Summary
Удаленный ишемического прекондиционирования (RIP) является методом кондиционирования тканей от повреждающего стресса. Мы создали метод дистанционного ишемии в задней конечности, с помощью раздувания манжеты сфигмоманометра в течение 5-10 мин. Нейрозащитные возможности RIP были продемонстрированы на модели дегенерации сетчатки у грызунов.
Abstract
Сублетальная ишемии защищает ткани от последующих, более тяжелой ишемии через повышающей регуляции эндогенных механизмов в пораженной ткани. Сублетальная ишемии также было показано, активируют защитные механизмы в отдаленных тканей. Короткий период ишемии (5-10 мин) в задней конечности млекопитающих вызывает самозащиты ответов в мозге, легких, сердца и сетчатки. Эффект известен как удаленный ишемической предварительной (RIP). Это терапевтически перспективным способом защиты жизненно важные органы, и уже в клинических испытаниях для сердца и травмы головного мозга. Эта публикация показывает, контролируемый минимально инвазивной способ изготовления конечность - в частности заднюю конечность крысы - ишемический. Кровяного давления манжеты разработаны для использования в человеческих новорожденных подключен к ручной сфигмоманометра и используется для применения 160 мм рт.ст. давление вокруг верхней части задней конечности. Зонд предназначен для обнаружения температуры кожи используется для проверки ischemi, путем записи падение температуры кожи, вызванного давлением, вызванной закупоркой артерий голени и повышение температуры, которое следует высвобождение манжеты. Этот метод RIP обеспечивает защиту в сетчатке крыс от яркого света и повреждений, вызванных дегенерацией.
Introduction
Выживание наиболее, возможно, все, ткани в условиях метаболического стресса может быть улучшена путем предварительного кондиционирования с периодом ишемии сублетальных 1,2. Ишемического прекондиционирования (ИП) с практической точки зрения является воздействие на ткани сублетальных ишемии, перед опытом ткани более тяжелые стрессоров, таких как последующего ишемического инсульта. В моделях животных, IP-обеспечивает поразительное защиту головного мозга, сетчатки, сердца и легких 3-6. Соответственно, наблюдения пациентов, перенесших инсульт в показали связь между предыдущими транзиторных ишемических атак и более клинических исходов 7,8. ИС также защищает от фоторецепторов сетчатки неишемических травм 9.
Эффективность ИС в различных тканях и травм показывает, что он активации врожденного механизма выживания клеток присутствует во всех тканях. Ишемического прекондиционирования миокарда было предложено иметь защитный эффект позитивной регуляции черезиз индуцируемого гипоксией фактор (HIF), как известно, регулируют множество метаболических путей через выпуск аденозина или через отверстие митохондриальных АТФ калиевых каналов 10,11. Аденозин и АТФ-релиз калиевые каналы участвуют в церебральной ишемии, но, расследования Нейрозащитные механизмов ишемического кондиционирования на сегодняшний день были сосредоточены на модификации анти-Эксайтотоксичность, антиапоптотических и анти-воспалительных путей 12,13. В целом, понимание молекулярной ишемической процесса кондиционирования для защиты нейронов ограничена.
Удаленные ишемические попытки предварительной подготовки, чтобы обусловить отдаленные критически важные органы (сердце, головной мозг, легкие) от генерации ишемии менее важных тканей. Удаленный ишемического прекондиционирования (RIP) с помощью задних конечностей была продемонстрирована нейропротекторное в моделях грызунов инсульта 14-17. Метод, описанный нами обеспечивает простой, надежный и неинвазивный протocol для индукции RIP.
Подавляющее большинство протоколов RIP включать заднюю конечность, по-видимому, потому что бедренная артерия расположена в верхней задней конечности могут быть легко идентифицированы и доступны для хирургического зажима и использования жгута. В инвазивные конечностей ишемических исследований по изучению мозга и защиты кожи, ишемию индуцируют путем разделения бедренную артерию от паха связок и зажима бедренную артерию 2,15,18.
Ишемия в результате либо конечности наручников или бедренной артерии зажима была подтверждена изменений на конечности, включая потерю импульса, снижение оксигенации и снижение температуры кожи. Удаленная ишемия может быть подтверждено потери пульса с помощью лазерной доплеровской или Ультразвуковые 17-19. Температура кожи может быть использован в качестве альтернативы доплеровского хотя отношения является нелинейным 20,21. Точные температурные записи являются обычным явлением в лабораториях и банкибыть легко включены в отдаленных ишемических исследований.
Альтернативой бедренной зажима хирургию индукции ишемии с использованием жгут. Турникет приложение производит сопоставимое ишемии, что достигается с судна зажима; Kutchner др. по сравнению инвазивной бедренную артерию зажима для неинвазивного жгута и нашел оба метода остановился поток крови к конечности и снижение повреждения кожи в пластической хирургии модели кожного лоскута ишемии 18. Наручников либо ногу или руку и повышения давления манжеты до выше систолического артериального давления было установлено, защищает от ишемического повреждения у свиней и людей 17,19,22.
Различные подходы к жгут индукции дистанционного ишемическая включают в себя использование манжеты кровяного давления или резинкой 17,22,23. Тем не менее, использование резинке, чтобы вызвать ишемию является небезопасным методом, потенциально порождая нерегулируемого количества давления вконечностей, с повышением давления выше 500 мм рт.ст. записывается в людях 24. Кроме того, ишемия конечности с помощью резинку приводит к повреждению мышц у крыс после удаления полосы 23, как оценивается Эванс синий краситель, с маркером в естественных условиях мышечное волокно проницаемости 25. В противоположность этому, поставка регулируемым давлением до жгута может быть достигнуто с помощью кровяного давления манжеты, соединенный с сфигмоманометра 17,19,22,26.
В этом исследовании, легкая модель травмы дегенерации фоторецептора был использован, чтобы продемонстрировать нейропротекторный эффективность дистанционного ишемической предварительной. Удаленная ишемия была вызвана непосредственно перед легкой травмы, и предотвратить последующее дегенерацию фоторецепторов, что подтверждается сетчатки функции тестирования. Сопровождающие видео демонстрации применения неинвазивного дистанционного ишемии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Заявление по этике: протокол следующим рекомендациям по уходу животное Университета Сиднея, AEC # 5657. Анестезия была одобрена комитетом по этике животных (Университет Сиднея, AEC # 5657).
1. Оборудование Подготовка
- Используйте отслеживание температуры кожи в режиме реального времени. Включите компьютер, и аппаратные средства сбора данных.
- Открыть температура программное обеспечение для записи и регулировать настройки температуры до 30-35 ° С и частоту дискретизации до 100 мс каждые.
- Дополнительно: Вставьте ректального термометра, чтобы обеспечить внутреннюю температуру остается стабильным при температуре 37,5 ° С.
2. Калибровка вручную Сфигмоманометр
- Подключите новорожденных манжету sphygmomanometer.Use в размер 2 манжеты для 250-550 г крысы. Адаптер может быть необходимо подключить трубки манжеты к сфигмоманометра.
- Выпустите манжету либо ослабления воздушный клапан или отсоединением трубки манжеты из адаптироватьсяили. Убедитесь в отсутствии давления остается в трубке и манометр игла упирается в ноль внутри овала / прямоугольника.
- Проверьте давление между насосно-компрессорных труб, манометром и манжеты. Манжету с нежными насосов инфляции лампы, пока не читает 100 мм рт.ст. на манометр. Убедитесь, что давление остается постоянным. Выпустите манжету, медленно открывая значение выпуска воздуха.
3. Подготовка животных
Примечание: животные, которые пройти света травмы требуют адаптации темный ночью дистанционного ишемии. Животные, подвергающиеся ущерб света требуют темно воспитанию (12 ч свет: темно цикл (5 лк))
- Выполните дистанционного ишемии либо активных или обезболивание грызунов. Убедитесь, что у животных есть здоровый тонус мышц. Убедитесь в этом, зажимая верхнюю заднюю конечность, чтобы подтвердить имеется достаточно присутствовать мышцы. RIP-индуцированной защита от легкого вреда был протестирован в оседлых крыс до 6-месячного возраста.
- Обезболивание подготовка к RIP
- Вводят крыс путем внутрибрюшинной инъекции 60 мг / кг кетамина и 5 мг / кг ксилазина. Проверьте глубину анестезии, расширяя ногу и щипать кожу на нижней части ноги. Животное не имеет рефлекс, если он глубоко обезболивание. Применить искусственные слезы, чтобы избежать сухости роговицы в то время под наркозом.
- Поместите крыс либо на площадку тепла или оборотной воды нагреватель трубы для поддержания постоянной температуры тела 37,5 ° С. Расположите крысу в положении лежа с ног колодки нижних конечностей вверх. Либо правой или левой конечности может пройти дистанционное ишемии.
- Пробудитесь подготовка к RIP
Примечание: Пробудитесь эксперименты на животных требуется два человека. Один человек сдерживает животное и второй человек работает ручной сфигмоманометром. Экспериментаторы должны быть уверены, чтобы выполнить процедуру, как сдержанность увеличивает риск травмы обработчиков. Крысы, подвергающиеся ишемии дистанционного должны быть выдержаны тО Руководство сдержанность. В зависимости от интуитивных принципов эксплуатации сдержанность должна быть прогресса от 30 сек до максимум 5 мин в течение ряда недель. Робкие животные, которые не акклиматизироваться к ручному ограничений должны быть исключены из активного экспериментирования. Наконец, руководство сдержанность может вызвать стресс (и, возможно, ввести смешивает в исследовании) к животным и фиктивный когорту (размещение манжеты без воспаления) должны быть использованы, чтобы точно интерпретировать результаты RIP исследования.- Вырезать полотенце в 15 см х 30-50 см кусок и поместить короткий край перпендикулярно к позвоночнику крысы, покрывая голову, чтобы в верхней части задних конечностей.
- Заправьте короткий край под туловище крысы плотно и начать обернуть крысы с оставшимся длинного края полотенце. Закрепите завернутый животное под рукой в положении лежа на спине. Если крыса проходит под левую руку, правую конечность свободно крысы из полотенца.
4. Применение Ое температуры кожи зонда
- Продлить ногу крысы, который должен пройти ишемии и поместить зонд кожи на подушечку. Поместите зонд кожи, чтобы максимизировать контакт между датчиком температуры и кожи. Плотно вставьте щуп в подушечку лапы и прикрепить датчик с бумажной лентой.
- Проверьте размещение зонда кожи путем отслеживания температуры на программное обеспечение для записи температуры. Убедитесь, что температура кожи между 30-34 ° С и остается стабильной. Отслеживание температуры кожи в течение 1-2 мин. Регулировка зонда кожи, если температура является нестабильным или ниже 30 ° С.
5. Дистанционное ишемии
- Выпустите манжету и обеспечить клапан давления воздуха закрыт. Продлить ногу и свободно облегать манжету на верхней задней конечности. Используйте указательный и большой палец, чтобы продлить ногу и нижние цифры, чтобы освободившуюся манжету в положении.
- Поднять давление в манжете в обезболивание животного до 160 мм рт.ст., а у бодрствующих животных растет в ценеаза давления манжеты до 180 мм рт.
Примечание: обезболивание кровяное давление у крыс колеблется от 120-140 мм рт.ст. и поднимается до 160 мм рт когда в сознании. Начать таймера и температуры ног записи сразу правильное давление достигается.
Примечание: температура нога должна упасть на 2 ° С, после 5 мин постоянном давлении. - Поддерживать позицию выше животного "колена" на протяжении ишемии манжеты. Давление в манжете начнет падать после нескольких минут, или если конечности крысы движется.
- Неоднократно насос для накачивания лампу в виде коротких пакетов, чтобы поддерживать требуемое давление в манжете повторяющийся короткий всплеск накачки
- Удаленный ишемии могут быть доставлены непрерывно в течение от 5 до 15 мин. Протокол ишемии реперфузии включает 2 периода 5 мин ишемии с промежуточным 5 мин реперфузии.
- Выпустите давление в манжете, ослабив клапан давления воздуха. Проверка изменения температуры в течение ишемии протокол. Отпустите манжету.
- Продолжайте травмы экспериментов. Животные под действием анестезии должны быть помещены на площадку тепла. Продолжайте следить животных, пока амбулаторно. Животные не могут быть возвращены в корпусе до тех пор, ходьбе.
6. Свет Травмы - дегенерация сетчатки Модель
- Темно-адаптировать животных в течение ночи (12-15 ч),. Сразу же после дистанционного кондиционирования ишемии или фиктивный дистанционного ишемии (животное) сдержанность место животных в плексигласа жилья с пищей и водой.
- Включите флуоресцентного освещения (1000 лк), расположенного выше плексигласа жилья в 9 часов утра в течение 24 часов. После воздействия света, вернуть животных, чтобы затемнить циклического освещения в течение 7 дней.
7. После удаленные процедуры ишемии
- Оценка Видение с электроретинограммы (ЭРГ):
Примечание: ЭРГ настройки и протокол флэш последующим Brandli и камень 26.- Темно-адаптировать животных в течение ночи (12-15 ч). Подяркость красного освещения анестезию животных путем внутрибрюшинной инъекции кетамина и ксилазина (60 мг / кг и 5 мг / кг, соответственно). Расширением зрачка (атропина сульфат 1,0%), роговицы анестетик (proxymetacaine 0,5%).
- Применение роговицы гидратации (карбомер полимер) глазные капли немедленно роговицы. Применить гель для глаз на 20-минутные интервалы для поддержания роговицы гидратации.
- Нарисуйте свободно привязанную нить вокруг глазного яблока, чтобы помочь стабильные записи ЭРГ. Монитор температуры с помощью ректального зонда и поддерживать температуру тела животного на 37-37.5 ° C.
- Расположите голову внутри Ganzfeld интегрирующей сферы.
Примечание: Ganzfeld является полностью программируемым световой раздражитель, который обеспечивает единые ничуть мигает с светодиодов в глаза. - Запишите электроретинограммы используя заказные 4 мм платины положительный электрод слегка касаясь роговицы и 2 мм диаметром Ag / AgCl электрода осадок, вставленный в рот. Ссылка оба электрода с иглой из нержавеющей сталивставляется подкожно в крупу.
- Запись сигналов с настройкой полосовой из 0.3-1,000 Гц (-3 дБ), уровень сбора 2 кГц (AD инструментов). После стабильной записи ЭРГ установлено субъекту животное к 10 мин темновой адаптации перед началом записи.
- Следуйте протокол флэш, как описано ранее Brandli и камень 26.
- Программирование длительности вспышки (мы использовали мигает 1-2 мсек длительности), и установите его интенсивность в -4.4 до 2.0 Журнал шотландец cd.sm -2. Используйте яркие вспышки (Вход 2.0 шотландец cd.sm -2, 1 мс) для измерения функции сетчатки. В этом исследовании это сравнение между контролем, легкого вреда здоровью и легкого вреда здоровью с RIP.
8. Анализ TUNEL
- Эвтаназии животных внутрибрюшинной инъекцией фенобарбитала передозировки (100 мг / кг). Выяснять глаза и зафиксировать в 4% параформальдегида.
- Вымойте глаза PBS, прежде чем cyroprotectingглаза в течение ночи в 30% сахарозы (масса / объем). Вставить глаза в октябре соединения и сократить на 20 мкм сагиттальных срезах с помощью криостата.
- Выполните TUNEL анализ на сетчатке секций с окрашиванием DAPI в соответствии с протоколом о Maslim др. 27
- Использование флуоресцентной микроскопии для TUNEL пунктам сетчатки. TUNEL клетки были зафиксированы от наружного ядерного слоя (ONL); Наружный слой сетчатки, который содержит фоторецепторов ядра. В этом исследовании, на счету TUNEL были сделаны в трех экземплярах для каждого глаза, с 5 глаза для каждой группы обработки.
- Используйте одностороннюю ANOVA статистической сравнивать группы средств управления, легкого вреда здоровью, и легкими травмами + RIP крыс.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Манжета для измерения кровяного давления повышен выше 160 мм рт.ст. останавливает приток крови к задней конечности, как показано на рисунке четко 1В. Отсутствие оксигенации тканей в результате снижения температуры ног животного для протокола ишемии-реперфузии (рис 2). Температура футов (33 ° С) была ниже, чем внутренняя температура и надежно уменьшается во время подъема давления манжеты (31 ° C) восходящего когда манжета была спущена (32 ° С). Один 1000 лк легкий вред здоровью был доставлен в тусклый поднял белых крыс с или без дистанционного ишемической предварительной. Функции сетчатки был записан и оценивали с помощью электроретинограммы (ERG).
ЭРГ суммирования электрических ответов, происходящих из внутренних и внешних нейронов сетчатки к световой стимуляции, как показано на рисунке 3. ЭРГ сигнала имеет раннее отрицательный пик, вытекающие из фототрансдукции (минимум примерно 10 мс после светодиодныет флэш) называется а-волну и большой положительный пик с внутренней сетчатки (максимум примерно 80 мс после вспышки света) называют б-волну. Темно-адаптированы ЭРГ от нормального DIM поднял крысы показали большой фоторецептор и внутренний сетчатки ответ на ярком журнала 2.0 cd.sm -2 вспышки (рис 3А). Один неделю после легкого вреда эти записи ERG была тяжелой сокращение амплитуды по отношению к контрольной, отражающий потерю фоторецепторов; рис 3B. Предварительная подготовка заднюю конечность с ишемией с использованием протокола реперфузии 2 х 5 мин непосредственно перед ишемией защищены фоторецепторы от света травмы. Амплитуды RIP ERG были больше, чем только легкого вреда, с незначительным снижением на волны епархии (рис 3C). Терминал дезоксинуклеотидилтрансферазы дУТФ ник конец маркировка (TUNEL) анализ на криоконсервированных разделах сетчатки подтвердили снижение апоптоза клеток в легких поврежденных животных, получавших RIP отнтельной в Шам-обработанные легкие травмы животных (Рисунок 4).
Индукция ишемии задней конечности опирается на правильное размещение манжеты, как показано на рисунке 1. Манжета находится ниже «колена» не защищает фоторецепторы от света травмы, как это отражено в приведенных амплитуд ЭРГ, рис 3D.
В заключение, при введении правильно задних конечностей ишемии смог защитить нейронов сетчатки от легкого вреда.
Рисунок 1:. Размещение манжеты и эффект давления манжеты выше 160 мм рт.ст. (а) показана задних конечностей и ноги до манжеты высоте давления. (Б) Показывает ногу во время подъема давления в манжете выше 160 мм рт. Обратите внимание на положение манжеты выше "К урожденная ". Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2:. Температура ног снижается во время раздувания манжеты Инфляция манжеты на задней конечности на 2 х 5 мин при 160 мм рт.ст. снижение температуры кожи во время ишемии. () Показывает среднее для группы из 2 х 5 мин температурных изменений RIP ног. (Б) показывает характерную температуру ног (° C) трассировки для 2 х 5 мин ишемии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
00 "/>
Рисунок 3:. RIP сохраняет функции сетчатки как показано в ЭРГ по сравнению с крысами легких повреждений воздействие яркого света в течение 24 ч повреждений фоторецепторов сетчатки. ЭРГ измеряет здоровье внутренней и внешней сетчатки в виде электрического ответа (мкВ [мкВ]) к световой стимуляции. Нормальный сетчатки ответ на лог 2.0 cd.sm -2 световая стимуляция видел в (А). Повреждение фоторецептора от яркого света приводит к меньшей амплитудой ЭРГ (B). RIP удалось спасти фоторецепторы следующие легкого вреда (C). Неправильное размещение манжеты во время RIP не защищает фоторецепторы от травм (D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
4highres.jpg "ширина =" 600 "/>
Рисунок 4: TUNEL + количества клеток. Гистограмма сравнения результат группы для легкой травмы, травмы + RIP продемонстрировать снижение апоптоза с RIP. TUNEL + клеток подсчитывали по всей продолжительности сетчатки (8000 мкм). Верхняя панель: группа в среднем TUNEL + клеток были ниже RIP крыс (210 ± 4,9, п = 5) по сравнению с только легкой травмы (255 ± 10, п = 5), р <0,01, в одну сторону ANOVA. Неповрежденные сетчатки (нет света травмы) была очень низкой (3,0 ± 1,4, п = 5) апоптоза клетки. () Представитель образ превосходит света потерпевшего сетчатки. (B), представитель изображение высшего света RIP-потерпевшего сетчатки. (С) представитель образ нижней света ранения сетчатки. (D), представитель изображения низкого RIP-света потерпевшего сетчатки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этогофигура.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Грызунов задних конечностей ишемии был успешно индуцированных с ручным сфигмоманометра и манжету доставки нейропротекции, чтобы фоторецепторов сетчатки. Вывод согласуется с ишемической кондиционирования индуцированной защиты фоторецепторов от легкого вреда 9,28.
По сути, пульт ишемия вызывает краткое кислорода к тканям лишения. Следовательно, дистанционное ишемическая предварительная имеет много общего с ишемической кондиционирования или в качестве альтернативы называют ишемической толерантности, гипоксического прекондиционирования, и в какой-то степени, анаэробные упражнения. Клетки ответить на вызов ишемической выпуская большое разнообразие белков, нуклеозидов и факторов транскрипции, которые либо предлагают нейропротекции прямо или воздействуют на клетки, чтобы стать терпимым последующей метаболического стресса 13.
В литературе, удаленные протоколы ишемия включили диапазоне длительностей и частот. Наша лаборатория протестировала 5, 10,и 2 х 5 мин ишемии протоколы о нормальной функции сетчатки 26. Из этих протоколов 2 х 5 мин производится наибольшее изменение амплитуды ЭРГ в нормальных крыс и был выбран для тестирования в модели светового повреждения. Короткие и повторные 5 мин ишемии также было показано, что профилактика в повторяющихся ударов в организме человека, и, чтобы уменьшить размер инфаркта в экспериментальном инсульта у свиней 17,22. Тем не менее, наиболее подходящим длительность ишемического прекондиционирования, вероятно, будет зависеть от модели на животных, используемых. Например, уменьшение размера инфаркта против фокальной ишемии было отмечено в более 2 х 15 мин и 3 х 15 мин протоколов, но не в 3 х 5 мин протоколы на крысах 15.
Время между IP и ишемического повреждения также нужно рассматривать для эффективного нейропротекции. Два временных окон были классифицированы по кардиопротекции индуцированной IP. Это окно "классический кондиционирования", которое происходит 0-12 ч после IP и"второе окно", которое происходит через 3-4 дня после IP 29. В фокальной модели инсульта, РИП было установлено, что защитное в различные моменты времени, в том числе за пределами классических и второго окна 15. Тем не менее, было несколько исследований, которые сравнили периоды времени нейропротекции в RIP и IP.
Дальнейшее рассмотрение для дистанционного защиты ишемии сроки кондиционирования, в том числе будь то применяется до травмы (предварительной) или после травмы (посткондиционирования). Большинство удаленного тестирования ишемии использовали предварительной подготовки, несмотря на то, посткондиционирования исследования недавно было установлено, что защитное обоих сетчатки и нейронов головного мозга 30,31.
Таким образом, индукция нейропротекции в задних конечностей ишемического кондиционирования специфична для модели болезни, вида животного, длительности ишемии и сроках ишемии. Обзор Kaniora др. рrovides более подробную информацию о различных протоколов удалённого ишемии, в том числе видов, протоколов RIP, RIP-сайтов, моделей травмы, травмы и исходов предлагаемых механизмов защиты 32.
Минимально инвазивной манжеты на задней конечности позволяет RIP и в сознании и животных при условии, что температура тела поддерживается. У анестезированных экспериментов, температура тела животного должны быть сохранены, чтобы предотвратить переохлаждение. Мониторинг внутренней температуры будет препятствовать животное переживает переохлаждение или гипертермия. Переохлаждение и гипертермия хорошо известные предварительно кондиционирования стимулы в обеих моделях инсульта и травмы свет 33-36. Способ Юпитер представлены может быть выполнена у бодрствующих животных, тем самым предотвращая температуры тела смешивает.
Анестетики могут вносить свой набор смешивает в RIP экспериментов. Изофлюран могут участвовать в защите миокарда с помощью открытия АТФ-чувствительных ч калияAnnels, похоже защитный механизм сообщили в ишемической кондиционирования 37. Хотя размер инфаркта в моделях инсульта остается большим в бутафорских лечение животных, получавших ИФ, молекулярный механизм лежащий в основе дистанционного ишемическая кондиционирования могут быть замаскированы эффектами анестетиков. Кетамин, антагонист NMDA-, имеет множество защитных эффектов в естественных условиях, в том числе 38 потенциала для предотвращения эксайтотоксичность к нейронов, включите MTOR путь и отпустите BDNF в сыворотке 39-41. Кетамин, как сообщается, повысить выживаемость нейронов следующую травмы головного мозга у человека и уменьшить повреждение светового грызунов фоторецепторов 42,43. Расследования механизма дистанционного ишемической кондиционирования с наручников проснулся артериального давления позволяет избежать анестезии путает.
Эффективное ишемии задних конечностей зависит от правильного размещения манжеты, консистенция давлением манжеты и манжеты высоте давления выше SystoLIC кровяное давление, как видно на рисунке 1. манжета находится ниже «колена» не защищает фоторецепторы от света травмы, как это отражено в сокращенном электроретинограммы (ЭРГ) амплитуды. Разница в кондиционирования на основе положения манжеты, скорее всего, из-за различий в мышечной массы и близости к бедренной артерии. Кроме того, животные должны быть стандартизированы по возрасту, весу, температуре тела и пола.
Таким образом, удаленный ишемия может быть вызвана неинвазивного артериального давления манжеты, что позволяет избежать повреждения мышц и имеет возможность для активного или наркозом экспериментов. Удаленная ишемическая предварительная является новым нейропротекторный стратегия и этот протокол позволит дальнейшие исследования в ее механизмов и приложений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gold series DuraShock hand aneroid sphygmomanometer | Welch Allyn | DS56 | Manual Sphygmomanometer |
| Neonate [size 2] 1 tube, 10 pack | Welch Allyn | 5082-102-1 | Limb blood pressure cuff |
| Luer lock adaptor | Welch Allyn | 5082-178 | Adaptor for neonatal cuff |
| Thermistor pod | AD Instruments | ML 309 | skin tempertature unit |
| Skin temperture probe | AD Instruments | MLT 422/A | |
| Powerlab, 4 channel acquistion hardware | AD Instruments | PL 35044 | |
| Homeothermic blanket system with flexible probe | Harvard Appartus | 507222F | |
| Towel | optional: awake remote ischemia | ||
| Isoflo - 100% Isoflurane (250 ml) | Abbot Animal Health | 05260-05 | optional: inhaltion anaesthetic remote ischemia |
| Ketamil - ketamine 100 mg/ml (50 ml) | Troy Laboratories Pty Ltd | optional: injectable anaesthetic remote ischemia | |
| Xylium - Xylazine 100 mg/ml (50 ml) | Troy Laboratories Pty Ltd | optional: injectable anaesthetic remote ischemia |
References
- Meller, R., Simon, R. P. Tolerance to Ischemia-an Increasingly Complex Biology. Translational Stroke Research. 4 (1), 40-50 (2013).
- Sun, J., et al. Protective effect of delayed remote limb ischemic postconditioning: role of mitochondrial K-ATP channels in a rat model of focal cerebral ischemic reperfusion injury. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (5), 851-859 (2012).
- Harkin, D. W., D'Sa, A., McCallion, K., Hoper, M., Campbell, F. C. Ischemic preconditioning before lower limb ischemia-reperfusion protects against acute lung injury. Journal of Vascular Surgery. 35 (6), 1264-1273 (2002).
- Murry, C. E., Jennings, R. B., Reimer, K. A. Preconditioning with ischemia -A delay of lethal cell injury in ischemic myocardium. Circulation. 74 (5), 1124-1136 (1986).
- Barone, F. C., et al. Ischemic preconditioning and brain tolerance - Temporal histological and functional outcomes, protein synthesis requirement, and interleukin-1 receptor antagonist and early gene expression. Stroke. 29 (9), 1937-1950 (1998).
- Roth, S., et al. Preconditioning provides complete protection against retinal ischemic injury in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (5), 777-785 (1998).
- Wegener, S., et al. Transient ischemic attacks before ischemic stroke: Preconditioning the human brain? A multicenter magnetic resonance imaging study. Stroke. 35 (3), 616-621 (2004).
- Weih, M., et al. Attenuated stroke severity after prodromal TIA - A role for ischemic tolerance in the brain. Stroke. 30 (9), 1851-1854 (1999).
- Casson, R. J., Wood, J. P. M., Melena, J., Chidlow, G., Osborne, N. N. The effect of ischemic preconditioning on light-induced photoreceptor injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (3), 1348-1354 (2003).
- Ettaiche, M., et al. ATP-sensitive potassium channels (K-ATP) in retina: a key role for delayed ischemic tolerance. Brain Research. 890 (1), 118-129 (2001).
- Gross, E. R., Gross, G. J. Ligand triggers of classical preconditioning and postconditioning. Cardiovascular Research. 70 (2), 212-221 (2006).
- Heurteaux, C., Lauritzen, I., Widmann, C., Lazdunski, M. Essential role of adenosine, adenosine-A1-receptors, and ATP-senstive K+ channels in cerebral ischemic preconditioning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (10), 4666-4670 (1995).
- Dirnagl, U., Simon, R. P., Hallenbeck, J. M. Ischemic tolerance and endogenous neuroprotection. Trends in Neurosciences. 26 (5), 248-254 (2003).
- Ren, C., et al. Remote ischemic post-conditioning reduced brain damage in experimental ischemia/reperfusion injury. Neurol Res. 33 (5), 514-519 (2011).
- Ren, C., Gao, X., Steinberg, G. K., Zhao, H. Limb remote-preconditioning protects against focal ischemia in rats and contradicts the dogma of therapeutic time windows for preconditioning. Neuroscience. 151 (4), 1099-1103 (2008).
- Hu, S., et al. Noninvasive limb remote ischemic preconditioning contributes neuroprotective effects via activation of adenosine A1 receptor and redox status after transient focal cerebral ischemia in rats. Brain Research. 1459, 81-90 (2012).
- Jensen, H. A., et al. Remote Ischemic Preconditioning Protects the Brain Against Injury After Hypothermic Circulatory Arrest. Circulation. 123 (7), 714-721 (2011).
- Kuntscher, M. V., et al. Ischemic preconditioning by brief extremity ischemia before flap ischemia in a rat model. Plastic and Reconstructive Surgery. 109 (7), 2398-2404 (2002).
- Kharbanda, R. K., et al. Transient limb ischemia induces remote ischemic preconditioning in vivo. Circulation. 106 (23), 2881-2883 (2002).
- Perl, W., Cucinell, S. A. LOCAL BLOOD FLOW IN HUMAN LEG MUSCLE MEASURED BY A TRANSIENT RESPONSE THERMOELECTRIC METHOD. Biophysical Journal. 5 (2), 211-230 (1965).
- Vuksanovic, V., Sheppard, L. W., Stefanovska, A. Nonlinear relationship between level of blood flow and skin temperature for different dynamics of temperature change. Biophysical Journal. 94 (10), L78-L80 (2008).
- Meng, R., et al. Upper limb ischemic preconditioning prevents recurrent stroke in intracranial arterial stenosis. Neurology. 79 (18), 1853-1861 (2012).
- Souza, M. V. P., et al. Hind limb ischemic preconditioning induces an anti-inflammatory response by remote organs in rats. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 42 (10), 921-929 (2009).
- Hixson, F. P., Shafiroff, B. B., Werner, F. W., Palmer, A. K. DIGITAL TOURNIQUETS - A PRESSURE STUDY WITH CLINICAL RELEVANCE. Journal of Hand Surgery-American. 11A (6), 865-868 (1986).
- Hamer, P. W., McGeachie, J. M., Davies, M. J., Grounds, M. D. Evans Blue Dye as an in vivo marker of myofibre damage: optimising parameters for detecting initial myofibre membrane permeability. Journal of Anatomy. 200 (1), 69-79 (2002).
- Brandli, A., Stone, J. Remote ischemia influences the responsiveness of the retina: observations in the rat. Invest Ophthal Vis Sci. 55 (4), (2014).
- Maslim, J., Valter, K., Egensperger, R., Hollander, H., Stone, J. Tissue oxygen during a critical developmental period controls the death and survival of photoreceptors. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 38 (9), 1667-1677 (1997).
- Grimm, C., et al. HIF-1-induced erythropoietin in the hypoxic retina protects against light-induced retinal degeneration. Nature Medicine. 8 (7), 718-724 (2002).
- Vander Heide, R. Clinically Useful Cardioprotection: Ischemic Preconditioning Then and Now. Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 16 (3-4), 251-254 (2011).
- Zhou, Y. L., et al. Remote Limb Ischemic Postconditioning Protects Against Neonatal Hypoxic-Ischemic Brain Injury in Rat Pups by the Opioid Receptor/Akt Pathway. Stroke. 42 (2), 439-444 (2011).
- Hasegawa, J., Obara, T., Tanaka, K., Tachibana, M. High-density presynaptic transporters are required for glutamate removal from the first visual synapse. Neuron. 50 (1), 63-74 (2006).
- Kanoria, S., Jalan, R., Seifalian, A. M., Williams, R., Davidson, B. R. Protocols and mechanisms for remote ischemic preconditioning: A novel method for reducing ischemia reperfusion injury. Transplantation. 84 (4), 445-458 (2007).
- Maier, C. M., et al. Optimal depth and duration of mild hypothermia in a focal model of transient cerebral ischemia - Effects on neurologic outcome, infarct size, apoptosis, and inflammation. Stroke. 29 (10), 2171-2180 (1998).
- Reith, J., et al. Body temperature in acute stroke: Relation to stroke severity, infarct size, mortality, and outcome. Lancet. 347 (8999), 422-425 (1996).
- Barbe, M. F., Tytell, M., Gower, D. J., Welch, W. J. HYPERTHERMIA PROTECTS AGAINST LIGHT DAMAGE IN THE RAT RETINA. Science. 241 (4874), 1817-1820 (1988).
- Wang, X. D., et al. Neuronal degradation in mouse retina after a transient ischemia and protective effect of hypothermia. Neurological Research. 24 (7), 730-735 (2002).
- Tonkovic-Capin, M., et al. Delayed cardioprotection by isoflurane: role of K(ATP) channels. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 283 (1), H61-H68 (2002).
- Pfenninger, E., Himmelseher, S. Neuroprotective effects of ketamine on a cellular level. Anaesthesist. 46, S47-S54 (1997).
- Hirose, K., Chan, P. H. BLOCKADE OF GLUTAMATE EXCITOTOXICITY AND ITS CLINICAL-APPLICATIONS. Neurochemical Research. 18 (4), 479-483 (1993).
- Welberg, L. Psychiatric disorders: Ketamine modifies mood through mTOR. Nature reviews. Neuroscience. 11 (10), 666 (2010).
- Garcia, L. S. B., et al. Acute administration of ketamine induces antidepressant-like effects in the forced swimming test and increases BDNF levels in the rat hippocampus. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry. 32 (1), 140-144 (2008).
- Wassle, H. Parallel processing in the mammalian retina. Nature Reviews Neuroscience. 5 (10), 747-757 (2004).
- Hertle, D. N., et al. Effect of analgesics and sedatives on the occurrence of spreading depolarizations accompanying acute brain injury. Brain. 135, 2390-2398 (2012).
