Protocol
Kök Hücre kaynaklı RPE 1. Yönetmen Farklılaşma
Not: Tüm bekletme işlemleri,% 5 CO2 içinde 37 ° C sıcaklıkta gerçekleştirilmektedir
- Bakım medya (Tablo 1 MM) de embriyonik kök veya HIPS hatları (günlük yem) koruyun. Hat kalite kontrol yeterli standartlarını yakalamış sonra, fare embriyonik besleyici bir hücre tabakası bunları muhafaza (MEF'ler) 250,000 olan bir yoğunluk / gözenek bir altı yuvalı plaka olarak tohumlanır. Xeno içermeyen kültürler de Tucker ve ark. 40 tarafından oluşturulan protokol takip edilerek üretilebilir.
- Kök hücre kolonileri confluency ulaşmak için bekleyin.
- Nikotinamid (Tablo 1 DM / NIC) ile farklılaşma medya geçin; Günlük yem.
- RPE farklılaşmasını geliştirmek, kültür üç hafta sonra, nikotinamid ve ya Aktivin-A veya IDE-1 (Tablo 1 DM / NIC / AA veya DM / NIC / ide1) ile farklılaşma medya geçmek. Kültür beş hafta sonra, DM / NIC geri dönün. Günlük beslenmeye artık beslendikten sonra sarı bir gün dönüm medya durağı pH göstergelerinin kez gereklidir.
- (Şekil 2D F ve 3A bakınız) kadar kesilmesi ve alınması için büyük görünmesi pigmentli hücre adacıkları bekleyin.
2. Yalıtımlı Pigmentli Islets
- Coat doğal hücre ortamı (xeno-ücretsiz tercih edilir) taklit eden bir matris ile 24 plaka kuyu.
NOT: Kornea bıçaklar ve keskin, ince uçlu forseps seçmek için çok yararlıdır. toplama sırasında farklılaşmış hücrelerin tüm levha ayırabilirsiniz. Dikkatli çalışıyor ve başlangıçta yemeğin ortasında koloniler seçerek bu kaçının. - (Tablo 1 DM) gerektiği gibi farklılaşma ortam maddesi ile 24 oyuklu plaka gibi çok sayıda çukur doldurun. Pigmentli koloni sayısına bağlı olacaktır Bu kararToplanan.
- Diseksiyon kapsamı ile bir hücre kültürü kaputu, el pigmentli adacıklar kesip. Yaklaşık 2-6 adet bir neşter kullanılarak orijinal plaka altındaki her adacık kıymak ve keskin forseps ile pigmentli parçaları kapmak.
- Her 24 kuyunun içine 1-2 adet pigmentli aktarın.
- Hücreler uygun kadar 3-5 gün süreyle ortamı değiştirmek etmeyin, daha sonra Ortam haftada üç kez değişen başlar. (Bu saatten sonra uygun değilse, olabilirlik onlar asla o iyidir).
- (Tablo 1 DM) - tipik kültür bir görüntü Şekil 3B'de gösterilmiştir farklılaşma ortamda 3-4 hafta boyunca hücrelerin aç. Hücreler hala tüm kuyu doldurmak olmayabilir ama uzun bekleme yardım görünmüyor. Haftada hücreler üç kez besleyin.
- Yaklaşık 3 hafta sonra, elle keskin forseps ile gerekirse kümeleri beyaz hücrelerin kümeleri kaldırın. Gerekli olmadıkça bu adımı yapmayın - bu kirletici tanıtmak için kolaydır. Bu ideal birAdım 1.6 orijinal pigmentli koloniler gelen RPE saf popülasyonlarının edinmeye çalışın.
3. Pasajlanması Kök Hücre türetilen RPE
- Bir hücre ayrışma çözeltisi ile 200 ul hücreleri ayırmak 37 ° C'de 5-8 dakika boyunca (tercihen seyreltme tercih edilir ile inaktive edilebilir reaktif-a, tripsin olan), ve DM ile sulandırarak bu etkisiz hale getirirler. Tüm hücreleri yıkayın ve (iki 24-kuyulardan hücreleri havuzu düşünün, sadece bir kaç hücreleri içeren iyi seçtiyseniz) onları tekrar süspansiyon 200 ul pipet kullanın.
- Santrifüj (5 dakika için 800 xg), 3 ml DM medya süpernatant ve tekrar süspansiyon atın.
- Yeniden plaka hücreleri bir (veya iki) oyuk başına DM 3 ml bir matris kaplı 6-kuyuya 24 kuyu ile ilgili (1: 5 genişleme).
- Hücreler ~ 90% konfluent kadar 1-2 hafta genişlet; tam olarak farklılaşmış saf kültürünün bir görüntü Şekil 3C 'de gösterilmiştir.
- 1 ml hücre d hücreleri ayırmak37 ° C'de yaklaşık 5-8 dakika boyunca issociation Çözelti, DM ile seyreltme ile inaktive tüm hücreleri yıkamak için 1000 ul pipet kullanın, ve bunları yeniden süspanse edin.
- (5 dk için 800 xg) Spin 18 ml DM medyada süpernatant ve tekrar süspansiyon atın.
- (: 6 genişletme 1) ya da 75 cm 2 balon içinde bir kaplanmış (1: 7.5 genişleme) altı matris içine bir 6-yuvalı her birinden yeniden plaka hücreleri, oyuk başına DM 3 ml 6-kuyu kaplama.
- Yeterli hücre elde edilinceye kadar tekrarlayın 3.4-3.8 olarak gerekli adımları.
NOT: yerine her geçiş RPE dediferansiyonunu indükler beri Pasajlanması aracılığıyla kültürleri yükseltmek için planlama daha genişleme için mümkün olduğunca çok koloniler toplamaya çalışın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1 'de gösterildiği gibi, bu metinde belirtilen adımlar, daha önce rapor edildiği gibi 10,12 kolayca kök hücreler RPE oluşturmak için de kullanılabilir. Birkaç hafta iPS hatları sağlandıktan sonra, pigmentli koloniler 5-7 hafta (7 haftalık kültürler Şekil 2A-C gösterilmiştir) sonra kolonilerde görünmeye başlar. Bu koloniler, kültür muhafaza edildiği gibidir hafta boyunca büyümeye devam edebilirler. Şekil 3A'da gösterildiği gibi, Şekil 2D F (8 haftalık kültür) 'de gösterildiği gibi, yeterli boyutlara ulaştıktan sonra, el ile çıkartılır. Dikkatli eksizyon büyük ölçüde yeterince saf RPE kültürleri (Şekil 3B-C) nesil kolaylaştıracak olmayan RPE hücreleri ile kirlenmesini önlemek için.
Şekil 1: resmeden şematik iPS-RPE türetme , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: A, bir aktivind IDE-1 IPS-RPE verimini artırmak. (A) Küçük pigmentli koloniler (6 plaka altına yapışık olduğunu kendiliğinden tek bir sayfaya olmayan RPE hücreleri arasındaki kültür yedi hafta sonra bazı görünmeye başlar ) oklarla işaretlenmiştir. (B ve C) daha pigmentli koloniler görünümünü IDE-1 veya Aktivin A sonuçlarla takviyesi (bazı AC oklarla işaretlenmiş) Aktivin A veya IDE-1 ile ya takviyesinin gösteren RPE artırır farklılaşma. (DF) 8 hafta IDE-1 veya Aktivin A desteğinin etkileri sonra daha belirgindir. Hem pigmentli adacıklar sayısı ve boyutları yönettiği farklılaşma sonra büyüktür. Ölçek çubuğu = 5 mm
Şekil 3: Genişleme ve terminal farklılaşmatüketim için yeterince büyük bir pigmentli iPS-RPE koloninin pigmente iPS-RPE. (A) Temsilcisi görüntü. Sigara RPE hücreleri, 6 gözlü bir plakanın alt koloni çevreler. mavi anahat eksize olacağını bölgeyi işaret ediyor. ilk genişleme adımından sonra kültür post-konfluen olgunlaşmamış iPS-RPE hücrelerinin (B) Image. (C) İki aylık terminal farklılaşmış iPS-RPE hücreleri. Gelişmiş farklılaşmayı gösteren bariz hücre sınırları ve pigmentasyon homojen seviyelerinin varlığını unutmayın. Ölçek barlar = 100 mikron
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazıda verimli saf iPS-RPE kültürlerin çok sayıda oluşturmak için adımları özetlemektedir. Biz şiddetle transkriptomik, proteomik, metabolomik ve işlevselliğine dayalı hRPE benzer iPS-RPE üretebilir Aktivin A ile yönlendirilmiş farklılaşma protokolü kullanarak önceden göstermiştir, ve RCS sıçanlarda 12,31,32 implante zaman retina dejenerasyonu geciktirir . iPS-RPE üretme süreci, zaman alıcıdır, ancak zahmetli (Şekil 1). IPS kültürleri konfluense ulaştıklarında onlar günlük bazda farklılaşma medya ile beslenmelidir. Biz Aktivin A veya daha az pahalı küçük molekül IDE-1 ya Ortamı ek, ve genellikle 5-7 hafta (Şekil 2A-C) sonra ortaya pigmentli iPS-RPE kolonileri için kültürleri izlerken iki hafta besleme devam ediyor. Bir kez yeterli boyutlarda ulaşan (Şekil 2B-F ve 3A), kolonies elle çıkarılır ve genişleme için yeni plakalara aktarılmıştır. Bu kabaca 8 hafta sonra ortaya çıkar ve tüm protokolün en zahmetli adımdır.
En zorlu yönü yanlışlıkla veya pigmentli koloniler etrafında istenmeyen komşu hücreleri toplayarak genişleyen kültürlerde olmayan RPE hücreleri ile kirlenmesini kaçınmaktır. Kirlenme derecesine bağlı olarak, olmayan RPE hücrelerinin adalar kültürleri artmış bakteriyel veya mantar kirleticileri tanıtan ek riskleri ele her zaman olmasına rağmen, genişleme sırasında el kaldırılabilir. Bu bizim deneyim iPS-RPE aslında Pasajlanması adımları sırasında kirletici hücrelerin az sayıda "outcompete" olduğunu fazlalaştı. Ama biz şiddetle onlar bu adımlara başvurmak zorunda kalmamak için mümkün olduğunca saf sağlamak için koloniler seçerken çok dikkatli alarak tavsiye. Ikinci veya üçüncü geçişi ile iPS-RPE kültürleri yeterince saf ve taşıdıkları risklerle vardırhücre cient numaraları karakterizasyonu ve implantasyon için kullanılabilir.
Burada bildirilen tekniği kesinlikle kök hücre elde edilen RPE türetmek için tek yöntem değildir. Aslında ne kolay, ne de hızlı olduğunu. en kolay ve en yaygın yöntem kendiliğinden farklılaşma kullanmaktır. (Ancak, iki hafta boyunca IDE-1 ile takviyesi ucuz ve büyük ölçüde IPS-RPE verimini artırır.) IPS-RPE de yüzeyine yapışması zorlanamaz polarize RPE hücrelerinin küreler içine ayırt embriyoid bedenlerde yarattı Kültür plakaları ve bir tek tabaka olarak genişletin. RPE hücreleri de çok şiddetle karakterize edilmiş ve şiddetle hRPE 27 benzer olan bu yöntemi kullanarak üretir. RPE nikotinamid ile medya takviye ile kök hücrelerinden (sadece 14 gün) hızla son derece ayırt edebilir, IGF1, Noggin, Dkk1 ve bFGF daha sonra yanlısı RPE nikotinamid a faktörleri ekleyerek, nöral retina progenitör kaderi onları dönüştürmek içinnd Aktivin A 37. RPE, aynı zamanda c-myc, MITF, OTX2, RgX ve CRX 44 de dahil olmak üzere transkripsiyon faktörlerinin en az sayıda fibroblastlar transduse ile yaklaşık bir ay ve fibroblastlarda hatta daha hızlı bir şekilde direkt olarak elde edilebilir. Ancak bu sonuçlar çok RPE teşvik ederken, bu son iki teknikleri henüz titizlikle in vivo implante karakterize edilmemiştir oluşturdu. Bu nedenle, biz onların çalışmalarında istihdam için hangi karar verirken dikkatli okuyucu, tüm RPE türetme seçenekleri dikkate öneririz.
Burada özetlenen protokolü kullanmanın avantajları sadeliği ve çok kaliteli RPE 31 sürekli yüksek verimleri vardır. IDE-1 yerine Aktivin A takviyesi büyük ölçüde rekombinant proteinleri kullanılarak risklerin genel maliyetini azaltır ve düşürür. Seçim olacak, farklı farklılaşma yöntemleri kullanmak için eğer henüz net olmadığınihai ürün üzerinde bir etkisi, farklı laboratuarlarda üretilen RPE arasındaki doğrudan bir karşılaştırma (belki de özellikle hastalık modelleme durumunda) gerekli olacaktır, özellikle, standart protokolleri kullanmak avantajlı olabilir. Küçük uzmanlık ve reaktifler gerektirir ve bu iPS-RPE yüksek verim üreten bu bir, gibi basit bir protokol bu durumlar için ideal olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corneal knife | Surgipro | SPOI-070 | knife x 1 |
| DMEM/F-12, HEPES | Life Technologies | 11330-032 | 500 ml x 4 |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1X w/out Ca or Mg | VWR | 45000-434 | 500 ml x 6 |
| Fetal Bovine Serum, Regular (Heat Inactivated) | VWR | 45000-736 | 500 ml x 1 |
| FGF-Basic (AA 10-155) Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG0021 | 100 µg x 1 |
| IDE-1 | Stemgent | 04-0026 | 2 mg x 1 |
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | 500 ml x 1 |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828-028 | 500 ml x 1 |
| L-Glutamine 200 mM | Life Technologies | 25030-081 | 100 ml x 1 |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X | Life Technologies | 11140-050 | 100 ml x 1 |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | 100 g x 1 |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-148 | 20 ml x 1 |
| Recombinant Human/Murine/Rat Activin A | PeproTech | 120-14E | 10 µg x 2 |
| Synthemax-T Surface 6 Well Plates | Corning | 3877 | Case(12) x 1 |
| TrypLE-Express Enzyme (1X), no phenol red | Life Technologies | 12604-021 | 500 ml x 1 |
| Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.1µm pore, 500ml | Corning | 431475 | Case(12) x 1 |
References
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol Rev. 85 (3), 845-881 (2005).
- Congdon, N. Causes and prevalence of visual impairment among adults in the United States. Arch Ophthalmol. 122 (4), 477-485 (2004).
- Friedman, D. S. Prevalence of age-related macular degeneration in the United States. Arch Ophthalmol. 122 (4), 564-572 (2004).
- Resnikoff, S. Global data on visual impairment in the year. Bull World Health Organ. 82 (11), 844-851 (2002).
- Bird, A. C. Therapeutic targets in age-related macular disease. The Journal of Clinical Investigation. 120 (9), 3033-3041 (2010).
- Jong, P. T. Age-related macular degeneration. N Engl J Med. 355 (14), 1474-1485 (2006).
- Binder, S., Stanzel, B. V., Krebs, I., Glittenberg, C. Progress In Retinal And Eye Research. Transplantation of the RPE in AMD. 26 (5), 516-554 (2007).
- Cruz, L., Chen, F. K., Ahmado, A., Greenwood, J., Coffey, P. RPE transplantation and its role in retinal disease. Progress In Retinal And Eye Research. 26 (6), 598-635 (2007).
- Carr, A. J. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4 (12), e8152 (2009).
- Idelson, M. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional retinal pigment epithelium cells. Cell Stem Cell. 5 (4), 396-408 (2009).
- Klimanskaya, I. Derivation and comparative assessment of retinal pigment epithelium from human embryonic stem cells using transcriptomics. Cloning Stem Cells. 6 (3), 217-245 (2004).
- Krohne, T. Generation of retinal pigment epithelial cells from small molecules and OCT4-reprogrammed human induced pluripotent stem cells. Stem Cells Translational Medicine. 1 (2), 96-109 (2012).
- Lund, R. D. Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats. Cloning Stem Cells. 8, 189-199 (2006).
- Vugler, A. Elucidating the phenomenon of HESC-derived RPE: anatomy of cell genesis, expansion and retinal transplantation. Exp Neurol. 214 (2), 347-361 (2008).
- Algvere, P. V., Berglin, L., Gouras, P., Sheng, Y. Transplantation of fetal retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration with subfoveal neovascularization. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 232 (12 ), 707-716 (1994).
- Binder, S. Outcome of transplantation of autologous retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: a prospective trial. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (11), 4151-4160 (2004).
- Binder, S. Transplantation of autologous retinal pigment epithelium in eyes with foveal neovascularization resulting from age-related macular degeneration: a pilot study. Am J Ophthalmol. 133 (2), 215-225 (2002).
- Falkner-Radler, C. I. Human retinal pigment epithelium (RPE) transplantation: outcome after autologous RPE-choroid sheet and RPE cell-suspension in a randomised clinical study. British Journal of Ophthalmology. 95 (3), 370-375 (2011).
- Li, Y. Long-term safety and efficacy of human-induced pluripotent stem cell (iPS) grafts in a preclinical model of retinitis pigmentosa. Molecular Medicine (Cambridge, Mass). 18, 1312-1319 (2012).
- Lu, B. Long-Term Safety and Function of RPE from Human Embryonic Stem Cells in Preclinical Models of Macular Degeneration). Stem Cells. 27 (9), 2126-2135 (2009).
- Peyman, G. A. A technique for retinal pigment epithelium transplantation for age-related macular degeneration secondary to extensive subfoveal scarring. Ophthalmic Surgery. 22 (2), 102-108 (1991).
- Schwartz, S. D. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. The Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
- Wang, N. K. Transplantation of reprogrammed embryonic stem cells improves visual function in a mouse model for retinitis pigmentosa. Transplantation. 89 (8), 911-919 (2010).
- Cruz, P. M. Mutation of the receptor tyrosine kinase gene Mertk in the retinal dystrophic RCS rat. Human Molecular Genetics. 9 (4), 645-651 (2000).
- Buchholz, D. E. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (10), 2427-2434 (2009).
- Hirami, Y. Generation of retinal cells from mouse and human induced pluripotent stem cells. Neurosci Lett. 458 (3), 126-131 (2009).
- Meyer, J. S. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (39), 16698-16703 (2009).
- Osakada, F. In vitro differentiation of retinal cells from human pluripotent stem cells by small-molecule induction. J Cell Sci. 122 (17), 3169-3179 (2009).
- Carr, A. J. Molecular characterization and functional analysis of phagocytosis by human embryonic stem cell-derived RPE cells using a novel human retinal assay. Mol Vis. 15, 283-295 (2009).
- Kokkinaki, M., Sahibzada, N., Golestaneh, N. Human Induced Pluripotent Stem-Derived Retinal Pigment Epithelium (RPE) Cells Exhibit Ion Transport, Membrane Potential, Polarized Vascular Endothelial Growth Factor Secretion, and Gene Expression Pattern Similar to Native RPE. Stem Cells. 29 (5), 825-835 (2011).
- Westenskow, P., Friedlander, M. Ch. 111. The New Visual Neurosciences. Werne, J. S., Chalupa, L. M. , The MIT Press. Cambridge, MA. 1611-1626 (2013).
- Westenskow, P. D. Using flow cytometry to compare the dynamics of photoreceptor outer segment phagocytosis in iPS-derived RPE cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (10), 6282-6290 (2012).
- Algvere, P. V., Gouras, P., Dafgard Kopp,, E, Long-term outcome of RPE allografts in non-immunosuppressed patients with AMD. Eur J Ophthalmol. 9 (3), 217-230 (1999).
- Zhang, X., Bok, D. Transplantation of retinal pigment epithelial cells and immune response in the subretinal space. Invest Ophthalmol Vis Sci. 39 (6), 1021-1027 (1998).
- Gamm, D. M., Phillips, M. J., Singh, R. Modeling retinal degenerative diseases with human iPS-derived cells: current status and future implications. Expert Review Of Ophthalmology. 8, 213-216 (2013).
- Singh, R. iPS cell modeling of Best disease: insights into the pathophysiology of an inherited macular degeneration. Hum Mol Genet. 22 (3), 593-607 (2013).
- Buchholz, D. E. Rapid and efficient directed differentiation of human pluripotent stem cells into retinal pigmented epithelium. Stem Cells Transl Med. 2 (5), 384-393 (2013).
- Fuhrmann, S., Levine, E. M., Reh, T. A. Extraocular mesenchyme patterns the optic vesicle during early eye development in the embryonic chick. Development (Cambridge, England). 127 (21), 4599-4609 (2000).
- Borowiak, M. Small molecules efficiently direct endodermal differentiation of mouse and human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 4 (4), 348-358 (2009).
- Tucker, B. A., Anfinson, K. R., Mullins, R. F., Stone, E. M., Young, M. J. Use of a synthetic xeno-free culture substrate for induced pluripotent stem cell induction and retinal differentiation. Stem Cells Transl Med. 2 (1), 16-24 (2013).
- Ramsden, C. M. Stem cells in retinal regeneration: past, present and future. Development (Cambridge, England). 140 (12), 2576-2585 (2013).
- Zhao, T., Zhang, Z. -N., Rong, Z., Xu, Y. Immunogenicity of induced pluripotent stem cells. Nature. 474 (7350), 212-215 (2011).
- Zhang, K. Direct conversion of human fibroblasts into retinal pigment epithelium-like cells by defined factors. Protei., & Cell. 5 (1), 48-58 (2013).
