Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Effektiv Utledning av retinal pigment epitelet Celler fra stamceller

Published: March 8, 2015 doi: 10.3791/52214

Protocol

1. Directed Differensiering av Stem Cell-avledet RPE

MERK: Alle ruge trinnene er utført ved 37 ° C i 5% CO 2

  1. Vedlikeholde HMS eller hofter linjer (beiter daglig) i vedlikehold media (MM, tabell 1). Når linjene har nådd tilstrekkelig standarder for kvalitetskontroll, holde dem på et lag av museembryo feeder-celler (MEFs) sådd ut i en tetthet på 250 000 / brønn av seks-brønners plate. Xeno-free kulturer kan også genereres følge protokollen etablert av Tucker et al. 40.
  2. Tillate stamcelle koloniene å nå confluency.
  3. Bytt til differensiering media med nikotinamid (DM / NIC, tabell 1); mate daglig.
  4. Etter tre uker i kultur, bytte til differensiering media med nikotinamid og enten aktivin-A eller IDE-1 (DM / NIC / AA eller DM / NIC / IDE1, tabell 1) for å forbedre RPE differensiering. Etter fem uker i kultur, bytte tilbake til DM / NIC. Daglige feedings er ikke lenger nødvendig når pH-indikatorer i media stopp snu gule dagen etter fôring.
  5. Vent på holmer av pigmenterte celler til å synes som er store nok til å bli kuttet og fjernet (se figurene 2D-F og 3A).

2. Isolere Pigmenterte holmer

  1. Belegge brønnene i en 24-brønners plate med en matrise som etterligner den naturlige cellemiljø (xeno-fri er å foretrekke).
    MERK: hornhinnen kniver og skarpe, tynn tang er veldig nyttig for å plukke. Hele ark med differensierte celler kan løsrive mens plukke. Unngå dette ved å jobbe nøye og i utgangspunktet plukke kolonier i sentrum av fatet.
  2. Fylle så mange brønner på 24-brønns plate med differensiering media (DM, Tabell 1) som trengs. Denne avgjørelsen vil avhenge av antallet av pigmenterte kolonieroppsamlet.
  3. I en cellekultur hette med en dissekere omfang, kuttet manuelt ut pigment holmer. Hakke opp hver holme på bunnen av den opprinnelige plate ved hjelp av en skalpell i ca 2-6 stykker og ta tak i pigmenterte deler med skarpe tang.
  4. Overfør 1-2 pigmenterte stykker i hver 24-brønnen.
  5. Ikke endre media i 3-5 dager før cellene holder seg, deretter begynne å endre media tre ganger per uke. (Hvis de ikke holder seg etter dette tidspunktet, er sannsynligheten stor for at de aldri vil).
  6. Utvide celler i 3-4 uker i differensiering media (DM, Tabell 1) - Et bilde av en typisk kultur er vist i figur 3B. Celler kan fortsatt ikke fylle hele godt, men venter lenger ser ikke ut til å hjelpe. Mate cellene tre ganger per uke.
  7. Etter ca 3 uker, manuelt fjerne klynger av hvite celler i klumper om nødvendig med skarpe tang. Ikke gjør dette trinnet med mindre det er nødvendig - er det enkelt å innføre forurensninger. Det gjør det enkelt åprøve å få reneste bestander av RPE fra de opprinnelige pigmenterte kolonier i trinn 1.6.

3. aging Stem Cell-avledet RPE

  1. Løsne cellene med 200 ul med en oppløsning av celledissosieringsmedium (fortrinnsvis ikke trypsin-et reagens som kan bli inaktivert ved fortynning er å foretrekke) i 5-8 minutter ved 37 ° C, og inaktivere det ved fortynning med DM. Bruk en 200 mL pipette for å vaske av alle celler og å suspendere dem (Hvis den valgte brønn inneholder bare noen få celler, vurdere sammenslåing cellene fra to 24-brønner).
  2. Sentrifuger (800 xg i 5 min), kast supernatanten, og resuspender i 3 ml DM media.
  3. Re-plateceller fra en (eller to) 24-brønner i en matrise lakkert 6-brønn i 3 ml DM per brønn (1: 5 ekspansjon).
  4. Ekspandere i 1-2 uker før cellene er ~ 90% sammenflytende; et bilde av fullt differensiert ren kultur er vist i figur 3C.
  5. Løsner celler med en ml celle dissociation løsning i ca. 5-8 min ved 37 ° C, inaktivere det ved fortynning med DM, bruker 1000 ul pipette for å vaske av alle celler, og resuspendere dem.
  6. Spinne ned (800 xg i 5 min), kast supernatanten, og resuspender i 18 ml DM media.
  7. Re-plate-celler fra en 6-brønns hver i seks matrise lakkert 6-brønner i 3 ml DM per brønn (1: 6 ekspansjon) eller en belagt 75cm 2-kolbe (1: 7.5 ekspansjon).
  8. Gjenta trinn 3,4-3,8 som nødvendig til nok celler oppnås.
    MERK: Prøv å samle så mange kolonier som mulig for utvidelse i stedet planlegger å forsterke kulturer via aging siden hver passering induserer RPE dedifferentiation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Trinnene i dette manuskriptet, som vist i figur 1, kan brukes til lett generere RPE fra stamceller som tidligere rapportert 10,12. Etter å ha holdt iPS linjer for flere uker, pigmenterte kolonier begynner å vises i koloniene etter 5-7 uker (7 uker gamle kulturer er vist i figur 2A-C). Disse koloniene kan fortsette å vokse i flere uker som kulturene opprettholdes. Når nådd tilstrekkelig størrelse, som vist i Figur 2D-F (8 uker gamle kulturer), kan de bli spaltet ut manuelt som vist i figur 3A. Forsiktig eksisjon for å unngå forurensing med ikke-RPE cellene vil i stor grad forenkle generasjon tilstrekkelig rene RPE kulturer (Figur 3B-C).

Figur 1
Figur 1: Skjematisk skildrer iPS-RPE avledning Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: aktivin A end IDE-1 forbedre utbyttet av IPS-RPE. (A) Små pigmenterte kolonier begynner å dukke opp etter syv uker i kultur spontant mellom ikke-RPE-celler i et enkelt ark som er vedhengende til bunnen av en 6-brønns plate (noen er merket med piler). (B og C) Tilskudd med IDE-en eller aktivin A resulterer i utseendet enda mer pigmenterte kolonier (noen er merket med piler i AC) som viser at tilskudd med enten aktivin A eller IDE-en forsterker RPE differensiering. (DF) Etter 8 uker effekten av tilskudd med IDE-en eller aktivin A er enda mer uttalt. Både antallet og størrelsene av de pigmenterte holmer er større etter anvist differensiering. Skala bar = 5 mm

Figur 3
Figur 3: Utvidelse og terminal differensiering avpigment iPS-RPE. (A) Representant bilde av en pigmentert iPS-RPE koloni som er stor nok til å avgiftsdirektoratet. Ikke-RPE-celler omgir kolonien i bunnen av en 6-brønns plate. Den blå omriss markerer regionen som ville bli tatt ut. (B) Bilde av post-konfluente umodne iPS-RPE celler i kultur etter den første ekspansjonstrinnet. (C) To måneder gamle terminalt differensiert iPS-RPE celler. Legg merke til tilstedeværelsen av åpenbare celle grenser og homogene nivåer av pigmentering demonstrere avansert differensiering. Skala barer = 100 mikrometer

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dette manuskriptet skissere vi trinnene til effektivt å generere et stort antall rene iPS-RPE kulturer. Vi har vist tidligere ved hjelp av dette rettet differensiering protokoll med aktivin En som vi kan generere iPS-RPE som sterkt ligner hRPE basert på transcriptomics, proteomikk, metabolomics og funksjonalitet, og at de forsinker retinal degenerasjon når implantert i RCS rotter 12,31,32 . Prosessen med å generere IPS-RPE er tidkrevende, men ikke arbeidskrevende (figur 1). Når iPS kulturer nå confluency må de mates med differensiering media på en daglig basis. Vi supplere media med enten aktivin A eller en rimeligere lite molekyl IDE-en, og fortsette å fôre i to uker mens overvåking kulturene for pigment iPS-RPE kolonier som vanligvis vises etter 5-7 uker (Figur 2A-C). Når nå tilstrekkelige størrelser (Tall 2D-F og 3A), den colonies fjernes manuelt og overdratt til nye plater for ekspansjon. Dette skjer omtrent etter 8 uker, og er den mest arbeidskrevende trinn i hele protokollen.

Den mest utfordrende delen er å unngå forurensning med ikke-RPE celler i de voksende kulturer ved et uhell samle uønskede naboceller i eller rundt pigmenterte kolonier. Avhengig av graden av forurensning, kan øyene ikke-RPE-celler fjernes manuelt under ekspansjon, selv om hver gang kulturene håndteres ytterligere risiko for å innføre bakterie- eller sopp forurensninger økes. Det er verdt å merke seg at i vår erfaring iPS-RPE kan faktisk "utkonkurrere" et lite antall forurensende celler under passering trinn. Men vi anbefaler sterkt å ta stor forsiktighet når plukke kolonier for å sikre at de er så ren som mulig for å unngå å måtte ty til disse trinnene. Ved den andre eller tredje gangen de iPS-RPE kulturer er tilstrekkelig ren og tilstrekkestillede antall celler er tilgjengelige for karakterisering og implantasjon.

Teknikken rapportert her er sikkert ikke den eneste metoden for å utlede stamcelle avledet RPE. Faktisk er det verken den enkleste eller raskest. Den enkleste og mest utbredte metode er å bruke spontane differensiering. (Men, er kosttilskudd med IDE-en for to uker billig og kraftig øker utbyttet av iPS-RPE.) IPS-RPE har også generert i embryoid organer som skiller inn kuler av polariserte RPE celler som kan bli tvunget til å følge overflaten av kulturplater og ekspandere som en monolayer. RPE celler generere ved hjelp av denne metoden har også blitt svært kraftig preget og sterkt likne hRPE 27. RPE kan skille ekstremt raskt (i bare 14 dager) fra stamceller ved å supplere media med nikotinamid, IGF1, Noggin, DKK1, og bFGF å konvertere dem til nerve retinal progenitor skjebner, så senere å legge den pro-RPE faktorer nikotinamid ennd aktivin En 37. RPE kan også genereres enda raskere direkte fra fibroblaster i omtrent en måned etter transducing fibroblaster med et minimalt sett med transkripsjonsfaktorer inkludert cMYC, MITF, OTX2, RAX, og CRX 44. Men mens disse resultatene er svært oppmuntrende RPE genererte disse to siste teknikker har ennå ikke blitt grundig preget av implantere dem in vivo. Derfor foreslår vi at leseren vurdere alle RPE derivasjon alternativene nøye når du bestemmer hvilke å ​​ansette i sine studier.

Fordelene med å bruke protokollen skissert her er dens enkelhet og konsekvent høy avkastning av meget høy kvalitet RPE 31. Tilskudd med IDE-en i stedet for aktivin En sterkt reduserer den totale kostnaden og reduserer risikoen involvert med hjelp av rekombinante proteiner. Siden det er ennå ikke klart om valget mellom å bruke ulike differensieringsmetoder vil haen innvirkning på sluttproduktet, kan det være fordelaktig å benytte standardiserte protokoller, særlig hvis direkte sammenligninger mellom RPE genereres i forskjellige laboratorier, vil det være nødvendig (kanskje særlig i tilfelle av sykdoms modellering). En enkel protokoll som dette som krever lite kompetanse og reagenser, og som genererer høy avkastning av iPS-RPE, kan være ideell for slike situasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Corneal knife  Surgipro SPOI-070 knife x 1
DMEM/F-12, HEPES Life Technologies 11330-032 500 ml x 4 
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1X w/out Ca or Mg VWR 45000-434 500 ml x 6
Fetal Bovine Serum, Regular (Heat Inactivated) VWR 45000-736 500 ml x 1
FGF-Basic (AA 10-155) Recombinant Human Protein Life Technologies PHG0021 100 µg x 1
IDE-1 Stemgent 04-0026 2 mg x 1
Knockout DMEM Life Technologies 10829-018 500 ml x 1 
KnockOut Serum Replacement Life Technologies 10828-028 500 ml x 1
L-Glutamine 200 mM  Life Technologies 25030-081 100 ml x 1
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X  Life Technologies 11140-050 100 ml x 1
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636-100G 100 g x 1
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Life Technologies 15140-148 20 ml x 1
Recombinant Human/Murine/Rat Activin A  PeproTech 120-14E 10 µg x 2
Synthemax-T Surface 6 Well Plates Corning 3877 Case(12) x 1
TrypLE-Express Enzyme (1X), no phenol red  Life Technologies 12604-021 500 ml x 1 
Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.1µm pore, 500ml  Corning 431475 Case(12) x 1 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol Rev. 85 (3), 845-881 (2005).
  2. Congdon, N. Causes and prevalence of visual impairment among adults in the United States. Arch Ophthalmol. 122 (4), 477-485 (2004).
  3. Friedman, D. S. Prevalence of age-related macular degeneration in the United States. Arch Ophthalmol. 122 (4), 564-572 (2004).
  4. Resnikoff, S. Global data on visual impairment in the year. Bull World Health Organ. 82 (11), 844-851 (2002).
  5. Bird, A. C. Therapeutic targets in age-related macular disease. The Journal of Clinical Investigation. 120 (9), 3033-3041 (2010).
  6. Jong, P. T. Age-related macular degeneration. N Engl J Med. 355 (14), 1474-1485 (2006).
  7. Binder, S., Stanzel, B. V., Krebs, I., Glittenberg, C. Progress In Retinal And Eye Research. Transplantation of the RPE in AMD. 26 (5), 516-554 (2007).
  8. Cruz, L., Chen, F. K., Ahmado, A., Greenwood, J., Coffey, P. RPE transplantation and its role in retinal disease. Progress In Retinal And Eye Research. 26 (6), 598-635 (2007).
  9. Carr, A. J. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4 (12), e8152 (2009).
  10. Idelson, M. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional retinal pigment epithelium cells. Cell Stem Cell. 5 (4), 396-408 (2009).
  11. Klimanskaya, I. Derivation and comparative assessment of retinal pigment epithelium from human embryonic stem cells using transcriptomics. Cloning Stem Cells. 6 (3), 217-245 (2004).
  12. Krohne, T. Generation of retinal pigment epithelial cells from small molecules and OCT4-reprogrammed human induced pluripotent stem cells. Stem Cells Translational Medicine. 1 (2), 96-109 (2012).
  13. Lund, R. D. Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats. Cloning Stem Cells. 8, 189-199 (2006).
  14. Vugler, A. Elucidating the phenomenon of HESC-derived RPE: anatomy of cell genesis, expansion and retinal transplantation. Exp Neurol. 214 (2), 347-361 (2008).
  15. Algvere, P. V., Berglin, L., Gouras, P., Sheng, Y. Transplantation of fetal retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration with subfoveal neovascularization. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 232 (12 ), 707-716 (1994).
  16. Binder, S. Outcome of transplantation of autologous retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: a prospective trial. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (11), 4151-4160 (2004).
  17. Binder, S. Transplantation of autologous retinal pigment epithelium in eyes with foveal neovascularization resulting from age-related macular degeneration: a pilot study. Am J Ophthalmol. 133 (2), 215-225 (2002).
  18. Falkner-Radler, C. I. Human retinal pigment epithelium (RPE) transplantation: outcome after autologous RPE-choroid sheet and RPE cell-suspension in a randomised clinical study. British Journal of Ophthalmology. 95 (3), 370-375 (2011).
  19. Li, Y. Long-term safety and efficacy of human-induced pluripotent stem cell (iPS) grafts in a preclinical model of retinitis pigmentosa. Molecular Medicine (Cambridge, Mass). 18, 1312-1319 (2012).
  20. Lu, B. Long-Term Safety and Function of RPE from Human Embryonic Stem Cells in Preclinical Models of Macular Degeneration). Stem Cells. 27 (9), 2126-2135 (2009).
  21. Peyman, G. A. A technique for retinal pigment epithelium transplantation for age-related macular degeneration secondary to extensive subfoveal scarring. Ophthalmic Surgery. 22 (2), 102-108 (1991).
  22. Schwartz, S. D. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. The Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
  23. Wang, N. K. Transplantation of reprogrammed embryonic stem cells improves visual function in a mouse model for retinitis pigmentosa. Transplantation. 89 (8), 911-919 (2010).
  24. Cruz, P. M. Mutation of the receptor tyrosine kinase gene Mertk in the retinal dystrophic RCS rat. Human Molecular Genetics. 9 (4), 645-651 (2000).
  25. Buchholz, D. E. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (10), 2427-2434 (2009).
  26. Hirami, Y. Generation of retinal cells from mouse and human induced pluripotent stem cells. Neurosci Lett. 458 (3), 126-131 (2009).
  27. Meyer, J. S. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (39), 16698-16703 (2009).
  28. Osakada, F. In vitro differentiation of retinal cells from human pluripotent stem cells by small-molecule induction. J Cell Sci. 122 (17), 3169-3179 (2009).
  29. Carr, A. J. Molecular characterization and functional analysis of phagocytosis by human embryonic stem cell-derived RPE cells using a novel human retinal assay. Mol Vis. 15, 283-295 (2009).
  30. Kokkinaki, M., Sahibzada, N., Golestaneh, N. Human Induced Pluripotent Stem-Derived Retinal Pigment Epithelium (RPE) Cells Exhibit Ion Transport, Membrane Potential, Polarized Vascular Endothelial Growth Factor Secretion, and Gene Expression Pattern Similar to Native RPE. Stem Cells. 29 (5), 825-835 (2011).
  31. Westenskow, P., Friedlander, M. Ch. 111. The New Visual Neurosciences. Werne, J. S., Chalupa, L. M. , The MIT Press. Cambridge, MA. 1611-1626 (2013).
  32. Westenskow, P. D. Using flow cytometry to compare the dynamics of photoreceptor outer segment phagocytosis in iPS-derived RPE cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (10), 6282-6290 (2012).
  33. Algvere, P. V., Gouras, P., Dafgard Kopp,, E, Long-term outcome of RPE allografts in non-immunosuppressed patients with AMD. Eur J Ophthalmol. 9 (3), 217-230 (1999).
  34. Zhang, X., Bok, D. Transplantation of retinal pigment epithelial cells and immune response in the subretinal space. Invest Ophthalmol Vis Sci. 39 (6), 1021-1027 (1998).
  35. Gamm, D. M., Phillips, M. J., Singh, R. Modeling retinal degenerative diseases with human iPS-derived cells: current status and future implications. Expert Review Of Ophthalmology. 8, 213-216 (2013).
  36. Singh, R. iPS cell modeling of Best disease: insights into the pathophysiology of an inherited macular degeneration. Hum Mol Genet. 22 (3), 593-607 (2013).
  37. Buchholz, D. E. Rapid and efficient directed differentiation of human pluripotent stem cells into retinal pigmented epithelium. Stem Cells Transl Med. 2 (5), 384-393 (2013).
  38. Fuhrmann, S., Levine, E. M., Reh, T. A. Extraocular mesenchyme patterns the optic vesicle during early eye development in the embryonic chick. Development (Cambridge, England). 127 (21), 4599-4609 (2000).
  39. Borowiak, M. Small molecules efficiently direct endodermal differentiation of mouse and human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 4 (4), 348-358 (2009).
  40. Tucker, B. A., Anfinson, K. R., Mullins, R. F., Stone, E. M., Young, M. J. Use of a synthetic xeno-free culture substrate for induced pluripotent stem cell induction and retinal differentiation. Stem Cells Transl Med. 2 (1), 16-24 (2013).
  41. Ramsden, C. M. Stem cells in retinal regeneration: past, present and future. Development (Cambridge, England). 140 (12), 2576-2585 (2013).
  42. Zhao, T., Zhang, Z. -N., Rong, Z., Xu, Y. Immunogenicity of induced pluripotent stem cells. Nature. 474 (7350), 212-215 (2011).
  43. Zhang, K. Direct conversion of human fibroblasts into retinal pigment epithelium-like cells by defined factors. Protei., & Cell. 5 (1), 48-58 (2013).

Tags

Developmental Biology retinal pigment epitel stamceller translasjonell medisin aldersrelatert makuladegenerasjon regissert differensiering
Effektiv Utledning av retinal pigment epitelet Celler fra stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Westenskow, P., Sedillo, Z.,More

Westenskow, P., Sedillo, Z., Barnett, A., Friedlander, M. Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells. J. Vis. Exp. (97), e52214, doi:10.3791/52214 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter