Effektiv Udledning af retinale pigmentepitel Celler fra stamceller

Published: March 8, 2015 doi: 10.3791/52214

Peter Westenskow^1,2, Zack Sedillo^1,2, Ashley Barnett², Martin Friedlander^1,2

¹Department of Cell and Molecular Biology, The Scripps Research Institute, ²Lowy Medical Research Institute

Protocol

1. Direkte Differentiering af stamceller afledt RPE

BEMÆRK: Alle inkubationstrin udføres ved 37 ° C i 5% CO ₂

Opretholde HES eller hofter linjer (foder dagligt) i vedligeholdelse medier (MM, tabel 1). Når linjerne har nået tilstrækkelige standarder for kvalitetskontrol, holde dem på et lag af muse embryonale feeder celler (MEF) podet med en tæthed på 250.000 / brønd i en seks brønds plade. Xeno-fri kulturer kan også genereres efter protokol er fastlagt af Tucker et al. ^40.
Lad stamcelle kolonier til flyder sammen.
Skift til differentiering medier med Nicotinamid (DM / NIC, tabel 1); foder dagligt.
Efter tre uger i kultur, skifte til differentiering medier med nikotinamid og enten Activin-A eller IDE-1 (DM / NIC / AA eller DM / NIC / IDE1, tabel 1) at øge RPE differentiering. Efter fem uger i kultur, skifte tilbage til DM / NIC. Daglige fodringer ikke længere er nødvendige, når pH-indikatorer i medierne stoppe dreje gul dagen efter fodring.
Vent øer af pigmenterede celler til vises der er store nok til at blive skåret og fjernet (se figur 2D-F og 3A).

2. isolerende Pigmenteret Islets

Coat brøndene i en 24-brønds plade med en matrix, der efterligner den naturlige celle miljø (xeno-fri er at foretrække).
BEMÆRK: hornhinde knive og skarpe spids pincet er meget nyttige til plukning. Hele ark differentierede celler kan løsne, mens picking. Undgå dette ved at arbejde omhyggeligt og oprindeligt plukke kolonier i midten af fadet.
Fyld så mange brønde af 24-brønds plade med differentiering medier (DM Tabel 1) efter behov. Denne beslutning vil afhænge af antallet af pigmenterede kolonieropsamlet.
I en cellekultur hætte med en dissektionsmikroskop manuelt skåret ud pigmenterede øer. Hak hver holm i bunden af den oprindelige plade ved hjælp af en skalpel i omkring 2-6 stykker og få fat i de pigmenterede dele med skarpe pincet.
Overfør 1-2 pigmenterede stykker i hver 24 brønde.
Skift ikke medier i 3-5 dage, indtil cellerne klæber, og derefter begynde at ændre medier tre gange om ugen. (Hvis de ikke overholder efter dette tidspunkt, er sandsynligheden er godt, at de aldrig vil).
Expand celler i 3-4 uger i differentiering medier (DM Tabel 1) - Et billede af en typisk kultur er vist i figur 3B. Celler kan stadig ikke fylde hele godt, men venter længere synes ikke at hjælpe. Feed celler tre gange om ugen.
Efter ca 3 uger, skal du fjerne manuelt klynger af hvide blodlegemer i givet fald med skarpe pincet klumper. Gør ikke dette trin, medmindre det er nødvendigt - det er let at indføre kontaminanter. Det er ideelt tilforsøge at få reneste bestande af RPE fra de oprindelige pigmenterede kolonier i trin 1.6.

3. Passage Stem Cell-afledte RPE

Frigør celler med 200 pi med en celledissocieringsopløsning (fortrinsvis ikke trypsinlignende et reagens, som kan inaktiveres ved fortynding er at foretrække) i 5-8 minutter ved 37 ° C, og inaktivere det ved fortynding med DM. Brug en 200 pi pipette for at vaske alle celler og resuspendere dem (Hvis den valgte brønd indeholder kun få celler, overveje at samle cellerne fra to 24-brønde).
Centrifuge (800 x g i 5 min), kasseres supernatanten og resuspender i 3 ml DM medier.
Re-plade af celler fra en (eller to) 24-brønde i en matrix coatet med 6 brønde i 3 ml DM per brønd (1: 5 ekspansion).
Expand 1-2 uger, indtil cellerne er ~ 90% sammenflydende; et billede af fuldt differentieret renkultur er vist i figur 3C.
Frigør celler med 1 ml celle dissociation opløsningen i ca. 5-8 minutter ved 37 ° C, inaktivere det ved fortynding med DM bruge 1.000 pi pipette for at vaske alle celler, og resuspender dem.
Spin ned (800 xg i 5 min), kasseres supernatanten, og resuspender i 18 ml DM medier.
Re-plade celler fra en 6-brønds hver i seks matrix overtrukket 6 brønde i 3 ml DM per brønd (1: 6 ekspansion) eller en overtrukket 75cm ² kolbe (1: 7,5 ekspansion).
Gentag trin 3,4-3,8 nødvendigt, indtil nok celler opnås.
BEMÆRK: Prøv at samle så mange kolonier som muligt for ekspansion i stedet planer om at forstærke kulturerne via passage da hver passage inducerer RPE dedifferentiering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Trinene i dette manuskript, som afbildet i figur 1, kan anvendes til let at generere RPE fra stamceller som tidligere rapporteret ^10,12. Efter opretholdelse IPS linjer for flere uger, pigmenterede kolonier begynde at dukke op i de kolonier efter 5-7 uger (7 uger gamle kulturer er vist i figur 2A-C). Disse kolonier kan fortsætte med at vokse i uger kulturerne opretholdes. Når nå tilstrækkelige størrelser, som vist i figur 2D-F (8 uger gamle kulturer), kan de manuelt udskåret som vist i figur 3A. Omhyggelig excision for at undgå forurening med ikke-RPE celler vil i høj grad lette generation tilstrækkeligt rene RPE kulturer (figur 3B-C).

Figur 1
Figur 1: Skematisk skildrer iPS-RPE afledning Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 2
Figur 2: aktivin A end IDE-1 øge udbyttet af iPS-RPE. (A) Små pigmenterede kolonier begynder at dukke efter syv uger i kultur spontant mellem ikke-RPE-celler i et enkelt ark, der er klæbende til bunden af en 6-brønds plade (nogle er markeret med pile). (B og C) Supplering med IDE-1 eller activin A resulterer i fremkomsten af endnu mere pigmenterede kolonier (nogle er markeret med pile i AC) viser, at tilskud af enten activin A eller IDE-1 øger RPE differentiering. (DF) Efter 8 ugers virkningerne af tilskud af IDE-1 eller Activin A er endnu mere udtalt. Både antallet og størrelsen af de pigmenterede øer er større efter rettet differentiering. Scale bar = 5 mm

Figur 3
Figur 3: Ekspansion og terminal differentiering afpigmenterede iPS-RPE. (A) Repræsentant billede af en pigmenteret iPS-RPE koloni, der er stor nok til punktafgifter. Ikke-RPE-celler omgiver koloni i bunden af en 6-brønds plade. Den blå omrids markerer området, der ville blive skåret. (B) Billede af post-sammenflydende umodne iPS-RPE celler i kultur efter den første ekspansion skridt. (C) to måneder gamle terminalt differentierede iPS-RPE-celler. Bemærk tilstedeværelsen af åbenlyse celle grænser og homogene niveauer af pigmentering demonstrerer avanceret differentiering. Scale barer = 100 um

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dette manuskript vi skitsere de skridt til effektivt at generere et stort antal rene iPS-RPE kulturer. Vi har tidligere vist at bruge denne rettet differentiering protokol med Activin A, at vi kan generere iPS-RPE som stærkt ligner hRPE baseret på transcriptomics, proteomics, metabolomik og funktionalitet, og at de retard retinal degeneration, når implanteret i RCS rotter ^12,31,32 . Processen med at frembringe iPS-RPE er tidskrævende, men ikke besværlig (figur 1). Når IPS kulturer flyder sammen, de skal fodres med differentiering medier på daglig basis. Vi supplerer mediet med enten activin A eller en billigere lille molekyle IDE-1 og fortsætte fodring i to uger under overvågning kulturerne for pigmenterede iPS-RPE kolonier, der generelt vises efter 5-7 uger (figur 2A-C). Når nå tilstrækkelige størrelser (figur 2D-F og 3A), den Colonies manuelt fjernet og overført til nye plader til ekspansion. Dette sker nogenlunde efter 8 uger og er den mest besværlige trin af hele protokollen.

Det mest udfordrende aspekt er at undgå forurening med ikke-RPE-celler i de ekspanderende kulturer ved uheld indsamle uønskede naboceller i eller omkring de pigmenterede kolonier. Afhængigt af graden af forurening, kan øerne ikke-RPE-celler fjernes manuelt under ekspansion, selv om hver gang kulturerne håndteres yderligere risiko for at indføre bakterielle eller fungale kontaminanter forøges. Det er værd at bemærke, at i vores erfaring VP-RPE kan faktisk "udkonkurrere" et lille antal kontaminerende celler under passage-trin. Men vi anbefaler at tage stor forsigtighed, når picking kolonier for at sikre, at de er så ren som muligt for at undgå at skulle ty til disse trin. Med det andet eller tredje passage IPS-RPE kulturer er tilstrækkeligt rene og tilstrækstrækkelige antal celler er til rådighed for karakterisering og implantation.

Teknikken rapporteret her er bestemt ikke den eneste metode til at udlede stamcelle afledt RPE. I virkeligheden hverken det er den nemmeste eller hurtigste. Den nemmeste og mest metode er at bruge spontan differentiering. (Men tilskud af IDE-1 i to uger er billig og øger udbyttet af iPS-RPE.) IPS-RPE har også genereret i embryoide organer, differentierer til kugler af polariserede RPE celler, der kan blive tvunget til at holde sig til overfladen af dyrkningsplader og udvide som et monolag. RPE celler genererer ved hjælp af denne metode er også blevet meget kraftigt præget og stærkt ligne hRPE ^27. RPE kan skelne ekstremt hurtigt (i kun 14 dage) fra stamceller ved at supplere medierne med nikotinamid, IGF1, Noggin, DKK1, og bFGF at konvertere dem til neurale retinale progenitor skæbner, så senere tilføje pro-RPE faktorer nicotinamid and Activin En ^37. RPE kan også genereres endnu hurtigere direkte fra fibroblaster i ca. en måned ved at transducere fibroblasterne med et minimalt sæt transkriptionsfaktorer herunder cMYC, MITF, OTX2, RAX og CRX ^44. Men mens disse resultater er meget opmuntrende RPE genererede disse sidste to teknikker endnu ikke blevet grundigt karakteriseret ved at implantere dem in vivo. Foreslår derfor, vi at læseren overveje alle RPE nedarvnings muligheder nøje, når de beslutter at ansætte i deres studier.

Fordelene ved at anvende protokollen skitseret her er dens enkelhed og konsekvent høje udbytter af meget høj kvalitet RPE ^31. Tilskud af IDE-1 i stedet Activin A reducerer de samlede omkostninger og mindsker risikoen involveret med anvendelse af rekombinante proteiner. Da det endnu ikke er klart, om det valg at bruge forskellige differentiering metoder vil haveindflydelse på det endelige produkt, kan det være fordelagtigt at anvende standardiserede protokoller, især hvis direkte sammenligninger mellem RPE genereret i forskellige laboratorier vil være nødvendig (måske især i tilfælde sygdom modellering af). En simpel protokol som denne, der kræver lidt ekspertise og reagenser, og som genererer højt udbytte af iPS-RPE, kunne være ideel til disse situationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Corneal knife	Surgipro	SPOI-070	knife x 1
DMEM/F-12, HEPES	Life Technologies	11330-032	500 ml x 4
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1X w/out Ca or Mg	VWR	45000-434	500 ml x 6
Fetal Bovine Serum, Regular (Heat Inactivated)	VWR	45000-736	500 ml x 1
FGF-Basic (AA 10-155) Recombinant Human Protein	Life Technologies	PHG0021	100 µg x 1
IDE-1	Stemgent	04-0026	2 mg x 1
Knockout DMEM	Life Technologies	10829-018	500 ml x 1
KnockOut Serum Replacement	Life Technologies	10828-028	500 ml x 1
L-Glutamine 200 mM	Life Technologies	25030-081	100 ml x 1
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X	Life Technologies	11140-050	100 ml x 1
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636-100G	100 g x 1
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140-148	20 ml x 1
Recombinant Human/Murine/Rat Activin A	PeproTech	120-14E	10 µg x 2
Synthemax-T Surface 6 Well Plates	Corning	3877	Case(12) x 1
TrypLE-Express Enzyme (1X), no phenol red	Life Technologies	12604-021	500 ml x 1
Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.1µm pore, 500ml	Corning	431475	Case(12) x 1