Protocol
1. gerichteten Differenzierung von Stammzellen gewonnenen RPE
Anmerkung: Alle Inkubationsschritte werden bei 37 ° C in 5% CO 2 durchgeführt
- Pflegen Sie die hES oder Hüfte Linien (täglich füttern) in Erhaltungsmedium (MM; Tabelle 1). Sobald die Leitungen ausreichende Standards der Qualitätskontrolle zu erreichen, halten sie auf einer Schicht von embryonalen Maus-Feeder-Zellen (MEFs) ausgesät mit einer Dichte von 250.000 / well eines Sechs-Well-Platte. Xeno freien Kulturen kann auch nach der von Tucker et al. 40 festgelegten Protokoll erzeugt werden.
- Lassen Sie die Stammzellenkolonien zur Konfluenz erreichen.
- Wechseln Sie in Differenzierungsmedium mit Nicotinamid (DM / NIC; Tabelle 1); Futter täglich.
- Nach drei Wochen in der Kultur, die Differenzierung Medien wechseln mit Nicotinamid und entweder Activin-A oder IDE-1 (DM / NIC / AA oder DM / NIC / IDE1; Tabelle 1) zu RPE Differenzierung zu verbessern. Nach fünf Wochen in der Kultur, wechseln Sie wieder in DM / NIC. Fütterungszeiten sind nicht mehr notwendig, nachdem die pH-Indikatoren in den Medien nicht mehr drehen, gelb den Tag nach der Fütterung.
- Warten Sie, bis Inseln pigmentierten Zellen angezeigt werden, die groß genug sind, um geschnitten und entfernt werden (siehe Abbildungen 2D-F und 3A).
2. Isola pigmentierte Inseln
- Bestreichen Sie die Vertiefungen einer Platte mit 24 Vertiefungen mit einer Matrix, die den natürlichen Zellumgebung (Xeno-frei ist vorzuziehen) nachahmt.
HINWEIS: Cornea Messer und scharfen, spitzen Pinzette sind sehr nützlich für die Kommissionierung. Das gesamte Blatt von differenzierten Zellen können zu lösen, während Kommissionierung. Vermeiden Sie dies, indem Sie vorsichtig arbeiten und zunächst Kommissionierung Kolonien in der Mitte der Schale. - Füllen so viele Vertiefungen der Platte mit 24 Vertiefungen mit Differenzierungsmedium (DM; Tabelle 1), je nach Bedarf. Diese Entscheidung wird von der Anzahl der pigmentierten Kolonien hängengesammelt.
- In einer Zellkultur Kapuze mit einem Binokular, von Hand ausgeschnitten pigmentierte Inselchen. Hacken jedes Inselchen an der Unterseite der Originalplatte mit einem Skalpell in etwa 2-6 Stücke und ergreifen Sie die pigmentierte Teile mit scharfen Pinzette.
- Übertragen Sie 1-2 pigmentierte Stücke in jedem 24-Loch.
- Medien für 3-5 Tage nicht verändern, bis die Zellen haften, dann starten verändernden Medien drei Mal pro Woche. (Wenn sie nicht nach dieser Zeit halten, ist die Wahrscheinlichkeit gut, dass sie nie tun).
- Erweitern Zellen für 3-4 Wochen in Differenzierungsmedium (DM; Tabelle 1) - Ein Bild einer typischen Kultur wird in 3B gezeigt. Die Zellen können auch die gesamte noch nicht füllen, sondern wartet länger scheint nicht zu helfen. Feed-Zellen dreimal pro Woche.
- Nach ca. 3 Wochen, Trauben von weißen Zellen manuell entfernen in Klumpen ggf. mit scharfen Pinzette. Diesen Schritt nicht tun, wenn es notwendig ist - es ist leicht zu Verunreinigungen einzuführen. Es ist ideal,versuchen, reinster Populationen von RPE von den ursprünglichen pigmentierte Kolonien in Schritt 1.6 erhalten.
3. Passagieren Stammzellen gewonnenen RPE
- Lösen die Zellen mit 200 & mgr; l mit einer Zelldissoziationslösung (vorzugsweise nicht Trypsin ein Reagens, inaktiviert durch Verdünnung ist bevorzugt werden) bei 37 ° C für 5-8 min, und inaktivieren es durch Verdünnen mit DM. Verwenden Sie ein 200 ul Pipette abzuwaschen alle Zellen und sie wieder zu suspendieren (Wenn der gewählte und nur wenige Zellen enthält, sollten Sie die Bündelung der Zellen, die aus zwei 24-Brunnen).
- Zentrifuge (800 xg für 5 min), Überstand verwerfen, und resuspendieren in 3 ml DM-Medien.
- Wiederplatte Zellen aus einem (oder zwei) 24-Vertiefungen in einer Matrix beschichtet mit 6 Vertiefungen in 3 ml DM pro Napf (1: 5 Expansion).
- Erweitern für 1-2 Wochen, bis sich die Zellen ~ 90% konfluent; ein Bild der ausdifferenzierten reine Kultur ist in 3C gezeigt.
- Trennen Sie die Zellen mit 1 ml Zell dissociation Lösung für ca. 5-8 Minuten bei 37 ° C, zu inaktivieren es durch Verdünnen mit DM, verwenden Sie 1000 ul Pipette abzuwaschen alle Zellen und Resuspendieren sie.
- Spin down (800 xg für 5 min), Überstand verwerfen und Resuspension in 18 ml DM-Medien.
- Wiederplatte Zellen von einer 6-well jeder in sechs Matrix beschichteten 6-wells in 3 ml DM pro Napf (1: 6 Expansion) oder einer beschichteten 75 cm 2 -Kolben (1: 7.5 Expansion).
- Die Schritte 3,4-3,8 wie nötig, bis genügend Zellen erhalten werden.
HINWEIS: Versuchen Sie so viele Kolonien wie möglich für die Expansion und nicht planen, die Kulturen über Passagierung zu verstärken, da jeder Durchgang induziert RPE Entdifferenzierung zu sammeln.
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Representative Results
Die in diesem Manuskript dargelegt, wie in 1 dargestellt Schritten kann verwendet werden, um ohne weiteres erzeugen RPE aus Stammzellen, wie zuvor berichtet 10,12 werden. Nach Aufrechterhaltung der iPS-Linien für mehrere Wochen, beginnen pigmentierte Kolonien nach 5-7 Wochen (7 Wochen alten Kulturen werden in 2A-C gezeigt) in den Kolonien erscheinen. Diese Kolonien können weiterhin für Wochen wachsen die Kulturen gehalten. Nach Erzielung einer ausreichenden Größe, wie in 2D-F (8 Wochen alten Kulturen) dargestellt ist, kann sie von Hand ausgeschnitten werden, wie in 3A dargestellt. Sorgfältige Exzision, um eine Kontamination mit nicht-RPE-Zellen zu vermeiden, wird die Erzeugung von ausreichend rein RPE Kulturen (3B-C) erheblich erleichtern.
Abbildung 1: Schema, iPS-RPE Ableitung klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Activin A eined IDE-1 erhöhen die Ausbeute an iPS-RPE. (A) Kleine pigmentierte Kolonien beginnen, nach sieben Wochen in Kultur spontan zwischen Nicht-RPE-Zellen in einem einzigen Blatt erscheinen, die Anhänger der Boden einer 6-Well-Platte ist (einige sind mit Pfeilen) gekennzeichnet. (B und C) Supplementierung mit IDE-1 oder Activin A führt zum Auftreten von noch pigmentierten Kolonien (einige sind mit Pfeilen in AC markiert) zeigen, dass eine Supplementierung mit entweder Activin A oder IDE-1 verbessert die RPE Differenzierung. (DF) nach 8 Wochen die Auswirkungen der Nahrungsergänzung mit IDE-1 oder Activin A noch ausgeprägter. Sowohl die Anzahl und Größe der pigmentierten Inseln sind größer, nachdem gerichtet Differenzierung. Maßstabsbalken = 5 mm
Abbildung 3: Ausbau und terminale Differenzierungpigmentierte iPS-RPE. (A) Repräsentatives Bild einer pigmentierten iPS-RPE-Kolonie, die groß genug, um die Verbrauchsteuer. Non-RPE-Zellen umgeben die Kolonie in den Boden einer 6-Well-Platte. Die blaue Linie markiert den Bereich, der ausgeschnitten werden würde. (B) Bild von postkonfluente unreifen iPS-RPE-Zellen in Kultur nach der ersten Expansionsschritt. (C) Zwei Monate alten terminal differenzierte iPS-RPE-Zellen. Beachten Sie die Anwesenheit von offensichtlichen Zellgrenzen und homogene Pigmentierungshöhen demonstrieren erweiterte Differenzierung. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m
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Discussion
In diesem Manuskript wir einen Überblick über die Schritte, um eine große Anzahl von reinen iPS-RPE Kulturen effizient zu erzeugen. Wir haben bereits mit dieser gerichtet Differenzierung Protokoll mit Activin A, die wir iPS-RPE, die stark ähneln hRPE basierend auf Transkriptom, Proteomik, Metabolomik und Funktionalität zu generieren gezeigt, und dass sie zu verzögern Netzhautdegeneration, wenn in RCS Ratten implantiert 12,31,32 . Der Prozess der Erzeugung iPS-RPE ist zeitaufwendig, aber nicht mühsam (Abbildung 1). Sobald die iPS Kulturen Konfluenz zu erreichen müssen sie mit Differenzierung Medien täglich gefüttert werden. Ergänzt werden die Medien entweder mit Activin A oder einem weniger teuren kleines Molekül IDE-1, und weiterhin Zuführen für zwei Wochen, während die Überwachung der Kulturen für pigmentierte iPS-RPE Kolonien, die in der Regel nach 5-7 Wochen (2A-C) angezeigt. Nach Erreichen ausreichender Größe (den 2D-F und 3A), der Kolonenes werden manuell entnommen und auf neue Platten für die Erweiterung übergeben. Dies geschieht etwa nach 8 Wochen und ist die mühsame Schritt des gesamten Protokolls.
Die größte Herausforderung ist die Vermeidung von Kontaminationen mit nicht-RPE-Zellen in den expandierenden Kulturen durch versehentlich Sammeln unerwünschte Nachbarzellen in oder um die pigmentierte Kolonien. Je nach Verschmutzungsgrad können Inseln nicht RPE Zellen manuell während der Expansion entfernt werden, jedoch jedes Mal werden die Kulturen zusätzliche Risiken einzuführen Bakterien- oder Pilzverunreinigungen erhöht gehandhabt. Es ist erwähnenswert, dass nach unserer Erfahrung die iPS-RPE kann tatsächlich eine kleine Anzahl von kontaminierenden Zellen während der Passage Schritte "verdrängen". Aber wir empfehlen Ihnen den Abschluss großer Vorsicht bei der Kommissionierung Kolonien, damit sie so rein wie möglich zu vermeiden, dass zu diesen Schritten greifen sind. Mit der zweiten oder dritten Durchgang die iPS-RPE-Kulturen sind ausreichend rein und ausreizient Anzahl von Zellen sind für die Charakterisierung und Implantation verfügbar.
Die Technik, die hier berichtet ist sicherlich nicht das einzige Verfahren zum Ableiten von Stammzellen abgeleiteten RPE. In der Tat ist es weder die einfachste noch am schnellsten. Die einfachste und am weitesten verbreitete Methode ist die spontane Differenzierung zu verwenden. (Es ist eine Supplementierung mit IDE-1 für zwei Wochen preiswert und die Ausbeute an iPS-RPE stark erhöht.) IPS-RPE wurden auch in Embryoidkörpern, die in Bereichen des polarisierten RPE-Zellen, die gezwungen werden können, um zu Oberfläche haften zu unterscheiden erzeugt Kulturplatten und als Monolayer zu erweitern. RPE-Zellen erzeugen mit dieser Methode wurden auch sehr kräftig aus und ähneln stark hRPE 27. RPE kann extrem schnell (in nur 14 Tagen) aus Stammzellen differenzieren Hinzu Medien mit Nicotinamid, IGF1, Noggin, Dkk1 und bFGF, um sie zu neuronalen Netzhautvorläufer Schicksale zu konvertieren, später dann das Hinzufügen der pro-RPE Faktoren Nicotinamid einnd Activin A 37. RPE kann auch noch schneller direkt von Fibroblasten in etwa ein Monat von Transduzieren der Fibroblasten, die mit einem minimalen Satz von Transkriptionsfaktoren, einschließlich cMYC, MITF, OTX2, RAX und CRX 44 erzeugt werden. Obwohl diese Ergebnisse sind sehr ermutigend die RPE erzeugt die letzten beiden Methoden sind noch nicht konsequent durch Implantation von ihnen in vivo aus. Daher schlagen wir vor, dass der Leser berücksichtigen alle RPE Ableitung Optionen sorgfältig bei der Entscheidung, was in ihren Studien zu beschäftigen.
Die Vorteile der Verwendung des Protokolls hier aufgeführten ihrer Einfachheit und hohen laufenden Ertrag von sehr hoher Qualität RPE 31. Supplementierung mit IDE-1 anstatt Activin A reduziert die Gesamtkosten und senkt das Risiko bei der Verwendung von rekombinanten Proteinen beteiligt. Da es noch nicht klar, ob die Wahl unterschiedlicher Differenzierung Methoden verwenden müssenAuswirkungen auf das Endprodukt, es vorteilhaft standardisierte Protokolle nutzen könnte, besonders wenn ein direkter Vergleich zwischen RPE in verschiedenen Laboratorien erzeugt wird notwendig sein (vielleicht besonders im Falle von Krankheitsmodelle). Ein einfaches Protokoll wie diese, die wenig Know-how und Reagenzien benötigt, und das erzeugt hohe Ausbeute an iPS-RPE kann als ideal für diese Situationen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corneal knife | Surgipro | SPOI-070 | knife x 1 |
| DMEM/F-12, HEPES | Life Technologies | 11330-032 | 500 ml x 4 |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1X w/out Ca or Mg | VWR | 45000-434 | 500 ml x 6 |
| Fetal Bovine Serum, Regular (Heat Inactivated) | VWR | 45000-736 | 500 ml x 1 |
| FGF-Basic (AA 10-155) Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG0021 | 100 µg x 1 |
| IDE-1 | Stemgent | 04-0026 | 2 mg x 1 |
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | 500 ml x 1 |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828-028 | 500 ml x 1 |
| L-Glutamine 200 mM | Life Technologies | 25030-081 | 100 ml x 1 |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X | Life Technologies | 11140-050 | 100 ml x 1 |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | 100 g x 1 |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-148 | 20 ml x 1 |
| Recombinant Human/Murine/Rat Activin A | PeproTech | 120-14E | 10 µg x 2 |
| Synthemax-T Surface 6 Well Plates | Corning | 3877 | Case(12) x 1 |
| TrypLE-Express Enzyme (1X), no phenol red | Life Technologies | 12604-021 | 500 ml x 1 |
| Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.1µm pore, 500ml | Corning | 431475 | Case(12) x 1 |
References
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