Summary
Fjärr ischemisk prekonditionering (RIP) är en metod för konditionering vävnader mot skadlig stress. Vi har etablerat en metod för fjärr ischemi på bakbenet, genom att blåsa en blodtrycksmätare manschetten under 5-10 min. De neuroskyddande kapacitet RIP har visats i en modell av näthinnedegeneration hos gnagare.
Abstract
Subletal ischemi skyddar vävnader mot efterföljande allvarligare ischemi genom uppreglering av endogena mekanismer i den drabbade vävnaden. Subletal ischemi har också visat sig uppreglera skyddsmekanismer i avlägsna vävnader. En kort period av ischemi (5-10 min) i den bakre delen av däggdjur inducerar själv skyddande svar i hjärnan, lunga, hjärta och näthinnan. Effekten är känd som fjärr ischemisk prekonditionering (RIP). Det är ett terapeutiskt lovande sätt att skydda vitala organ, och är redan i kliniska prövningar för hjärt- och hjärnskador. Denna publikation visar en kontrollerad, minimalt invasiv metod för att tillverka en lem - specifikt bakbenet hos en råtta - ischemisk. En blodtrycksmanschett utvecklats för användning i humana nyfödda är ansluten till en manuell blodtrycksmätare och används för att applicera 160 mmHg tryck runt den övre delen av bakbenet. En sond utformad för att detektera hud temperatur används för att verifiera ischemien, genom registrering av minskningen av hudens temperatur orsakad av tryckinducerad ocklusion av benens artärer, och ökningen i temperatur som följer frisättning av manschetten. Denna metod för RIP ger skydd för råtta näthinnan mot starkt ljus-inducerad skada och degeneration.
Introduction
Överlevnaden för de flesta, kanske alla, kan vävnader i ansiktet av metabolisk stress förbättras genom tidigare konditionering med en period av subletal ischemi 1,2. Ischemisk prekonditionering (IP) i praktiken är exponeringen av vävnad till subletal ischemi, innan vävnads erfarenheter mer allvarliga stressfaktorer, såsom en efterföljande ischemisk skada. I djurmodeller tillhandahåller IP-slående skydd till hjärnan, näthinnan, hjärtat och lungorna 3-6. På motsvarande observationer i strokepatienter visade ett samband mellan tidigare övergående ischemiska attacker och bättre kliniska utfall 7,8. IP skyddar också retinala fotoreceptorer från icke-ischemiska skador 9.
Effektiviteten av IP i olika vävnader och skador tyder på att den aktiverar en medfödd mekanism för cellöverlevnad närvarande i all vävnad. Ischemisk prekonditionering av hjärtmuskeln har föreslagits att ha skyddande effekter genom uppregleringhypoxi inducerbara faktor (HIF), känd för att reglera många metaboliska vägar genom frisättning av adenosin eller genom öppnandet av mitokondriella ATP kaliumkanaler 10,11. Adenosinfrigivning och ATP kaliumkanaler är inblandade i cerebral ischemi, men undersökningar av neuroprotektiva mekanismer ischemisk konditione hittills har fokuserat på ändringar av anti-excitotoxicity, anti-apoptotiska och anti-inflammatoriska vägar 12,13. Totalt sett är begränsad förståelse för den molekylära processen för ischemisk konditionering för att skydda neuroner.
Fjärr ischemiska prekonditionerande försök att konditionera avlägsna kritiskt viktiga organ (hjärta, hjärna, lunga) genom att generera ischemi i mindre kritiska vävnader. Fjärr ischemisk prekonditionering (RIP) med användning av bakbenet har visats vara neuroskyddande i gnagarmodeller av stroke 14-17. Den metod som beskrivs av oss ger en enkel, tillförlitlig och icke-invasiv protocol för att inducera RIP.
De allra flesta av RIP protokoll involverar bakbenet, förmodligen på grund av lårbensartären ligger i den övre bakbenen lätt kan identifieras och nås för kirurgisk kläm och blodtomsmanschett. I invasiv lem ischemiska studier för att studera hjärnan och hudskydd är ischemiinducerad genom att separera lårbensartären från ljumsk ligament och spännlårbensartären 2,15,18.
Den ischemi till följd av antingen lem ansamling av inflammatoriska celler eller lårbensartären kläm har bekräftats av förändringar på benet, inklusive en förlust av puls, minskad syresättning och en nedgång i hudtemperatur. Fjärr ischemi kan bekräftas av förlusten av pulsen med hjälp av laser Doppler eller ultraljud Doppler 17-19. Hudtemperatur kan användas som alternativ till Doppler även om förhållandet ej är linjärt 20,21. Korrekta temperatur inspelningar är vanliga i laboratorier och burklätt införlivas i avlägsna ischemiska studier.
Ett alternativ till femoral kläm kirurgi är induktion av ischemi med hjälp av en kompressor. Tourniquet ansökan ger jämförbar ischemi som uppnås med fartyg kläm; Kutchner et al., jämfört invasiv lårbensartären kläm till en icke-invasiv tryckförband och fann båda metoderna stoppas blodflödet till extremiteterna och minskade skador huden på ett plastikkirurgi modell av hudfliken ischemi 18. Ansamling av inflammatoriska celler antingen benet eller armen och höjning av manschettrycket till över systoliskt blodtryck har visat sig vara skyddande mot ischemisk skada i svin och människor 17,19,22.
Olika tryckförband metoder för inducering fjärr ischemisk inkludera användningen av en blodtrycksmanschett eller ett elastiskt band 17,22,23. Emellertid är användningen av ett elastiskt band för att inducera ischemi en osäker metod, potentiellt ger upphov till en oreglerad mängd tryck ilem, med trycket stiger över 500 mmHg registreras hos människor 24. Vidare, ischemi med användning av ett elastiskt band leder till muskelskador i råttor efter avlägsnandet av bandet 23, enligt bedömning av Evans Blue Dye, en in vivo-markör för myofiber permeabilitet 25. I motsats härtill kan uppnås avgivning av ett reglerat tryck till stasen användning av en blodtrycksmanschett ansluten till en sfygmomanometer 17,19,22,26.
I denna studie var en lätt modell skada ljusmätare degeneration som används för att visa den neuroprotektiva effekten av fjärr ischemisk prekonditionering. Fjärr ischemi framkallades omedelbart före lätt skada, och förhindrade efterföljande ljusmätare degeneration vilket bekräftas av retinal funktionstest. Den medföljande videon kommer att visa tillämpningen av icke-invasiv fjärr ischemi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik uttalande: Protokollet följer riktlinjerna för djurskötsel av University of Sydney, AEC # 5657. Anestesi godkändes av djuretik kommitté (University of Sydney, AEC # 5657).
1. Förberedelse av utrustning
- Använd realtid spårning hudtemperatur. Slå på datorn, och datainsamling hårdvara.
- Öppna temperatur inspelningsprogram och justera temperaturinställning till mellan 30-35 ° C och provtagningsfrekvens till 100 msek.
- Tillval: Sätt rektal termometer för att säkerställa kärntemperatur är stabil vid 37,5 ° C.
2. Kalibrering av handboken blodtrycksmätare
- Anslut neonatal manschetten att sphygmomanometer.Use en storlek 2 manschetten för en 250-550 g råtta. En adapter kan behövas för att ansluta manschettslangen till blodtrycksmätare.
- Töm manschetten antingen genom att lossa luftningsventil eller frånkoppling av manschettslangen från anpassareller. Se inget tryck kvar i slangen och manometern nålen vilar på noll inuti den ovala / rektangel.
- Kontrollera trycket mellan slang, manometer och manschett. Blås upp manschetten med mjuka pumpar för inflationsblåsan tills det står 100 mmHg på manometern. Se till att trycket förblir konstant. Töm manschetten genom att långsamt öppna luftningsvärdet.
3. Djur Förberedelse
Observera: Djur som ska genomgå lätt skada kräver mörka anpassning natten innan fjärr ischemi. Djur som genomgår ljus skada kräver mörk uppfödning (12 h ljus: mörker-cykel (5 lux))
- Utföra fjärr ischemi i antingen vakna eller sövda gnagare. Se till att djur har en sund muskeltonus. Se detta genom att klämma den övre bakbenen för att bekräfta att det finns tillräckligt muskel närvarande. RIP-inducerad skydd mot ljus skada har testats i stillasittande råttor upp till 6 månaders ålder.
- Anestesi förberedelse för RIP
- Spruta råttor med en intraperitoneal injektion av 60 mg / kg ketamin och 5 mg / kg xylazin. Kontrollera djupet av anestesi genom att förlänga benet och nypa ihop huden på undersidan av foten. Djuret har ingen reflex om det är djupt anestesi. Applicera artificiella tårar för att undvika hornhinnan torrhet medan under narkos.
- Placera råttor på antingen en värmedyna eller cirkulerande varmvattenberedare slang för att upprätthålla en konstant kroppstemperatur av 37,5 ° C. Placera råttan i liggande läge med de nedre extremiteterna "trampdynorna uppåt. Antingen höger eller vänster lem kan genomgå fjärr ischemi.
- Vaken förberedelse för RIP
Obs: Vakna djurförsök kräver två personer. En person hindrar djuret och den andra personen driver den manuella blodtrycksmätare. De praktiker måste vara övertygade om att utföra proceduren som återhållsamhet ökar risken för skador på entreprenad. Råttorna genomgår fjärr ischemi måste vara anpassade to manuell återhållsamhet. Beroende på intuitiva riktlinjer manuell återhållsamhet bör vara framsteg från 30 sekunder till högst 5 minuter under ett antal veckor. Skygga djur som inte acklimatisera sig till manuell återhållsamhet bör undantas från vaken experiment. Slutligen är det sannolikt att orsaka stress (och eventuellt införa blandar ihop till studien) till djur och en bluff kohort (placering av manschetten utan inflammation) måste användas för att korrekt tolka RIP studieresultat manuell återhållsamhet.- Skär en handduk i en 15 cm X 30-50 cm stycke och placera kortsidan vinkelrätt mot råttans rygg, täcker huvudet till toppen av bakbenen.
- Stoppa kortsidan under råttans torso tätt och börja linda råttan med den återstående långsidan av handduken. Säkra lindade djuret under armen i ryggläge. Om råttan hålls under vänster arm, befria råttans högra lem från handduken.
4. Ansökan of hudtemperatursond
- Förläng benet hos råttan som skall undergå ischemi och placera huden sonden på fotsulan. Placera huden sonden för att maximera kontakt mellan temperatursonden och huden. Tryck bestämt sonden i trampdynan och anbringa sonden med papperstejp.
- Kontrollera huden sondplacering genom att spåra temperaturen på programvara temperaturregistreringen. Se till att temperaturen huden är mellan 30-34 ° C och förblir stabil. Spåra hudtemperaturen i 1-2 minuter. Justera huden sonden om temperaturen är instabil eller under 30 ° C.
5. Fjärr Ischemi
- Tömma manschetten och säkerställa lufttrycket ventilen är stängd. Förläng benet och löst omger manschetten på den övre bakbenet. Använd pekfingret och tummen att förlänga benet och de lägre siffrorna för att hålla den lossade manschetten i läge.
- Höj anestesi djurets manschettrycket till 160 mmHg och i vakna djur Increase manschettrycket till 180 mmHg.
Obs! Anestesi blodtrycket hos råttor varierar från 120 till 140 mmHg och stiger till 160 mmHg när medvetande. Börja timern och fot temperatur inspelningar när rätt tryck nås.
Obs: Foten Temperaturen bör sjunka med 2 ° C efter 5 min med konstant tryck. - Bibehålla positionen för manschetten ovanför djurets "knä" i hela ischemi. Manschettrycket börjar sjunka efter några minuter, eller om råttans lemmen är i rörelse.
- Upprepade gånger pumpa inflations glödlampa i korta stötar för att upprätthålla det önskade manschettrycket repetitiva korta utbrott av pump
- Fjärr ischemi kan levereras kontinuerligt under mellan 5 och 15 minuter. Den ischemireperfusion Protokollet omfattar 2 perioder av 5 min ischemi med ett mellanliggande 5 min reperfusion.
- Tömma manschetten trycket genom att lossa lufttrycket ventilen. Kontrollera temperaturförändringen under loppet av ischemi proprotokoll. Släpp manschetten.
- Fortsätt med skada experiment. Djur under effekten av anestesi kommer att behöva placeras på en värmedyna. Fortsätta att övervaka djur tills ambulatorisk. Djur kan inte returneras till huset tills promenader.
6. Ljus Skada - näthinnedegeneration Modell
- Mörk anpassa djuren över natten (12-15 h). Omedelbart efter fjärr ischemi konditionering eller simulerad fjärr ischemi (återhållsamhet djur) placera djur i Perspex bostäder med mat och vatten.
- Slå på lysrör (1000 lux) ligger ovanför Perspex huset vid 09:00 under 24 timmar. Efter ljusexponering, tillbaka djuren att dämpa cykliska belysning för 7 dagar.
7. Post-fjärr ischemi procedurer
- Vision bedömning elektroretinogram (ERG):
Obs: ERG set-up och blixt protokoll följde Brandli och sten 26.- Mörk anpassa djur över natten (12-15 timmar). Enligtdim röd belysning söva djuren genom intraperitoneal injektion av ketamin och xylazin (60 mg / kg och 5 mg / kg, respektive). Mydriatiskt (atropinsulfat 1,0%), hornhinnan bedövningsmedel (proximetakain 0,5%).
- Applicera korneal hydrering (Carbomer polymeren) ögondroppar omedelbart till hornhinnan. Applicera ögon gel vid 20 minuters intervall för att upprätthålla hornhinnans hydratisering.
- Rita en löst knuten tråd runt ögongloben för att underlätta en stabil ERG inspelningar. Övervaka temperatur med hjälp av en rektal sond och upprätthålla djurets kroppstemperatur vid 37 till 37,5 ° C.
- Placera huvudet i en Ganzfeld integrerande sfär.
Obs: Ganzfeld är en fullt programmerbar Ijusstimulus som levererar enhetliga dugg blinkar från lysdioder till ögat. - Spela in elektroretinogram med hjälp av en skräddarsydd 4 mm platina positiva elektroden lätt att röra hornhinnan och en 2 mm diameter Ag / AgCl pellets elektrod förs in i munnen. Referens båda elektroderna till en nål av rostfritt stålinföras subkutant i gumpen.
- Spela signaler med bandpass inställningen 0.3-1,000 Hz (-3 dB), med en 2 kHz förvärvstakt (AD Instruments). Efter en stabil ERG inspelning etableras utsätta djuret för en 10 min mörk anpassning innan du börjar inspelningar.
- Följ blixten protokoll som tidigare beskrivits av Brandli och sten 26.
- Programmera varaktighet blixten (vi använde blinkar 1-2 msek varaktighet), och ställ in intensitet till -4,4 till 2,0 log ostraffade cd.sm -2. Använd ljusa blinkar (2,0 log scot cd.sm -2, 1 ms) för att mäta näthinnefunktion. I denna studie är jämförelsen mellan kontroll, ljus skada och ljus skada med översynsperioden.
8. TUNEL-analys
- Euthanize djur genom intraperitoneal injektion av fenobarbital överdosering (100 mg / kg). Enucleate ögonen och fixa i 4% paraformaldehyd.
- Tvätta ögonen i PBS före cyroprotectingögon natten i sackaros 30% (vikt / volym). Bädda in ögonen i OCT-förening och skuren i 20 um sagittala sektioner med hjälp av en kryostat.
- Utför TUNEL analys på näthinnan sektioner med DAPI färgning efter protokollet av Maslim et al. 27
- Använd fluorescensmikroskopi för Tunel fall av näthinnan. Tünel celler registrerades från yttre nukleära lagret (ENDA); det yttersta skiktet av näthinnan som innehåller fotoreceptorcellkärnor. I denna studie var TUNEL räkningar gjordes i triplikat för varje öga, med fem ögon för varje behandlingsgrupp.
- Använd enkelriktad ANOVA statistisk jämförelse grupp styrmedel, lätt skada, och lätta skador + RIP råttor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En blodtrycksmanschett höjs till över 160 mmHg stoppar blodflödet till bakbenet som ses tydligt i figur 1B. Avsaknaden av vävnadssyresättning resulterade i en minskning av djurets fot temperatur under en ischemi-reperfusion protokollet (Figur 2). Foten temperatur (33 ° C) var lägre än kärntemperatur och tillförlitligt reduceras under manschettryck höjd (31 ° C) stiger när manschetten var tömd (32 ° C). En enda 1.000 lux ljus skada levererades till dim höjas albinoråttor med eller utan fjärrkontroll ischemisk prekonditionering. Retinal funktion registrerades och bedömdes med hjälp av elektroretinogram (ERG).
ERG är summan av elektriska svaren som härrör från de inre och yttre neuroner i näthinnan för ljus stimulering såsom visas i fig 3. ERG vågform har en tidig negativ topp som härrör från ljusöver (minimum ca 10 msek efter light blixt) kallas a-våg och en stor positiv topp från inre näthinnan (maximalt cirka 80 ms efter ljusblixt) kallas b-vågen. Den mörk anpassade ERG från en normal dim upphöjd råtta uppvisade en stor fotoreceptor och inre retinal svar på en ljus 2,0 logg cd.sm -2 blixt (figur 3A). En vecka efter ljus av skada ERG inspelningar hade en kraftig minskning i amplitud i förhållande till kontroller, vilket avspeglar förlusten av fotoreceptorer; se figur 3B. Konditionering av bakbenet med ischemi med hjälp av en reperfusion protokoll av 2 x 5 minuter omedelbart före ischemi skyddade fotoreceptorer från ljus skada. Rip ERG amplituder var större än ljuset skada ensam, med en liten minskning till en våg se (Figur 3C). Terminal deoxinukleotidyltransferas dUTP nick ändmärkning (TUNEL) analys på frysförvarade delar av näthinnan bekräftade en minskning av apoptotiska celler i ljus skadade djur som fick RIP reltivt att skenbehandlade lätta skade djur (Figur 4).
Induktionen av ischemi till bakbenet förlitar sig på korrekt placering av manschetten, såsom framgår av fig 1. En manschett placeras under "knäet" inte skyddar fotoreceptorer från ljus skada vilket återspeglas i de reducerade ERG amplituder, se figur 3D.
Sammanfattningsvis, när de administreras korrekt bakbens ischemi kunde skydda retinala neuroner från ljus skada.
Figur 1:. Manschett placering och effekten av manschettrycket över 160 mmHg (A) Visar bakbenet och fot innan manschettrycket höjd. (B) Visar foten under höjden av manschettrycket över 160 mmHg. Notera positionen för manschetten ovanför "k nee ". Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Fot temperaturen sänks under manschettuppblåsning uppblåsning av manschetten på bakbenet för 2 x 5 min vid 160 mm Hg minskade hudtemperatur under ischemi. (A) visar gruppen genomsnittet för 2 x 5 min RIP fot temperaturförändringar. (B) visar ett representativt fot temperatur (° C) spårning för 2 x 5 min ischemi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
00 "/>
Figur 3:. RIP bevarar retinal funktion som visas i ERG jämfört med lätta skador råttor Exponering för starkt ljus under 24 timmar skadar fotoreceptorer i näthinnan. ERG mäter hälsan hos inre och yttre näthinnan som en elektrisk respons (mikrovolt [μV]) för ljus stimulering. Det normala retinal svar till 2,0 log cd.sm -2 ljus stimulering ses i (A). Ljusmätare skador från starkt ljus resulterar i en mindre ERG amplitud (B). RIP kunde rädda fotoreceptorer efter ljus skador (C). Felaktig placering av manschetten under undersökningsperioden skyddar inte fotoreceptorer från skada (D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
4highres.jpg "width =" 600 "/>
Figur 4: Tunel + celltal. Ett stapeldiagram jämföra koncernresultatet för lätt skada, skada + RIP visar minskningen av apoptos med översynsperioden. TUNEL + cell räknades över hela spannet av näthinnan (8.000 um). Övre panel: grupp genomsnitt av TUNEL + celler var lägre för RIP-behandlade råttor (210 ± 4,9, n = 5) jämfört med ljusskada enbart (255 ± 10, n = 5), p <0,01, envägs-ANOVA. Oskadade näthinnor (inget ljus skada) hade mycket låg (3,0 ± 1,4, n = 5) apoptotiska celler. (A) representant bild av högsta ljus skadade näthinnan. (B) representant bild av högsta RIP-ljus skadade näthinnan. (C) representant bild av sämre ljus skadade näthinnan. (D) representant bild av sämre RIP-ljus skadade näthinnan. Klicka här för att se en större version av dennafigur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gnagare bakbens ischemi framgångsrikt induceras med en manuell blodtrycksmätare och manschett leverera neuroprotektion till fotoreceptorer i näthinnan. Ett konstaterande överensstämmer med ischemisk konditionering inducerad skydd av fotoreceptorer från ljus skada 9,28.
I huvudsak orsakar fjärr ischemi kort syrebrist till vävnader. Följaktligen, har fjärr ischemisk prekonditionering många likheter med ischemisk konditionering eller alternativt benämnd ischemisk tolerans, hypoxisk förkonditionering, och i viss utsträckning, anaerob träning. Celler svarar på ischemisk utmaning genom att släppa en stor mängd proteiner, nukleosid- och transkriptionsfaktorer som antingen erbjuder neuroprotektion direkt eller påverkar celler att bli toleranta mot efterföljande metabolisk stress 13.
I litteraturen har fjärrischemiprotokoll inkluderade en rad löptider och frekvenser. Vårt laboratorium har testat 5, 10,och 2 x 5 min ischemi protokoll om normal näthinnan funktion 26. Av dessa protokoll 2 x 5 min produceras störst ERG amplituden förändring i normala råttor och valdes för att testa i en modell av ljus skada. Korta och upprepade 5 min ischemiska händelser har också visat sig vara förebyggande i återkommande stroke hos människor och att minska infarktstorleken i experimentell stroke hos svin 17,22. Emellertid, kommer sannolikt att vara beroende av den djurmodell som används den mest lämpliga varaktigheten av ischemisk prekonditionering. Till exempel, har en minskning av infarktstorlek mot fokal ischemi observerats i längre 2 x 15 min och 3 x 15 min protokoll, men inte i 3 x 5 min protokoll hos råttor 15.
Tiden mellan IP och ischemisk skada måste också övervägas för effektiv neuroprotektion. Två tidsfönster har klassificerats för kardioprotektion induceras av IP. Dessa är de "klassiska conditioning" fönster, vilket sker 0-12 timmar efter IP ochden "andra fönster", som uppträder 3-4 dagar efter IP 29. I en fokal stroke modell, var RIP visat sig vara skyddande vid flera tidpunkter, även utanför de klassiska och andra fönster 15. Däremot har det funnits få studier som har jämfört de tidsperioder neuroprotektion i RIP och IP.
Ett ytterligare övervägande för fjärr skydd ischemi är tidpunkten för konditionering, bland annat om den tillämpas före skada (prekonditionering) eller efter skada (postconditioning). Majoriteten av fjärr ischemi tester har använt prekonditionering trots postconditioning studier har nyligen visat sig vara skyddande av både retinala och hjärnans nervceller 30,31.
Sammanfattningsvis är induktion av neuro i bakbenen ischemisk konditione specifika för sjukdomsmodell, djurarter, varaktigheten av ischemi, och tidpunkten för ischemi. En granskning av Kaniora et al. provides mer information om de olika fjärr ischemi protokoll, inklusive de arter, RIP protokoll, RIP platser, skademodeller, skadeutfall och föreslagna skyddsmekanismer 32.
Den minimalt invasiva manschetten på bakbenet möjliggör RIP i både vaken och djur förutsatt kroppstemperaturen bibehålles. I sövda experimenterande, måste djurets kroppstemperatur upprätthållas för att förhindra hypotermi. Övervaka den interna temperaturen kommer att hindra djuret genomgår hypotermi eller hypertermi. Hypotermi och hypertermi är välkända prekonditionerade stimuli i både stroke modeller och lätta skador 33-36. Den JUPITER metod som presenteras kan utföras i vakna djur därigenom förhindra kroppstemperaturen blandar ihop.
Anestetika kan införa en annan uppsättning blandar ihop i RIP experiment. Isofluran kan delta i hjärtmuskeln skydd via öppnandet av ATP-känsliga kalium channels, en liknande skyddsmekanism redovisas i ischemisk konditionering 37. Även storleken på infarkt hos strokemodeller fortfarande stor i skenbehandlade djur som fått isofluran kan den molekylära mekanismen underliggande fjärr ischemisk konditionemaskeras av effekterna av anestetika. Ketamin, en NMDA-antagonist, har en mängd skyddande effekter in vivo 38, inklusive möjligheten att förhindra excitotoxicitet till neuroner, aktivera mTOR vägen och släpp BDNF i serum 39-41. Ketamin har rapporterats att öka neuronal överlevnad efter hjärnskada hos människor och minska ljus skada i gnagare fotoreceptorer 42,43. Utredningar om mekanismen för fjärr ischemisk konditione med vaken blodtryck ansamling av inflammatoriska celler kommer att undvika anestesi blandar ihop.
Effektiv bakbenen ischemi bygger på korrekt placering av manschetten, konsistens manschettrycket och manschettryck höjd över systolic blodtryck som visas i figur 1. En manschett placeras under "knä" inte skyddar fotoreceptorer från ljus skada som återspeglas i minskad elektroretinogram (ERG) amplituder. Skillnaden i konditione baserad på positionen av manschetten är sannolikt på grund av skillnader i muskelmassa och närhet till den femorala artären. Dessutom bör djuren standardiseras för ålder, vikt, temperatur och könsorganet.
Sammanfattningsvis kan fjärr ischemi induceras av en icke-invasiv blodtrycksmanschetten, som undviker muskelskada och har flexibilitet för vaken eller sövda experiment. Remote ischemisk prekonditionering är en framväxande neuroprotektivt strategi och detta protokoll kommer att möjliggöra fortsatta studier i dess mekanismer och program.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gold series DuraShock hand aneroid sphygmomanometer | Welch Allyn | DS56 | Manual Sphygmomanometer |
| Neonate [size 2] 1 tube, 10 pack | Welch Allyn | 5082-102-1 | Limb blood pressure cuff |
| Luer lock adaptor | Welch Allyn | 5082-178 | Adaptor for neonatal cuff |
| Thermistor pod | AD Instruments | ML 309 | skin tempertature unit |
| Skin temperture probe | AD Instruments | MLT 422/A | |
| Powerlab, 4 channel acquistion hardware | AD Instruments | PL 35044 | |
| Homeothermic blanket system with flexible probe | Harvard Appartus | 507222F | |
| Towel | optional: awake remote ischemia | ||
| Isoflo - 100% Isoflurane (250 ml) | Abbot Animal Health | 05260-05 | optional: inhaltion anaesthetic remote ischemia |
| Ketamil - ketamine 100 mg/ml (50 ml) | Troy Laboratories Pty Ltd | optional: injectable anaesthetic remote ischemia | |
| Xylium - Xylazine 100 mg/ml (50 ml) | Troy Laboratories Pty Ltd | optional: injectable anaesthetic remote ischemia |
References
- Meller, R., Simon, R. P. Tolerance to Ischemia-an Increasingly Complex Biology. Translational Stroke Research. 4 (1), 40-50 (2013).
- Sun, J., et al. Protective effect of delayed remote limb ischemic postconditioning: role of mitochondrial K-ATP channels in a rat model of focal cerebral ischemic reperfusion injury. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (5), 851-859 (2012).
- Harkin, D. W., D'Sa, A., McCallion, K., Hoper, M., Campbell, F. C. Ischemic preconditioning before lower limb ischemia-reperfusion protects against acute lung injury. Journal of Vascular Surgery. 35 (6), 1264-1273 (2002).
- Murry, C. E., Jennings, R. B., Reimer, K. A. Preconditioning with ischemia -A delay of lethal cell injury in ischemic myocardium. Circulation. 74 (5), 1124-1136 (1986).
- Barone, F. C., et al. Ischemic preconditioning and brain tolerance - Temporal histological and functional outcomes, protein synthesis requirement, and interleukin-1 receptor antagonist and early gene expression. Stroke. 29 (9), 1937-1950 (1998).
- Roth, S., et al. Preconditioning provides complete protection against retinal ischemic injury in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (5), 777-785 (1998).
- Wegener, S., et al. Transient ischemic attacks before ischemic stroke: Preconditioning the human brain? A multicenter magnetic resonance imaging study. Stroke. 35 (3), 616-621 (2004).
- Weih, M., et al. Attenuated stroke severity after prodromal TIA - A role for ischemic tolerance in the brain. Stroke. 30 (9), 1851-1854 (1999).
- Casson, R. J., Wood, J. P. M., Melena, J., Chidlow, G., Osborne, N. N. The effect of ischemic preconditioning on light-induced photoreceptor injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (3), 1348-1354 (2003).
- Ettaiche, M., et al. ATP-sensitive potassium channels (K-ATP) in retina: a key role for delayed ischemic tolerance. Brain Research. 890 (1), 118-129 (2001).
- Gross, E. R., Gross, G. J. Ligand triggers of classical preconditioning and postconditioning. Cardiovascular Research. 70 (2), 212-221 (2006).
- Heurteaux, C., Lauritzen, I., Widmann, C., Lazdunski, M. Essential role of adenosine, adenosine-A1-receptors, and ATP-senstive K+ channels in cerebral ischemic preconditioning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (10), 4666-4670 (1995).
- Dirnagl, U., Simon, R. P., Hallenbeck, J. M. Ischemic tolerance and endogenous neuroprotection. Trends in Neurosciences. 26 (5), 248-254 (2003).
- Ren, C., et al. Remote ischemic post-conditioning reduced brain damage in experimental ischemia/reperfusion injury. Neurol Res. 33 (5), 514-519 (2011).
- Ren, C., Gao, X., Steinberg, G. K., Zhao, H. Limb remote-preconditioning protects against focal ischemia in rats and contradicts the dogma of therapeutic time windows for preconditioning. Neuroscience. 151 (4), 1099-1103 (2008).
- Hu, S., et al. Noninvasive limb remote ischemic preconditioning contributes neuroprotective effects via activation of adenosine A1 receptor and redox status after transient focal cerebral ischemia in rats. Brain Research. 1459, 81-90 (2012).
- Jensen, H. A., et al. Remote Ischemic Preconditioning Protects the Brain Against Injury After Hypothermic Circulatory Arrest. Circulation. 123 (7), 714-721 (2011).
- Kuntscher, M. V., et al. Ischemic preconditioning by brief extremity ischemia before flap ischemia in a rat model. Plastic and Reconstructive Surgery. 109 (7), 2398-2404 (2002).
- Kharbanda, R. K., et al. Transient limb ischemia induces remote ischemic preconditioning in vivo. Circulation. 106 (23), 2881-2883 (2002).
- Perl, W., Cucinell, S. A. LOCAL BLOOD FLOW IN HUMAN LEG MUSCLE MEASURED BY A TRANSIENT RESPONSE THERMOELECTRIC METHOD. Biophysical Journal. 5 (2), 211-230 (1965).
- Vuksanovic, V., Sheppard, L. W., Stefanovska, A. Nonlinear relationship between level of blood flow and skin temperature for different dynamics of temperature change. Biophysical Journal. 94 (10), L78-L80 (2008).
- Meng, R., et al. Upper limb ischemic preconditioning prevents recurrent stroke in intracranial arterial stenosis. Neurology. 79 (18), 1853-1861 (2012).
- Souza, M. V. P., et al. Hind limb ischemic preconditioning induces an anti-inflammatory response by remote organs in rats. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 42 (10), 921-929 (2009).
- Hixson, F. P., Shafiroff, B. B., Werner, F. W., Palmer, A. K. DIGITAL TOURNIQUETS - A PRESSURE STUDY WITH CLINICAL RELEVANCE. Journal of Hand Surgery-American. 11A (6), 865-868 (1986).
- Hamer, P. W., McGeachie, J. M., Davies, M. J., Grounds, M. D. Evans Blue Dye as an in vivo marker of myofibre damage: optimising parameters for detecting initial myofibre membrane permeability. Journal of Anatomy. 200 (1), 69-79 (2002).
- Brandli, A., Stone, J. Remote ischemia influences the responsiveness of the retina: observations in the rat. Invest Ophthal Vis Sci. 55 (4), (2014).
- Maslim, J., Valter, K., Egensperger, R., Hollander, H., Stone, J. Tissue oxygen during a critical developmental period controls the death and survival of photoreceptors. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 38 (9), 1667-1677 (1997).
- Grimm, C., et al. HIF-1-induced erythropoietin in the hypoxic retina protects against light-induced retinal degeneration. Nature Medicine. 8 (7), 718-724 (2002).
- Vander Heide, R. Clinically Useful Cardioprotection: Ischemic Preconditioning Then and Now. Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 16 (3-4), 251-254 (2011).
- Zhou, Y. L., et al. Remote Limb Ischemic Postconditioning Protects Against Neonatal Hypoxic-Ischemic Brain Injury in Rat Pups by the Opioid Receptor/Akt Pathway. Stroke. 42 (2), 439-444 (2011).
- Hasegawa, J., Obara, T., Tanaka, K., Tachibana, M. High-density presynaptic transporters are required for glutamate removal from the first visual synapse. Neuron. 50 (1), 63-74 (2006).
- Kanoria, S., Jalan, R., Seifalian, A. M., Williams, R., Davidson, B. R. Protocols and mechanisms for remote ischemic preconditioning: A novel method for reducing ischemia reperfusion injury. Transplantation. 84 (4), 445-458 (2007).
- Maier, C. M., et al. Optimal depth and duration of mild hypothermia in a focal model of transient cerebral ischemia - Effects on neurologic outcome, infarct size, apoptosis, and inflammation. Stroke. 29 (10), 2171-2180 (1998).
- Reith, J., et al. Body temperature in acute stroke: Relation to stroke severity, infarct size, mortality, and outcome. Lancet. 347 (8999), 422-425 (1996).
- Barbe, M. F., Tytell, M., Gower, D. J., Welch, W. J. HYPERTHERMIA PROTECTS AGAINST LIGHT DAMAGE IN THE RAT RETINA. Science. 241 (4874), 1817-1820 (1988).
- Wang, X. D., et al. Neuronal degradation in mouse retina after a transient ischemia and protective effect of hypothermia. Neurological Research. 24 (7), 730-735 (2002).
- Tonkovic-Capin, M., et al. Delayed cardioprotection by isoflurane: role of K(ATP) channels. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 283 (1), H61-H68 (2002).
- Pfenninger, E., Himmelseher, S. Neuroprotective effects of ketamine on a cellular level. Anaesthesist. 46, S47-S54 (1997).
- Hirose, K., Chan, P. H. BLOCKADE OF GLUTAMATE EXCITOTOXICITY AND ITS CLINICAL-APPLICATIONS. Neurochemical Research. 18 (4), 479-483 (1993).
- Welberg, L. Psychiatric disorders: Ketamine modifies mood through mTOR. Nature reviews. Neuroscience. 11 (10), 666 (2010).
- Garcia, L. S. B., et al. Acute administration of ketamine induces antidepressant-like effects in the forced swimming test and increases BDNF levels in the rat hippocampus. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry. 32 (1), 140-144 (2008).
- Wassle, H. Parallel processing in the mammalian retina. Nature Reviews Neuroscience. 5 (10), 747-757 (2004).
- Hertle, D. N., et al. Effect of analgesics and sedatives on the occurrence of spreading depolarizations accompanying acute brain injury. Brain. 135, 2390-2398 (2012).
