Protocol
स्टेम सेल व्युत्पन्न RPE के 1. निर्देशित भेदभाव
नोट: सभी ऊष्मायन चरणों 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर बाहर किया जाता है
- रखरखाव मीडिया (; तालिका 1 मिमी) में hes या कूल्हों लाइनें (दैनिक फ़ीड) बनाए रखें। लाइनों के गुणवत्ता नियंत्रण के लिए पर्याप्त मानकों तक पहुँच जाने के बाद, माउस भ्रूण फीडर कोशिकाओं की एक परत पर उन्हें बनाए रखने के (MEFs) 250000 के घनत्व / अच्छी तरह से एक छह अच्छी तरह से थाली में वरीयता प्राप्त। Xeno मुक्त संस्कृतियों भी टकर एट अल। 40 द्वारा स्थापित प्रोटोकॉल के बाद उत्पन्न किया जा सकता है।
- स्टेम सेल कालोनियों confluency तक पहुँचने के लिए अनुमति देते हैं।
- Nicotinamide (; 1 टेबल डीएम / एनआईसी) के साथ भेदभाव मीडिया में स्विच करें; दैनिक खिलाओ।
- RPE के भेदभाव को बढ़ाने के लिए, संस्कृति में तीन सप्ताह के बाद, निकोटिनामाइड और या तो Activin-ए या आईडीई-1 (1 टेबल डीएम / एनआईसी / एए या डीएम / एनआईसी / IDE1) के साथ भेदभाव मीडिया के लिए स्विच। संस्कृति में पांच सप्ताह के बाद, डीएम / एनआईसी वापस करने के लिए स्विच करें। दैनिक feedings के नहीं रह खिलाने के बाद पीले दिन मोड़ मीडिया को रोकने में पीएच संकेतक एक बार जरूरी हैं।
- (आंकड़े 2 डी-एफ और 3 ए देखें) पर्याप्त कटौती और हटाया जा करने के लिए बड़े हैं कि प्रकट करने के लिए pigmented कोशिकाओं के टापू के लिए प्रतीक्षा करें।
2. अलग Pigmented आइलेट्स
- कोट प्राकृतिक सेल पर्यावरण (Xeno मुक्त बेहतर है) mimics कि एक मैट्रिक्स के साथ एक 24 अच्छी तरह से थाली के कुओं।
नोट: कॉर्निया ब्लेड और तेज, ठीक इत्तला दे दी संदंश चुनने के लिए बहुत उपयोगी होते हैं। उठा जबकि विभेदित कोशिकाओं की पूरी चादर अलग कर सकते हैं। ध्यान से काम कर रहा है और शुरू में पकवान के केंद्र में कालोनियों उठा द्वारा इस से बचें। - (; 1 टेबल डीएम) जरूरत के रूप में भेदभाव मीडिया के साथ 24 अच्छी तरह से थाली के रूप में कई कुओं भरें। पिगमेंटड कालोनियों की संख्या पर निर्भर करेगा यह निर्णयएकत्र की।
- एक विदारक गुंजाइश के साथ एक सेल संस्कृति हुड में, मैन्युअल रूप से pigmented टापू बाहर काटा। के बारे में 2-6 टुकड़ों में एक स्केलपेल का उपयोग मूल थाली के तल पर प्रत्येक आइलेट काटना और तेज संदंश के साथ पिगमेंटड भागों हासिल किया है।
- प्रत्येक 24 कुएं में 1-2 से pigmented टुकड़े स्थानांतरण।
- कोशिकाओं पालन जब तक 3-5 दिनों के लिए मीडिया को बदल नहीं है, तो मीडिया प्रति सप्ताह तीन बार बदल रहा शुरू करते हैं। (वे इस समय के बाद पालन नहीं करते हैं, तो संभावना है कि वे कभी नहीं होगा कि अच्छा है)।
- (; 1 टेबल डीएम) - एक विशिष्ट संस्कृति का एक छवि 3B चित्रा में दिखाया गया है भेदभाव मीडिया में 3-4 सप्ताह के लिए कोशिकाओं का विस्तार करें। कोशिकाओं को अभी भी पूरे अच्छी तरह से नहीं भर सकता है, लेकिन लंबे समय तक इंतजार कर मदद करने के लिए प्रतीत नहीं होता। प्रति सप्ताह कोशिकाओं तीन बार फ़ीड।
- के बारे में तीन सप्ताह के बाद, मैन्युअल रूप से तेज संदंश के साथ यदि आवश्यक हो तो गुच्छों में सफेद कोशिकाओं के समूहों को हटा दें। यह जरूरी है कि जब तक इस कदम मत करो - यह contaminants को लागू करने के लिए आसान है। यह करने के लिए आदर्श हैकदम 1.6 में मूल पिगमेंटड कालोनियों से RPE के शुद्धतम आबादी प्राप्त करने के लिए प्रयास करें।
3. Passaging स्टेम सेल व्युत्पन्न RPE
- एक सेल हदबंदी समाधान के साथ 200 μl साथ कोशिकाओं को अलग 37 डिग्री सेल्सियस पर 5-8 मिनट के लिए (अधिमानतः कमजोर पड़ने बेहतर है के माध्यम से निष्क्रिय किया जा सकता है कि अभिकर्मक-एक trypsin नहीं), और डीएम के साथ गिराए द्वारा इसे निष्क्रिय। सभी कोशिकाओं से दूर धोने के लिए और (दो 24 कुओं से कोशिकाओं पूलिंग पर विचार करें, केवल कुछ ही सेल शामिल हैं अच्छी तरह से चुना है) उन्हें resuspend करने के लिए एक 200 μl पिपेट का प्रयोग करें।
- अपकेंद्रित्र (5 मिनट के लिए 800 XG), 3 मिलीग्राम डीएम मीडिया में सतह पर तैरनेवाला, और resuspend त्यागें।
- पुन: थाली कोशिकाओं एक (या दो) अच्छी तरह से प्रति डीएम के 3 मिलीलीटर में एक मैट्रिक्स लेपित 6 अच्छी तरह से में 24 कुओं से (1: 5 विस्तार)।
- कोशिकाओं ~ 90% मिला हुआ हैं जब तक 1-2 सप्ताह के लिए विस्तार करें; पूरी तरह से विभेदित शुद्ध संस्कृति की एक छवि चित्रा -3 सी में दिखाया गया है।
- 1 मिलीलीटर सेल डी के साथ कोशिकाओं को अलग करें37 डिग्री सेल्सियस के बारे में 5-8 मिनट के लिए issociation समाधान, डीएम के साथ कमजोर पड़ने से यह निष्क्रिय सभी कोशिकाओं से दूर धोने के लिए 1000 μl पिपेट का उपयोग करें, और उन्हें resuspend।
- (5 मिनट के लिए 800 XG) नीचे स्पिन 18 मिलीलीटर डीएम मीडिया में सतह पर तैरनेवाला, और resuspend त्यागें।
- (: 6 विस्तार 1) या 75cm दो कुप्पी एक-लेपित (1: 7.5 विस्तार) छह मैट्रिक्स में एक 6 अच्छी तरह से प्रत्येक से पुन: थाली कोशिकाओं अच्छी तरह से प्रति डीएम के 3 मिलीलीटर में 6 कुओं लेपित।
- पर्याप्त कोशिकाओं प्राप्त कर रहे हैं जब तक दोहराएँ 3.4-3.8 के रूप में आवश्यक कदम।
नोट: बल्कि प्रत्येक बीतने RPE dedifferentiation लाती है के बाद से passaging के माध्यम संस्कृतियों बढ़ाना करने की योजना बना से विस्तार के लिए संभव के रूप में कई कालोनियों को इकट्ठा करने की कोशिश करो।
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Representative Results
चित्रा 1 में दिखाया गया है, इस पांडुलिपि में उल्लिखित चरणों, पहले 10,12 रिपोर्ट के रूप में आसानी से स्टेम सेल से RPE उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। कई हफ्तों के लिए आईपीएस लाइनों को बनाए रखने के बाद, पिगमेंटड कालोनियों 5-7 सप्ताह (7 सप्ताह पुरानी संस्कृतियों 2A चित्रा-सी में दिखाया जाता है) के बाद कालोनियों में आने लगते हैं। इन कालोनियों संस्कृतियों रखा जाता है के रूप में सप्ताह के लिए विकसित करने के लिए जारी रख सकते हैं। चित्रा 3 ए में सचित्र के रूप में चित्रा 2 डी-एफ (8 सप्ताह पुरानी संस्कृतियों) में दिखाया गया है, पर्याप्त आकार तक पहुँचने के जाने के बाद, वे स्वयं excised जा सकता है। सावधान छांटना बहुत पर्याप्त शुद्ध RPE संस्कृतियों (चित्रा 3 बी-सी) की पीढ़ी की सुविधा होगी गैर RPE कोशिकाओं के साथ संक्रमण से बचने के लिए।
चित्रा 1: योजनाबद्ध चित्रण आईपीएस RPE व्युत्पत्ति यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: एक एक Activinडी आईडीई-एक आईपीएस RPE की उपज बढ़ाने के लिए। (ए) लघु पिगमेंटड कालोनियों (6 अच्छी तरह से थाली के नीचे करने के लिए पक्षपाती है कि अनायास एक पत्रक में गैर RPE कोशिकाओं के बीच संस्कृति में सात सप्ताह के बाद कुछ दिखाई शुरू ) तीर के साथ चिह्नित कर रहे हैं। (बी और सी) भी अधिक पिगमेंटड कालोनियों की उपस्थिति में आईडीई-1 या Activin एक परिणाम के साथ पूरकता (कुछ एसी में तीर के साथ चिह्नित कर रहे हैं) Activin एक या आईडीई-1 के साथ या तो उस पूरकता का प्रदर्शन RPE को बढ़ाता है भेदभाव। (लोमो) 8 सप्ताह आईडीई-1 या Activin एक साथ पूरकता के प्रभाव के बाद और भी स्पष्ट कर रहे हैं। दोनों पिगमेंटड टापू की संख्या और आकार निर्देशित भेदभाव के बाद बड़े होते हैं। स्केल बार = 5 मिमी
चित्रा 3: विस्तार और के टर्मिनल भेदभावआबकारी करने के लिए काफी बड़ी है कि एक pigmented आईपीएस RPE कॉलोनी के पिगमेंटड आईपीएस RPE। (ए) प्रतिनिधि छवि। गैर-RPE कोशिकाओं 6 अच्छी तरह से थाली के तल में कॉलोनी के चारों ओर। नीले रंग की रूपरेखा excised किया जाएगा कि क्षेत्र के निशान। पहला विस्तार कदम के बाद संस्कृति में पोस्ट-मिला हुआ अपरिपक्व आईपीएस RPE कोशिकाओं (बी) छवि। (ग) दो महीने पुराने टर्मिनली विभेदित आईपीएस RPE कोशिकाओं। उन्नत भेदभाव का प्रदर्शन स्पष्ट सेल सीमाओं और रंजकता के समरूप स्तर की उपस्थिति ध्यान दें। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन
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Discussion
इस पांडुलिपि में हम कुशलतापूर्वक शुद्ध आईपीएस RPE संस्कृतियों की बड़ी संख्या उत्पन्न करने के लिए कदम रूपरेखा। हम दृढ़ता से transcriptomics, प्रोटिओमिक्स, metabolomics, और कार्यक्षमता के आधार पर hRPE सदृश है कि आईपीएस RPE उत्पन्न कर सकते हैं कि Activin एक साथ इस निर्देशित भेदभाव प्रोटोकॉल का उपयोग पहले से पता चला है, और आरसीएस चूहों 12,31,32 में प्रत्यारोपित किया जब वे रेटिना अध: पतन मंदबुद्धि कि । आईपीएस RPE पैदा करने की प्रक्रिया समय लेने वाली है, लेकिन नहीं श्रमसाध्य (चित्रा 1) है। आईपीएस संस्कृतियों confluency तक पहुंचने एक बार वे एक दैनिक आधार पर भेदभाव मीडिया के साथ खिलाया जाना चाहिए। हम Activin एक या एक कम महंगा छोटे अणु आईडीई-1 के साथ या तो मीडिया के पूरक हैं, और आम तौर पर 5-7 सप्ताह (2A चित्रा-सी) के बाद दिखाई देते हैं कि पिगमेंट आईपीएस RPE कालोनियों के लिए संस्कृतियों की निगरानी करते हुए दो सप्ताह के लिए खिला जारी है। एक बार जब पर्याप्त आकार तक पहुँचने (आंकड़े 2 डी-एफ और 3 ए), coloniतों मैन्युअल रूप से हटा दिया है और विस्तार के लिए नई प्लेटों के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं। यह मोटे तौर पर के बाद 8 सप्ताह होता है और पूरे प्रोटोकॉल का सबसे कठिन कदम है।
सबसे चुनौतीपूर्ण पहलू अकस्मात में या पिगमेंटड कालोनियों के आसपास अवांछित पड़ोसी कोशिकाओं को इकट्ठा करके विस्तार हो संस्कृतियों में गैर RPE कोशिकाओं के साथ संदूषण से परहेज है। संदूषण की डिग्री पर निर्भर करता है, गैर-RPE कोशिकाओं के द्वीपों संस्कृतियों बढ़ रहे हैं बैक्टीरियल या फंगल contaminants को शुरू करने की अतिरिक्त जोखिम नियंत्रित किया जाता है हर बार हालांकि, विस्तार के दौरान मैन्युअल रूप से हटाया जा सकता है। यह हमारे अनुभव में आईपीएस RPE वास्तव में passaging के चरणों के दौरान contaminating कोशिकाओं की एक छोटी संख्या "outcompete" कर सकते हैं कि ध्यान देने योग्य है। लेकिन हम दृढ़ता से वे इन चरणों का सहारा होने से बचने के लिए संभव के रूप में शुद्ध कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए कालोनियों उठा जब बड़ी सावधानी लेने की सलाह देते। दूसरे या तीसरे पारित होने से आईपीएस RPE संस्कृतियों पर्याप्त शुद्ध और suffi हैंकोशिकाओं के cient संख्या लक्षण वर्णन और आरोपण के लिए उपलब्ध हैं।
यहां बताया तकनीक निश्चित रूप से स्टेम सेल व्युत्पन्न RPE पाने के लिए एकमात्र तरीका नहीं है। वास्तव में यह न तो सबसे आसान है और न ही सबसे तेज है। सबसे आसान और सबसे व्यापक रूप से विधि सहज भेदभाव का उपयोग करने के लिए है। (हालांकि, दो सप्ताह के लिए आईडीई-1 के साथ पूरकता सस्ती है और बहुत आईपीएस RPE के पैदावार बढ़ जाती है।) आईपीएस RPE भी की सतह का पालन करने के लिए मजबूर किया जा सकता है कि ध्रुवीकरण RPE कोशिकाओं के क्षेत्रों में अंतर है कि embryoid शरीर में उत्पन्न किया है संस्कृति प्लेट और एक monolayer के रूप में विस्तार। RPE कोशिकाओं भी बहुत सख्ती लक्षण वर्णन किया गया और दृढ़ता hRPE 27 सदृश है इस पद्धति का उपयोग उत्पन्न करते हैं। RPE निकोटिनामाइड के साथ मीडिया का सप्लीमेंट द्वारा स्टेम सेल से (केवल 14 दिनों में) तेजी से बेहद अंतर कर सकते हैं, IGF1, नोगिन, Dkk1, और bFGF फिर बाद में समर्थक RPE निकोटिनामाइड कारकों जोड़ने, तंत्रिका रेटिना पूर्वज भाग्य के लिए उन्हें बदलने के लिएएन डी Activin एक 37। RPE भी cMYC, MITF, OTX2, RAX, और CRX 44 सहित प्रतिलेखन कारकों की एक न्यूनतम सेट के साथ fibroblasts transducing द्वारा मोटे तौर पर एक महीने में fibroblasts से भी अधिक तेजी से सीधे उत्पन्न किया जा सकता है। हालांकि, इन परिणामों बहुत RPE प्रोत्साहित कर रहे हैं, जबकि इन पिछले दो तकनीकों अभी तक कड़ाई से vivo में उन्हें दाखिल द्वारा विशेषता नहीं किया गया है उत्पन्न। इसलिए, हम अपने अध्ययन में काम करने के लिए निर्णय लेने से जो जब पाठक ध्यान से सभी RPE व्युत्पत्ति विकल्पों पर विचार का सुझाव है कि।
यहाँ उल्लिखित प्रोटोकॉल का उपयोग करने के फायदे अपनी सादगी और बहुत ही उच्च गुणवत्ता वाले RPE 31 के लगातार उच्च पैदावार कर रहे हैं। आईडीई-1 के बजाय Activin एक साथ पूरकता बहुत पुनः संयोजक प्रोटीन का उपयोग करने के साथ जुड़े जोखिम कुल लागत कम कर देता है और कम करती है। विकल्प नहीं होगा अलग भेदभाव तरीकों का उपयोग करने के लिए अगर यह अभी तक स्पष्ट नहीं है के बाद सेअंतिम उत्पाद पर एक प्रभाव है, यह विभिन्न प्रयोगशालाओं में उत्पन्न RPE के बीच प्रत्यक्ष तुलना (शायद विशेष रूप से रोग मॉडलिंग के मामले में) के लिए आवश्यक हो जाएगा, खासकर अगर मानकीकृत प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए फायदेमंद हो सकता है। थोड़ा विशेषज्ञता और अभिकर्मकों की आवश्यकता है, और कहा कि आईपीएस RPE के उच्च उपज उत्पन्न करता है कि यह एक तरह एक साधारण प्रोटोकॉल इन स्थितियों के लिए आदर्श हो सकता है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corneal knife | Surgipro | SPOI-070 | knife x 1 |
| DMEM/F-12, HEPES | Life Technologies | 11330-032 | 500 ml x 4 |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1X w/out Ca or Mg | VWR | 45000-434 | 500 ml x 6 |
| Fetal Bovine Serum, Regular (Heat Inactivated) | VWR | 45000-736 | 500 ml x 1 |
| FGF-Basic (AA 10-155) Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG0021 | 100 µg x 1 |
| IDE-1 | Stemgent | 04-0026 | 2 mg x 1 |
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | 500 ml x 1 |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828-028 | 500 ml x 1 |
| L-Glutamine 200 mM | Life Technologies | 25030-081 | 100 ml x 1 |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X | Life Technologies | 11140-050 | 100 ml x 1 |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | 100 g x 1 |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-148 | 20 ml x 1 |
| Recombinant Human/Murine/Rat Activin A | PeproTech | 120-14E | 10 µg x 2 |
| Synthemax-T Surface 6 Well Plates | Corning | 3877 | Case(12) x 1 |
| TrypLE-Express Enzyme (1X), no phenol red | Life Technologies | 12604-021 | 500 ml x 1 |
| Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.1µm pore, 500ml | Corning | 431475 | Case(12) x 1 |
References
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