Protocol
1. Geregisseerd Differentiatie van stamcellen afgeleide RPE
Opmerking: Alle incubatie stappen worden uitgevoerd bij 37 ° C in 5% CO2
- Handhaving van de HES of heupen lijnen (dagelijks voeden) in onderhoud media (MM; tabel 1). Zodra de lijnen voldoende kwaliteits- controle bereikt, houden ze op een laag van muis embryonale voedingscellen (MEF) geënt bij een dichtheid van 250.000 / putje van een zes puts plaat. Xeno-vrij kweken kunnen ook worden gegenereerd na het bij Tucker et al. 40 protocol.
- Laat de stamcellen kolonies tot samenvloeiing bereiken.
- Schakelen naar differentiatie media met Nicotinezuuramide (DM / NIC; tabel 1); dagelijks voeden.
- Na drie weken in de cultuur, over te schakelen naar differentiatie media met nicotinamide en ofwel Activin-A of IDE-1 (DM / NIC / AA of DM / NIC / IDE1; tabel 1) tot RPE differentiatie te verbeteren. Na vijf weken in de cultuur, schakel terug naar DM / NIC. Dagelijkse voedingen niet langer nodig wanneer de pH indicatoren in de media stop geel worden de dag na de voeding.
- Wacht op eilandjes van gepigmenteerde cellen te verschijnen die groot genoeg zijn om te worden gesneden en verwijderd (zie figuur 2D-F en 3A).
2. Isoleren Gepigmenteerde Eilandjes
- Smeer de putjes van een 24-wells plaat met een matrix die de natuurlijke cel milieu (xeno-vrije voorkeur) nabootst.
OPMERKING: Cornea messen en scherpe, fijne punt tang zijn zeer nuttig voor het plukken. Het hele vel van gedifferentieerde cellen kunnen los terwijl het oppakken. Dit voorkomen door zorgvuldig werken en aanvankelijk plukken kolonies in het midden van de schaal. - Vul zoveel putjes van de 24-well plaat met differentiatie medium (DM; tabel 1) nodig. Deze beslissing is afhankelijk van het aantal gepigmenteerde koloniesverzameld.
- In een celkweek kap met een dissectie scope, handmatig uitgesneden gepigmenteerde eilandjes. Hak elk eilandje aan de onderkant van de originele plaat met behulp van een scalpel in ongeveer 2-6 stukken en pak de gepigmenteerde delen met scherpe tang.
- Transfer 1-2 gepigmenteerde stukjes in elke 24-put.
- Laat de media niet veranderen voor 3-5 dagen tot cellen hechten, dan beginnen veranderende media drie keer per week. (Als ze niet houden na deze tijd, de kans is groot dat ze nooit doen).
- Expand cellen voor 3-4 weken differentiatie medium (DM; Tabel 1) - Een beeld van een typische kweek wordt getoond in figuur 3B. Cellen kunnen nog steeds niet vullen het gehele goed maar langer wachten lijkt niet te helpen. Voeden cellen drie keer per week.
- Na ongeveer 3 weken, handmatig clusters van witte cellen te verwijderen in groepjes, indien nodig met scherpe tang. Voer deze stap niet tenzij dit noodzakelijk is - het is gemakkelijk om verontreinigingen te voeren. Het is ideaal omproberen om een zo zuiver populaties van RPE in stap 1.6 te verkrijgen van de oorspronkelijke gepigmenteerde kolonies.
3. Passage stamcellen afgeleide RPE
- Trek de cellen met 200 ul van een cel dissociatie oplossing (bij voorkeur geen trypsine-een reagens die kan worden geïnactiveerd door verdunning voorkeur) 5-8 minuten bij 37 ° C en inactiveren door verdunning met DM. Gebruik een 200 ul pipet te wassen alle cellen en hen opnieuw in suspensie (Als het goed gekozen bevat slechts een paar cellen, overweeg dan het bundelen van de cellen van twee 24-wells).
- Centrifuge (800 g gedurende 5 min), gooi supernatant, en resuspendeer in 3 ml DM media.
- Opnieuw plate cellen van één (of twee) 24-wells in een matrix beklede 6-well in 3 ml DM per putje (1: 5 expansie).
- Openen voor 1-2 weken tot de cellen zijn ~ 90% samenvloeiing; een afbeelding van volledig gedifferentieerde zuivere kweek wordt getoond in figuur 3C.
- Los cellen met 1 ml cel dissociation oplossing gedurende 5-8 minuten bij 37 ° C, inactiveren door verdunning met DM Gebruik 1000 ul pipet te wassen alle cellen en resuspendeer hen.
- Spin down (800 g gedurende 5 min), gooi supernatant, en resuspendeer in 18 ml DM media.
- Opnieuw plate cellen van een 6-wells elk in zes matrix beklede 6-putjes in 3 ml DM per putje (1: 6 expansie) of een beklede 75cm 2 fles (1: 7.5 expansie).
- Herhaal stap 3,4-3,8 nodig totdat voldoende cellen zijn verkregen.
OPMERKING: Probeer zo veel kolonies mogelijk te maken voor uitbreiding te verzamelen in plaats van plan om de culturen te versterken via passage omdat elke passage induceert RPE dedifferentiation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De stappen in dit manuscript, zoals in figuur 1, kan worden gebruikt om gemakkelijk genereren RPE uit stamcellen zoals eerder gemeld 10,12. Na handhaven van de iPS lijnen enkele weken gepigmenteerde kolonies beginnen te verschijnen in de kolonies na 5-7 weken (7 weken oude kweken zijn weergegeven in Figuur 2A-C). Deze kolonies kunnen blijven groeien weken als de culturen blijven. Zodra bereiken voldoende afmetingen, zie figuur 2D-F (8 weken oude culturen), kunnen zij manueel worden uitgesneden als getoond in figuur 3A. Zorgvuldige excisie verontreiniging met niet-RPE cellen voorkomen zal het genereren van voldoende zuivere RPE kweken (figuur 3B-C) aanzienlijk vergemakkelijken.
Figuur 1: Schematische beeltenis van iPS-RPE afleiding Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: activine A eend IDE-1 verhogen het rendement van iPS-RPE. (A) Kleine gepigmenteerde kolonies beginnen te verschijnen na zeven weken in kweek spontane tussen niet-RPE cellen in een enkel vel dat aanhanger van de bodem van een 6-well plaat (sommige zijn aangegeven met pijlen). (B en C) Suppletie met IDE-1 of activine A resulteert in het verschijnen van nog gepigmenteerde kolonies (sommige zijn aangegeven met pijlen in AC) aantonen dat suppletie met ofwel activine A of IDE-1 verhoogt RPE differentiatie. (DF) Na 8 weken de effecten van aanvulling met IDE-1 of activine A nog uitgesprokener. Zowel de aantallen en de grootte van de gepigmenteerde eilandjes zijn groter na geregisseerd differentiatie. Schaal bar = 5 mm
Figuur 3: Uitbreiding en terminale differentiatie vangepigmenteerde iPS-RPE. (A) representatief beeld van een gepigmenteerde iPS-RPE kolonie die groot genoeg is om de accijnzen. Niet-RPE cellen omringen de kolonie in de bodem van een 6-wells plaat. De blauwe lijnen markeert het gebied dat zou worden weggesneden. (B) Afbeelding van post-samenvloeiende onvolwassen iPS-RPE cellen in cultuur na de eerste uitbreiding stap. (C) Twee maanden oude terminaal gedifferentieerde iPS-RPE cellen. Let op de aanwezigheid van voor de hand liggende cel grenzen en homogeen niveau van pigmentatie demonstreren geavanceerde differentiatie. Schaal bar = 100 urn
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit manuscript schetsen we de stappen om efficiënt genereren van grote aantallen pure iPS-RPE culturen. We hebben eerder aangegeven met dit gericht differentiatie protocol met Activin A dat we iPS-RPE die sterk lijken hRPE op basis van transcriptomics, proteomics, metabolomics en functionaliteit kan genereren, en dat ze vertragen retinale degeneratie wanneer geïmplanteerd in RCS ratten 12,31,32 . Het maken van iPS-RPE is tijdrovend, maar niet bewerkelijk (figuur 1). Zodra de iPS kweken confluentie bereiken moeten ze worden gevoed met differentiatie media dagelijks. Wij vullen de media met ofwel activine A of minder dure klein molecuul IDE-1, en verder voeden twee weken observatie van het kweken van gepigmenteerde iPS-RPE kolonies die algemeen verschijnen na 5-7 weken (Figuur 2A-C). Zodra het bereiken van voldoende grootte (figuren 2D-F en 3A), de Colonies handmatig verwijderd en overgebracht naar nieuwe platen voor expansie. Dit gebeurt ongeveer na 8 weken en is de meest arbeidsintensieve stap van het gehele protocol.
De meest uitdagende aspect is om contaminatie met niet-RPE cellen in de groeiende kweken bij ongeluk verzamelen ongewenste naburige cellen in of rond de gepigmenteerde kolonies. Afhankelijk van de mate van vervuiling, kunnen eilanden niet RPE cellen handmatig worden verwijderd tijdens expansie, hoewel elke keer de kweken worden behandeld bijkomende risico introduceren bacteriële of fungale verontreinigingen verhoogd. Het is vermeldenswaard dat in onze ervaring de iPS-RPE kan eigenlijk "outcompete" een klein aantal van verontreinigende cellen tijdens de passage stappen. Maar we raden het nemen van grote voorzichtigheid bij het afhalen kolonies te zorgen dat ze zo zuiver mogelijk te vermijden dat hun toevlucht nemen tot deze stappen. Door de tweede of derde passage van de iPS-RPE culturen zijn voldoende zuiver en vol-ciënt aantal cellen beschikbaar zijn voor karakterisering en implantatie.
De techniek die hier worden gerapporteerd is zeker niet de enige methode voor het afleiden van stamcellen afgeleid RPE. In feite is het niet de makkelijkste noch het snelste. De eenvoudigste en meest werkwijze spontane differentiatie gebruiken. (Echter, suppletie met IDE-1 voor twee weken is goedkoop en verhoogt het rendement van iPS-RPE.) IPS-RPE zijn ook gegenereerd in embryoid lichamen die differentiëren in sferen van gepolariseerde RPE cellen die kunnen worden gedwongen om zich aan het oppervlak van cultuur platen en uit te breiden als een monolaag. RPE cellen te genereren met behulp van deze methode zijn ook erg krachtig gekarakteriseerd en sterk lijken hRPE 27. RPE kan zeer snel te onderscheiden (in slechts 14 dagen) uit stamcellen door aanvulling van de media met nicotinamide, IGF1, Noggin, Dkk1 en bFGF om ze te converteren naar neurale retina voorlopercellen lot, dan later toevoegen van de pro-RPE factoren nicotinamide eennd Activine A 37. RPE kan ook nog sneller direct worden gegenereerd uit fibroblasten in ongeveer een maand door transducing de fibroblasten met een minimale set van transcriptiefactoren waaronder cMYC, MITF, OTX2, RAX en CRX 44. Hoewel deze resultaten zeer bemoedigend zijn de RPE gegenereerd deze laatste twee technieken zijn nog niet rigoureus werd gekenmerkt door implanteren in vivo. Daarom stellen wij voor dat de lezer rekening houden met alle RPE afleiding opties zorgvuldig bij de beslissing welke in dienst te nemen in hun studie.
De voordelen van de hier geschetste protocol zijn de eenvoud en consequent hoge opbrengsten van zeer hoge kwaliteit RPE 31. Suppletie met IDE-1 in plaats van Activin Een sterk vermindert de totale kosten en verlaagt het risico met behulp van recombinante eiwitten. Aangezien het nog niet duidelijk of de keuze van verschillende differentiatie methoden zulleninvloed op het eindprodukt, kan het voordelig zijn om gestandaardiseerde protocollen te gebruiken, vooral als directe vergelijkingen tussen RPE generated in verschillende laboratoria nodig is (wellicht met name bij ziektemodel). Een eenvoudig protocol zoals deze die weinig expertise en reagentia vereist, en dat genereert hoge opbrengst van iPS-RPE, zou ideaal zijn voor deze situaties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corneal knife | Surgipro | SPOI-070 | knife x 1 |
| DMEM/F-12, HEPES | Life Technologies | 11330-032 | 500 ml x 4 |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1X w/out Ca or Mg | VWR | 45000-434 | 500 ml x 6 |
| Fetal Bovine Serum, Regular (Heat Inactivated) | VWR | 45000-736 | 500 ml x 1 |
| FGF-Basic (AA 10-155) Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG0021 | 100 µg x 1 |
| IDE-1 | Stemgent | 04-0026 | 2 mg x 1 |
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | 500 ml x 1 |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828-028 | 500 ml x 1 |
| L-Glutamine 200 mM | Life Technologies | 25030-081 | 100 ml x 1 |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X | Life Technologies | 11140-050 | 100 ml x 1 |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | 100 g x 1 |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-148 | 20 ml x 1 |
| Recombinant Human/Murine/Rat Activin A | PeproTech | 120-14E | 10 µg x 2 |
| Synthemax-T Surface 6 Well Plates | Corning | 3877 | Case(12) x 1 |
| TrypLE-Express Enzyme (1X), no phenol red | Life Technologies | 12604-021 | 500 ml x 1 |
| Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.1µm pore, 500ml | Corning | 431475 | Case(12) x 1 |
References
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol Rev. 85 (3), 845-881 (2005).
- Congdon, N. Causes and prevalence of visual impairment among adults in the United States. Arch Ophthalmol. 122 (4), 477-485 (2004).
- Friedman, D. S. Prevalence of age-related macular degeneration in the United States. Arch Ophthalmol. 122 (4), 564-572 (2004).
- Resnikoff, S. Global data on visual impairment in the year. Bull World Health Organ. 82 (11), 844-851 (2002).
- Bird, A. C. Therapeutic targets in age-related macular disease. The Journal of Clinical Investigation. 120 (9), 3033-3041 (2010).
- Jong, P. T. Age-related macular degeneration. N Engl J Med. 355 (14), 1474-1485 (2006).
- Binder, S., Stanzel, B. V., Krebs, I., Glittenberg, C. Progress In Retinal And Eye Research. Transplantation of the RPE in AMD. 26 (5), 516-554 (2007).
- Cruz, L., Chen, F. K., Ahmado, A., Greenwood, J., Coffey, P. RPE transplantation and its role in retinal disease. Progress In Retinal And Eye Research. 26 (6), 598-635 (2007).
- Carr, A. J. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4 (12), e8152 (2009).
- Idelson, M. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional retinal pigment epithelium cells. Cell Stem Cell. 5 (4), 396-408 (2009).
- Klimanskaya, I. Derivation and comparative assessment of retinal pigment epithelium from human embryonic stem cells using transcriptomics. Cloning Stem Cells. 6 (3), 217-245 (2004).
- Krohne, T. Generation of retinal pigment epithelial cells from small molecules and OCT4-reprogrammed human induced pluripotent stem cells. Stem Cells Translational Medicine. 1 (2), 96-109 (2012).
- Lund, R. D. Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats. Cloning Stem Cells. 8, 189-199 (2006).
- Vugler, A. Elucidating the phenomenon of HESC-derived RPE: anatomy of cell genesis, expansion and retinal transplantation. Exp Neurol. 214 (2), 347-361 (2008).
- Algvere, P. V., Berglin, L., Gouras, P., Sheng, Y. Transplantation of fetal retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration with subfoveal neovascularization. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 232 (12 ), 707-716 (1994).
- Binder, S. Outcome of transplantation of autologous retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: a prospective trial. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (11), 4151-4160 (2004).
- Binder, S. Transplantation of autologous retinal pigment epithelium in eyes with foveal neovascularization resulting from age-related macular degeneration: a pilot study. Am J Ophthalmol. 133 (2), 215-225 (2002).
- Falkner-Radler, C. I. Human retinal pigment epithelium (RPE) transplantation: outcome after autologous RPE-choroid sheet and RPE cell-suspension in a randomised clinical study. British Journal of Ophthalmology. 95 (3), 370-375 (2011).
- Li, Y. Long-term safety and efficacy of human-induced pluripotent stem cell (iPS) grafts in a preclinical model of retinitis pigmentosa. Molecular Medicine (Cambridge, Mass). 18, 1312-1319 (2012).
- Lu, B. Long-Term Safety and Function of RPE from Human Embryonic Stem Cells in Preclinical Models of Macular Degeneration). Stem Cells. 27 (9), 2126-2135 (2009).
- Peyman, G. A. A technique for retinal pigment epithelium transplantation for age-related macular degeneration secondary to extensive subfoveal scarring. Ophthalmic Surgery. 22 (2), 102-108 (1991).
- Schwartz, S. D. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. The Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
- Wang, N. K. Transplantation of reprogrammed embryonic stem cells improves visual function in a mouse model for retinitis pigmentosa. Transplantation. 89 (8), 911-919 (2010).
- Cruz, P. M. Mutation of the receptor tyrosine kinase gene Mertk in the retinal dystrophic RCS rat. Human Molecular Genetics. 9 (4), 645-651 (2000).
- Buchholz, D. E. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (10), 2427-2434 (2009).
- Hirami, Y. Generation of retinal cells from mouse and human induced pluripotent stem cells. Neurosci Lett. 458 (3), 126-131 (2009).
- Meyer, J. S. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (39), 16698-16703 (2009).
- Osakada, F. In vitro differentiation of retinal cells from human pluripotent stem cells by small-molecule induction. J Cell Sci. 122 (17), 3169-3179 (2009).
- Carr, A. J. Molecular characterization and functional analysis of phagocytosis by human embryonic stem cell-derived RPE cells using a novel human retinal assay. Mol Vis. 15, 283-295 (2009).
- Kokkinaki, M., Sahibzada, N., Golestaneh, N. Human Induced Pluripotent Stem-Derived Retinal Pigment Epithelium (RPE) Cells Exhibit Ion Transport, Membrane Potential, Polarized Vascular Endothelial Growth Factor Secretion, and Gene Expression Pattern Similar to Native RPE. Stem Cells. 29 (5), 825-835 (2011).
- Westenskow, P., Friedlander, M. Ch. 111. The New Visual Neurosciences. Werne, J. S., Chalupa, L. M. , The MIT Press. Cambridge, MA. 1611-1626 (2013).
- Westenskow, P. D. Using flow cytometry to compare the dynamics of photoreceptor outer segment phagocytosis in iPS-derived RPE cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (10), 6282-6290 (2012).
- Algvere, P. V., Gouras, P., Dafgard Kopp,, E, Long-term outcome of RPE allografts in non-immunosuppressed patients with AMD. Eur J Ophthalmol. 9 (3), 217-230 (1999).
- Zhang, X., Bok, D. Transplantation of retinal pigment epithelial cells and immune response in the subretinal space. Invest Ophthalmol Vis Sci. 39 (6), 1021-1027 (1998).
- Gamm, D. M., Phillips, M. J., Singh, R. Modeling retinal degenerative diseases with human iPS-derived cells: current status and future implications. Expert Review Of Ophthalmology. 8, 213-216 (2013).
- Singh, R. iPS cell modeling of Best disease: insights into the pathophysiology of an inherited macular degeneration. Hum Mol Genet. 22 (3), 593-607 (2013).
- Buchholz, D. E. Rapid and efficient directed differentiation of human pluripotent stem cells into retinal pigmented epithelium. Stem Cells Transl Med. 2 (5), 384-393 (2013).
- Fuhrmann, S., Levine, E. M., Reh, T. A. Extraocular mesenchyme patterns the optic vesicle during early eye development in the embryonic chick. Development (Cambridge, England). 127 (21), 4599-4609 (2000).
- Borowiak, M. Small molecules efficiently direct endodermal differentiation of mouse and human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 4 (4), 348-358 (2009).
- Tucker, B. A., Anfinson, K. R., Mullins, R. F., Stone, E. M., Young, M. J. Use of a synthetic xeno-free culture substrate for induced pluripotent stem cell induction and retinal differentiation. Stem Cells Transl Med. 2 (1), 16-24 (2013).
- Ramsden, C. M. Stem cells in retinal regeneration: past, present and future. Development (Cambridge, England). 140 (12), 2576-2585 (2013).
- Zhao, T., Zhang, Z. -N., Rong, Z., Xu, Y. Immunogenicity of induced pluripotent stem cells. Nature. 474 (7350), 212-215 (2011).
- Zhang, K. Direct conversion of human fibroblasts into retinal pigment epithelium-like cells by defined factors. Protei., & Cell. 5 (1), 48-58 (2013).
