100 mg/ml (50 ml) | Troy Laboratories Pty Ltd | optional: injectable anaesthetic remote ischemia |
References
- Meller, R., Simon, R. P. Tolerance to Ischemia-an Increasingly Complex Biology. Translational Stroke Research. 4 (1), 40-50 (2013).
- Sun, J., et al. Protective effect of delayed remote limb ischemic postconditioning: role of mitochondrial K-ATP channels in a rat model of focal cerebral ischemic reperfusion injury. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (5), 851-859 (2012).
- Harkin, D. W., D'Sa, A., McCallion, K., Hoper, M., Campbell, F. C. Ischemic preconditioning before lower limb ischemia-reperfusion protects against acute lung injury. Journal of Vascular Surgery. 35 (6), 1264-1273 (2002).
- Murry, C. E., Jennings, R. B., Reimer, K. A. Preconditioning with ischemia -A delay of lethal cell injury in ischemic myocardium. Circulation. 74 (5), 1124-1136 (1986).
- Barone, F. C., et al. Ischemic preconditioning and brain tolerance - Temporal histological and functional outcomes, protein synthesis requirement, and interleukin-1 receptor antagonist and early gene expression. Stroke. 29 (9), 1937-1950 (1998).
- Roth, S., et al. Preconditioning provides complete protection against retinal ischemic injury in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (5), 777-785 (1998).
- Wegener, S., et al. Transient ischemic attacks before ischemic stroke: Preconditioning the human brain? A multicenter magnetic resonance imaging study. Stroke. 35 (3), 616-621 (2004).
- Weih, M., et al. Attenuated stroke severity after prodromal TIA - A role for ischemic tolerance in the brain. Stroke. 30 (9), 1851-1854 (1999).
- Casson, R. J., Wood, J. P. M., Melena, J., Chidlow, G., Osborne, N. N. The effect of ischemic preconditioning on light-induced photoreceptor injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (3), 1348-1354 (2003).
- Ettaiche, M., et al. ATP-sensitive potassium channels (K-ATP) in retina: a key role for delayed ischemic tolerance. Brain Research. 890 (1), 118-129 (2001).
- Gross, E. R., Gross, G. J. Ligand triggers of classical preconditioning and postconditioning. Cardiovascular Research. 70 (2), 212-221 (2006).
- Heurteaux, C., Lauritzen, I., Widmann, C., Lazdunski, M. Essential role of adenosine, adenosine-A1-receptors, and ATP-senstive K+ channels in cerebral ischemic preconditioning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (10), 4666-4670 (1995).
- Dirnagl, U., Simon, R. P., Hallenbeck, J. M. Ischemic tolerance and endogenous neuroprotection. Trends in Neurosciences. 26 (5), 248-254 (2003).
- Ren, C., et al. Remote ischemic post-conditioning reduced brain damage in experimental ischemia/reperfusion injury. Neurol Res. 33 (5), 514-519 (2011).
- Ren, C., Gao, X., Steinberg, G. K., Zhao, H. Limb remote-preconditioning protects against focal ischemia in rats and contradicts the dogma of therapeutic time windows for preconditioning. Neuroscience. 151 (4), 1099-1103 (2008).
- Hu, S., et al. Noninvasive limb remote ischemic preconditioning contributes neuroprotective effects via activation of adenosine A1 receptor and redox status after transient focal cerebral ischemia in rats. Brain Research. 1459, 81-90 (2012).
- Jensen, H. A., et al. Remote Ischemic Preconditioning Protects the Brain Against Injury After Hypothermic Circulatory Arrest. Circulation. 123 (7), 714-721 (2011).
- Kuntscher, M. V., et al. Ischemic preconditioning by brief extremity ischemia before flap ischemia in a rat model. Plastic and Reconstructive Surgery. 109 (7), 2398-2404 (2002).
- Kharbanda, R. K., et al. Transient limb ischemia induces remote ischemic preconditioning in vivo. Circulation. 106 (23), 2881-2883 (2002).
- Perl, W., Cucinell, S. A. LOCAL BLOOD FLOW IN HUMAN LEG MUSCLE MEASURED BY A TRANSIENT RESPONSE THERMOELECTRIC METHOD. Biophysical Journal. 5 (2), 211-230 (1965).
- Vuksanovic, V., Sheppard, L. W., Stefanovska, A. Nonlinear relationship between level of blood flow and skin temperature for different dynamics of temperature change. Biophysical Journal. 94 (10), L78-L80 (2008).
- Meng, R., et al. Upper limb ischemic preconditioning prevents recurrent stroke in intracranial arterial stenosis. Neurology. 79 (18), 1853-1861 (2012).
- Souza, M. V. P., et al. Hind limb ischemic preconditioning induces an anti-inflammatory response by remote organs in rats. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 42 (10), 921-929 (2009).
- Hixson, F. P., Shafiroff, B. B., Werner, F. W., Palmer, A. K. DIGITAL TOURNIQUETS - A PRESSURE STUDY WITH CLINICAL RELEVANCE. Journal of Hand Surgery-American. 11A (6), 865-868 (1986).
- Hamer, P. W., McGeachie, J. M., Davies, M. J., Grounds, M. D. Evans Blue Dye as an in vivo marker of myofibre damage: optimising parameters for detecting initial myofibre membrane permeability. Journal of Anatomy. 200 (1), 69-79 (2002).
- Brandli, A., Stone, J. Remote ischemia influences the responsiveness of the retina: observations in the rat. Invest Ophthal Vis Sci. 55 (4), (2014).
- Maslim, J., Valter, K., Egensperger, R., Hollander, H., Stone, J. Tissue oxygen during a critical developmental period controls the death and survival of photoreceptors. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 38 (9), 1667-1677 (1997).
- Grimm, C., et al. HIF-1-induced erythropoietin in the hypoxic retina protects against light-induced retinal degeneration. Nature Medicine. 8 (7), 718-724 (2002).
- Vander Heide, R. Clinically Useful Cardioprotection: Ischemic Preconditioning Then and Now. Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 16 (3-4), 251-254 (2011).
- Zhou, Y. L., et al. Remote Limb Ischemic Postconditioning Protects Against Neonatal Hypoxic-Ischemic Brain Injury in Rat Pups by the Opioid Receptor/Akt Pathway. Stroke. 42 (2), 439-444 (2011).
- Hasegawa, J., Obara, T., Tanaka, K., Tachibana, M. High-density presynaptic transporters are required for glutamate removal from the first visual synapse. Neuron. 50 (1), 63-74 (2006).
- Kanoria, S., Jalan, R., Seifalian, A. M., Williams, R., Davidson, B. R. Protocols and mechanisms for remote ischemic preconditioning: A novel method for reducing ischemia reperfusion injury. Transplantation. 84 (4), 445-458 (2007).
- Maier, C. M., et al. Optimal depth and duration of mild hypothermia in a focal model of transient cerebral ischemia - Effects on neurologic outcome, infarct size, apoptosis, and inflammation. Stroke. 29 (10), 2171-2180 (1998).
- Reith, J., et al. Body temperature in acute stroke: Relation to stroke severity, infarct size, mortality, and outcome. Lancet. 347 (8999), 422-425 (1996).
- Barbe, M. F., Tytell, M., Gower, D. J., Welch, W. J. HYPERTHERMIA PROTECTS AGAINST LIGHT DAMAGE IN THE RAT RETINA. Science. 241 (4874), 1817-1820 (1988).
- Wang, X. D., et al. Neuronal degradation in mouse retina after a transient ischemia and protective effect of hypothermia. Neurological Research. 24 (7), 730-735 (2002).
- Tonkovic-Capin, M., et al. Delayed cardioprotection by isoflurane: role of K(ATP) channels. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 283 (1), H61-H68 (2002).
- Pfenninger, E., Himmelseher, S. Neuroprotective effects of ketamine on a cellular level. Anaesthesist. 46, S47-S54 (1997).
- Hirose, K., Chan, P. H. BLOCKADE OF GLUTAMATE EXCITOTOXICITY AND ITS CLINICAL-APPLICATIONS. Neurochemical Research. 18 (4), 479-483 (1993).
- Welberg, L. Psychiatric disorders: Ketamine modifies mood through mTOR. Nature reviews. Neuroscience. 11 (10), 666 (2010).
- Garcia, L. S. B., et al. Acute administration of ketamine induces antidepressant-like effects in the forced swimming test and increases BDNF levels in the rat hippocampus. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry. 32 (1), 140-144 (2008).
- Wassle, H. Parallel processing in the mammalian retina. Nature Reviews Neuroscience. 5 (10), 747-757 (2004).
- Hertle, D. N., et al. Effect of analgesics and sedatives on the occurrence of spreading depolarizations accompanying acute brain injury. Brain. 135, 2390-2398 (2012).
