Abstract
Mürin ve insan özofagus miyofibroblastlar enzimatik sindirme ile oluşturulur. Yenidoğan (8-12 günlük) sıçangil yemek borusu, hasat kıyılmış, yıkandı ve 25 dakika boyunca kolajenaz ve dispaz ile enzimatik sindirme tabi tutulur. İnsan özofagus rezeksiyonu örnekleri muskularis propria ve adventisyanın elimden ve kalan mukoza kıyılmış edilir ve en fazla 6 saat kollajenaz ve dispase ile enzimatik sindirim tabi. Kültürlü hücreler α-SMA ve vimentinin ve ekspres desmin zayıf veya hiç ifade eder. Kültür şartları, epitel, hematopoietik, veya endotel hücrelerinin büyümesi için elverişli değildir. Kültür saflığı daha fazla potansiyel tehlike hematopoietik ve endotel hücrelerinin hücre yüzeyi işaretleyicisi ifade akış sitometrik değerlendirilmesi ile doğrulanır. Kullanılan teknik, basit ve non-hematopoetik olmayan endotel stromal hücrelerin sürekli üretimi ile sonuçlanır. Bu tekniğin Sınırlamalar kullanımına doğasında vardıryani moleküler biyoloji çalışmalarında, birincil kültürleri, kaçınılmaz değişkenliği farklı fareler ve insanlarda arasında kurulan kültürler arasında karşılaştı. Birincil kültürler, ancak hücre kuşakları ile karşılaştırıldığında in vivo olarak durumunun daha iyi temsil yansımasıdır. Bu yöntemler ayrıca, araştırmacılar, gruplar arasındaki karşılaştırmalar sağlayan izole yeteneği, farklı klinik ve deneysel koşullardan elde edilen kültür stromal hücreler, sağlar. Özelliği özofagus stromal hücreleri, özofagus hastalıklarda epitelyal, stromal etkileşimlerinin araştırılması fonksiyonel çalışmalarda da kullanılabilir.
Introduction
Epitel-stromal etkileşimleri mukozal rejenerasyon, onarım, fibrozis, ve karsinogenezinde 1,2 olmak üzere gastrointestinal sistem fonksiyonları çeşitli düzenlenmesinde rol oynar. Bu etkileşimler en küçük bağırsak ve kolon incelenmiş ve benzer özofagus mukoza bozuklukları 3 rol oynayabilir. Bağırsak ve kolon stromal hücreler olarak adlandırılan rolü in bir alt popülasyonu, doku yaralanması, iltihaplanma aracı katılmak ve 4,5 onarmak için gösterilmiştir. Distal GI, bu iğ biçimli hücreler epiteli ve lamina propria arasındaki arayüzde bazal membran bitişik bulunan ve α-SMA ve vimentin olarak tanımlanan olumlu,-pan sitokeratin negatif ve zayıf pozitif veya negatif desmin 5.
özofagus stroma sıkı bir hücresel ya da moleküler düzeyde olmamıştır. Kemirgen özofagusta Çalışmalarımız de ettimonstrated α-SMA yassı epitel 6 bazen alttaki özofagus stromada ve vimentin hücreleri. Epitel-stromal etkileşimler gibi gastro-özofageal aracılı yaralanma 6 ve eozinofilik özofajit 3 gibi özofagus mukoza bozuklukları suçlanmıştır. Fibrotik darlıklar gastrointestinal fibrozis patogenezinde suçlanmıştır özofagus yaralanması ve stromal hücrelerin bilinen bir komplikasyonudur. Bu hücrelerin izolasyonu dengesiz sinyal yolları araştırmak için gerekli çalışmaları gerçekleştirmek yardımcı olacaktır.
Bu başvuru, bu etkileşimlerin aracılık sinyal yollar ile ilgili bilgi mevcut boşluklar ele alınabilir şekilde α-SMA pozitif, vimentin pozitif miyofibroblastlar birincil kültürleri kurmak için gerekli teknikleri sağlar. açıklanan teknik başarıyla birincil kemirgen kolon miyofibroblastlar 7 ve furthe kurmak için yazarlar tarafından kullanılmıştırr murin 6 ve insan miyofibroblast gibi özofagus stromal hücrelerin kurulması için uyarlanmış.
Bu yazıda kurmak ve fare veya gelecekteki fonksiyonel çalışmalarda kullanmak için önce insan özofagus kurulan bu kültürleri karakterize için gerekli koşulları açıklar. Kültürler büyütülür ve yukarı 15 geçişleri için kullanılabilir. Aşağıda gösterilen yöntemler aracılığıyla izole edilmesi ve primer kültürlerin kurulması miyofibroblast fenotip ile stromal hücreler oluşturur; , vimentin pozitif ve zayıf pozitif veya negatif desmin ve sitokeratin negatif-SMA α. Bu fenotip, ağırlıklı olarak vimentin pozitif olan özofagus fibroblast fenotipi, negatif α-SMA 3 veya müsküler mukozanın 6 α-SMA pozitif, vimentin negatif fenotipi ayrıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
protokol hayvan deneyleri, gerekçesini ve araştırma hedeflerini gerçekleştirmek için, Güney Kaliforniya Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu Üniversitesi tarafından sunulan ve kabul edildi.
de tanımlanan insan özefajektomi örneklerinden birincil kültürlerin kurulması için protokol Güney Kaliforniya Kurumsal Değerlendirme Kurulu Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Fare ya da İnsan özefagus elde
- Fare özefagus edinin:
- Servikal dislokasyon ardından% 2 izofluran uçucu doz aşımı ile 8-12 gün eski fare Euthanize.
- Aşağı yukarı bakacak şekilde göbek ile hayvan pin ve% 70 etanol ile ventral yüzeyi ıslak. Forseps ile yakala ve forseps ile üretral açılış cilt anterior yukarı kaldırın. Çene üretral açılış ventral orta hat boyunca kesmek için standart düz cerrahi makas kullanın. Sadece cildi kesmek için dikkatli olun. </ Li>
- "Y" aşağı ters oluşturan, hayvanın her iki tarafta diz aşağı açılış üretral bir kesi yapmak. Göğüs kafesi boyunca hayvanın her iki tarafında bir kesi olun.
- Dikkatle yatan periton ve göğüs kafesinin kapalı, her iki tarafta cilt soyma ve yanlara yatıyordu. Göğüs boşluğu ve karın boşluğunu örten periton örten göğüs kafesini inceleyin.
- Karın içeriğine zarar görmesini önlemek için yukarı makas işaret, forseps ile periton kaldırın ve diyafram ve göğüs kafesine içinden yukarı kesti. Yavaşça, karaciğer sol lobunu yukarı kaldırın yatan mide, özofagus-mide kavşak ve yemek borusu karın kısmını açığa.
- Servikal kuşak kadar orta hat boyunca sternum ve göğüs kafesi üzerinden kesmek için otoklava cerrahi makas kullanın. Nokta makas yukarı göğüs içeriğine zarar görmesini önlemek için. Tam içeriğini açığayanlara göğüs kafesi çekerek göğüs boşluğu.
- Yavaşça kalp ve akciğerlerin her iki lobu kaldırmak. Q-ipuçları aşırı kan emer. Torasik özofagus torakal vertebra trakea ve anterior dar, esnek tüp yalan posterior.
NOT: Özofagus kemirgen yenidoğanlarda tespit etmek zor olabilir. Özofagus-mide birleşme lokalizasyonu özofagus kimlik basit hale getirir. - Dikkatle çevreleyen damar, yağ diseksiyon, mideden yemek borusu takip ve servikal boşluğunda özofagus kökenli kadar tüm yol mezenterinde. Künt uçlu Cerrahi makaslar, bu amaç için en iyi çalışır.
- Aşağıda tarif edilen ileri işlemler için Hanks dengeli tuz çözeltisi (HBSS) içinde yemek borusu ve yeri tüm uzunluğu rezeke. İsterseniz yönlendirme amaçlı midenin bir kısmını çıkarın.
NOT: Küçük doku boyutu nedeniyle, kas gelen muskularis propria ayrılmasımukoza kemirgen yenidoğan yemek borusundaki ulaşılabilir değildir ve tüm özofagus aşağıda açıklanan işlenirken tabi olmasıdır.
- İnsan özefagus edinin:
- HBSS ile özofagus rezeksiyonu örnekleri (genellikle 5 cm veya daha az) yıkayın ve herhangi bir bağlı bağ dokusu, yağ, ya da damarsal çıkarın.
- Numunenin bir kısmını rezeke ve istenirse ileride histolojik inceleme için formalin yerleştirin.
- Keskin diseksiyon ile altta yatan muskularis propria kalan mukoza ayırın.
- Aşağıda açıklanan protokole alt santimetre parçalara mukoza ve konuyu kesin.
Not: İnsan özofagus rezeksiyon aşağıda tarif edilen işlemden önce en fazla 6 saat süre ile, PBS içinde saklanabilir. Özefajektomi örneklerinin kaynağı örnek boyutunu belirleyecektir ve laboratuvar bağımlı olacaktır.
2. İzolat Kemirgen ve İnsan Özofagus Stromal Hücreleri
- F özofagus stromal hücreleri izolemekanik ve enzimatik sindirme bir kombinasyonu ile ROM kemirgen ve insan dokusudur.
- Mekanik HBSS ile makas ve çoklu yıkama ile doku kıyma ile sindirmek. Enzimatik mi, 300 U / kolajenaz XI ve 0.1 mg / 25 dakika (sıçan dokusu) için mi dispaz ile veya en fazla 6 saat (insan dokusu) için doku inkübe edilerek özet. Kıyma haline gelme kullanılan aletler otoklava ve sterilize edilmiş olduğundan emin olun.
NOT: Kolajenaz kollajen, birlikte hayvan dokusunu tutan sorumlu bir hücre dışı matriks proteini parçalayan enzimler vardır. Kollajenaz XI yüksek kollajenaz aktivitesine sahiptir ve bu izolasyon protokolü başarı gördü. Dispase hücre membran etkinliğini koruyan ve bir ikinci enzim olarak kolajenaz ile bir arada kullanılan, hafif proteolitik ayrışma etkinliği olan bakteriyel bir enzimdir. - HBSS içeren, sırasıyla, 1.7 ml mikro-santrifüj ya da 5 ml tüpler içinde, fare veya insan dokusundan elde edilen mukoza fragmanları, yerleştirin. Kıyma yumuşak kağıt olup,İlgili tüpler içine uyacak bir açık uç genişliği ile makas kullanarak 2-3 mm'lik parçalar halinde. Özofagus mukoza parçaları tüpün dibine çöktürmek için yeterli zaman izin ver.
- Yavaş yavaş yanlışlıkla doku atmak için dikkatli olmak, HBSS süzün. Taze HBSS nazik sallayarak aşağıdaki ile değiştirin. Seçenek olarak ise, 1 ml pipet ile HBSS çıkarın.
- Yumuşak özofagus fragmanları, her bir yıkama arasında çöktürmek için süre bıraktıktan yıkamalar arasında çalkalanarak bu şekilde 8 kez olmak üzere toplam doku yıkayın.
NOT: İnsan dokusu bu yeni doğan fare doku kıyma daha gerektirecektir.
- Mekanik HBSS ile makas ve çoklu yıkama ile doku kıyma ile sindirmek. Enzimatik mi, 300 U / kolajenaz XI ve 0.1 mg / 25 dakika (sıçan dokusu) için mi dispaz ile veya en fazla 6 saat (insan dokusu) için doku inkübe edilerek özet. Kıyma haline gelme kullanılan aletler otoklava ve sterilize edilmiş olduğundan emin olun.
- Mi, 300 U / kolajenaz XI ve oda sıcaklığında yavaş bir hıza ayarlanmış bir sallanan karıştırma cihazı üzerinde, 25 dakika boyunca 0.1 mg / ml dispaz sahip fare doku inkübe edin.
- Oda sıcaklığında yavaş bir hızda ayarlanan bir sallanan bir karıştırıcı üzerinde, en fazla 6 saat süre ile, 300 U / ml kolajenaz XI ve 0.1 mg / mL dispase insan dokusu inkübe edin.
NOT: İnsan özofajit kullanılabilirliğiGus değişkendir. İnsan özofagus mukoza primer kültürlerinde başarılı nesil kadar 6 saat sonuçlar için enzimler ile inkübe.
- Oda sıcaklığında yavaş bir hızda ayarlanan bir sallanan bir karıştırıcı üzerinde, en fazla 6 saat süre ile, 300 U / ml kolajenaz XI ve 0.1 mg / mL dispase insan dokusu inkübe edin.
- Enzimatik sindirimden sonra 10 dakika süreyle 200 x g'de makas ve santrifüj ile daha da kıyma dokusudur.
- Süpernatantı atın. Cansız hücreler ile döküntüleri gidermek için% 2 sorbitol ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) içinde 5 kez 5 ml'lik bir tüpe, bir karma hücre süspansiyonu oluşan pelet aktarın ve yıkayın.
- % 10 cenin sığır serumu ile DMEM içinde 6 oyuklu plakalar ve kültür (FBS), 10 mg / ml insülin, 10 ug tohum hücre / ml transferin, 10 ug / ml gentamisin ve 2 ng / ml, epidermal büyüme faktörü (EGF) . Vakum filtre (0.22 um) süzülerek sonra ilave edilebilir EGF hariç tüm bileşenler. Rezeksiyon boyutuna bağlı olarak, birden çok 6-yuvalı plakalar içinde insan reseksiyon örneklerinden elde edilen hücreler dağıtın.
- Kuyular% 80 konfluent sonra, T25 için geçiş yapışan hücreler bize şişeleriing% 0.05 tripsin / etilendiamintetraasetik asit (EDTA). 400 x g'de medya ve spin ile nötralize edin.
- Bir T25 şişesi bir 6 yuvalı geçişi için, bir 1 pasaj hücreleri: 1 oranında. 2 ya da 1: 3 oranında konfluent T25 şişesi 1 ile geçişli olabilir. 1 oranı: T75 şişeye bir T25 şişesi geçit, 1 kullanın. 2-3 günde olursa olsun geminin Değişim medya.
- Yukarıda tarif edilen miyofibroblast ortam içinde, nemlendirilmiş bir% 5 CO2 inkübatöründe ve kültür 37 ° C'de hücreler büyür.
NOT: Epitel hücreleri, bu kültür veya geçit koşullarında hayatta yoktur. Karakterizasyonu için ve aşağıda tarif edilen çalışmalarda kullanılan hücreler geçitlerin 5 ile 15 arasında bulunmaktadır. - Miyofibroblast ortam,% 10 dimetil sülfoksid ekleyerek sıvı N 2 hücreleri Kriyo-koruma.
3. karakterize Kemirgen ve İnsan Özofagus Stromal Hücreleri
- Bir ters mikroskop ile, hücrelerin morfolojisi inceleyin. Mili-şekilli gözlemlemekYapışık hücrelerin morfolojisi (Şekil 1).
- Α-SMA, vimentin, desmin ve sitokeratin: Aşağıdaki hücre iskeleti belirteçlerin değerlendirilmesi ile kültür hücreleri karakterize etmektedir. Bir miyofibroblast gibi fenotip ile stromal hücreler α-SMA ve vimentin (Şekil 2) sitosköletal miyofibroblast belirteçler.
- Daha fazla desmin için immunostain kas hücreleri, kültürlü stromal hücreler ayırt etmek. Kültürlenmiş hücreler imüno gerçekleştirmek için, 4-çukurlu oda slaytlar 1.5 x 10 4 hücrelerini plaka ve 24 saat süre ile miyofibroblast ortamında büyür. Bir miyofibroblast gibi fenotip ile stromal hücreler zayıf ya da hiç desmin ifadeye sahip olacak. Stromal hücreler epitel işaretleyici pan-sitokeratin ifadesini eksikliği (veriler gösterilmemiştir).
NOT: kültürlerin Değerlendirme akış sitometri immünsitokimya ve hücre yüzey belirteçleri ile hücre iskeleti belirteçlerin değerlendirilmesini içerir. İmmünositokimya ex olarak karakterizasyonu birincil yöntem olarak kullanılmaktadırhücre iskeleti proteinleri sıkıştırma profili fibroblast, miyofibroblastm veya kas hücre için benzersizdir. Akış sitometrisi, epitel, endotelyal ve hematopoietik hücreler belirteçlerin hücre yüzeyi ekspresyonunu değerlendirmek kültür saflığı kurar. CD90 insan fibroblast ve miyofibroblastlar hem de ifade insan stromal hücreler belirleme yardımcı bir yöntem olarak yararlıdır. Aynı zamanda fare T hücreleri tarafından ifade edilen CD90 kemirgen stromal hücrelerin karakterizasyonu yararlı değildir.
- Daha fazla desmin için immunostain kas hücreleri, kültürlü stromal hücreler ayırt etmek. Kültürlenmiş hücreler imüno gerçekleştirmek için, 4-çukurlu oda slaytlar 1.5 x 10 4 hücrelerini plaka ve 24 saat süre ile miyofibroblast ortamında büyür. Bir miyofibroblast gibi fenotip ile stromal hücreler zayıf ya da hiç desmin ifadeye sahip olacak. Stromal hücreler epitel işaretleyici pan-sitokeratin ifadesini eksikliği (veriler gösterilmemiştir).
- Hücreler% 60 kaynaşmaya eriştikten sonra, fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile slaytlar yıkayın ve metanol ile sabitleyin. -20 ° C'de 10 dakika boyunca metanol içinde hücreleri inkübe edilmiş, sonra kullanılana kadar 4 ° C de PBS içinde depolar.
- Standart immünoboyama protokolünü izleyin.
- Kısaca, birincil antikor tatbik edilmesinden önce, PBS içinde% 5 goatserum ile sabitleştirilmiş hücreler bloke eder. Yanı% 5 keçi serumu içinde birincil ve ikincil antikorlar ile seyreltilir.
- Α-SMA ve vimentin tespiti için kullanımıAşağıdaki antikorlar ve konsantrasyonları: Fare mAK α-SMA 1 de: 500 seyreltme: 1 de vimentin 250 seyreltme ve Tavşan PAB.
- Gece boyunca 4 ° C'de oda sıcaklığında primer antikor ile inkübe 3 defa PBS ile yıkayın ve 1 arasında bir seyreltme Rodamin konjuge keçi anti-fare sekonder antikor ekleyin: 1 saat süre ile 1000: 1 arasında bir seyreltme 200 ve Cy2'nin konjuge keçi anti-tavşan oda sıcaklığında karıştırılmıştır.
- Counterstain çekirdekler 4 ile ', 1 dakika boyunca 1 ug / ml'lik bir konsantrasyonda, 6-diamidino-2Phenylindole (DAPI) ve daha sonra, PBS ile yıkayın. Bir ters mikroskop ile slaytlar analiz.
- Hematopoietik için, sıçan ve insan yemek borusu hücre elde edilmesi (CD45) ve akış sitometrisi ile endotelyal (CD31) hücre yüzey markörlerinin (Şekil 3) kültürler saflığını oluşturulması. Stromal hücre yüzey işaretleyici CD90 ekspresyonu ile ayrıca insan hücreleri karakterize eder.
Not: CD90 fare T cel murin stromal hücreleri tanımlamak için kullanılamazls da CD90 ifade eder.- , Iki kez FACS tamponu ile yıkandı, sayıldı ve ilgili izotop kontrol FITC-CD45 ve APC-CD31 ile lekelenmiştir, 10 dakika için 37 ° C 'de enzimatik olmayan ayrıştırma çözeltisi ile muamele etmek suretiyle, kültür şişelerinden kültürlenmiş fare özofagus stromal hücreleri ayırmak göre Standart boyama işlemlerine.
- FACS Calibur kullanarak hücreleri toplamak ve FlowJo yazılımı ile verileri analiz. Lekeleme yapan hücrelerin önce, antikorları en iyi duruma getirmek ve izotip kontrolleri, normal fare dalak ve kemik iliği hücreleri kullanılarak konsantrasyonlarda titre edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mekanik ve enzimatik sindirim kullanılarak izole özofagus stromal hücreler ilk olarak kaplama ve 6 yuvalı plakalar içinde kültürlendi. Kaplama birkaç saat içinde, bir inverted mikroskop ile hücrelerin incelenmesi plaka tabanı (Şekil 1A) gevşek bir biçimde, bir karma hücre süspansiyonu gösterir. Bir sonraki 24 saat içinde, plaka alt kısmında sıkıca yapışık iğ şeklinde hücreler karma hücre süspansiyonu çimlenme hücreler, 5 gün içinde tüm alanını kaplar ve şekil tutma başarılı geçişli olabilir .Bu (Şekil 1B) çekim gözlenir En az 15 pasajlar için. Mil şeklindeki yapışan hücreler, düşük yoğunluklu (Şekil 1C) ve ne zaman yakın konfluent (Şekil 1D) gözlenir.
Oda slaytlar yetiştirilen özofagus stromal hücrelerin primer kültürlerin immün (Şekil α-SMA ve vimentin miyofibroblast hücre iskeleti belirteçlerinin bol ifadesini gösterirure 2), desmin zayıf ifadesi ve devamsızlık sitokeratin.
Özofagus miyofibroblastlar birincil kültürleri ayrıca, hematopoietik ve endotel hücre yüzeyi markerlerinin incelenmesi ile hücre saflık için incelenebilir. İleri ve yan yayılım girişi ve hücre yüzeyi proteinleri, canlı hücreleri (Şekil 3A) analizi ve ardından birinci murin özofagus stromal hücreler için kurulmuştur. Birincil sıçangil özofagus stromal hücreler hematopoietik CD45 (Şekil 3B) ve endotel hücre CD31 (Şekil 3C), hücre yüzey markörlerinin ifadesi eksiktir.
Şekil 1:. Izolasyon ve kaplama saat içinde, bir inverted mikroskop ile sıçangil stromal hücrelerin farklı pasajlara sıçangil özofagus stromal hücrelerin birincil kültürleri incelenmesi karışık ce bir küme gösterirplaka alt (A) gevşek bir biçimde bulunan hücreler rf. Kültürde 24-48 saat sonra, iğ biçimli hücreler artık yapışık küme (B) filiz. Yapışık hücrelerin iğ şeklinde morfoloji düşük (C) ve yüksek (D) yoğunlukta devam. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayınız. (Shaker vd. 6 izni ile kullanılabilir Şekiller).
Şekil 2: Birincil kültüründe yetişen Mürin özofagus stromal hücreler α-SMA ve vimentin miyofibroblast belirteçler İlköğretim kemirgen özofagus stromal hücreler orta (AC) ile oda slaytlar üzerinde yetiştirilen ve α-SMA ve vimentin immunohistokimyasal ve düşük yoğunluklu (DF).. Esophageal stromal hücreler bol α-SMA (A, D) ve vimentinin (B, E) ifade eder. Mürin özofagus stromal hücreler bu miyofibroblast belirteçleri (C, F) eş-ifade. (Shaker vd. 6 izni ile kullanılabilir rakamlar). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: murin özofagus miyofibroblastlar hücrelerinin primer kültürleri, hematopoetik ve endotel hücre yüzeyi markerleri eksikliği murin özofagus stromal hücrelerin noktalı diyagram, FSC ve hücrelerin bu popülasyonda SSC özelliklerini göstermektedir.. Olayların% 32.4 toplam, hematopoietik sentezlenmesi (CD45) ve endotelial (CD31) hücre yüzeyi işaretçileri tek i tarafından değerlendirilmiştir (A) 'geçitlendiStandart boyama protokollerine göre mmunostain. Spesifik olmayan boyama izotip kontrolleri kullanarak her bir antikor için belirlendi. Murin özofagus stromal hücrelerin birincil kültürleri CD45 (B) ya da CD31 (C) ifade yoktur. FSC: ileri dağılım; SSC: Yan dağılım. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
doku boyutu için uyarlanmış kıyma ve sindirim kez sıçangil ya da insan doku kullanıldığında, birincil kültür oluşturulması için teknikler genellikle benzerdir. Sıçangil doku ile olan deneyim, yukarıda tarif edilen metotlar kullanılarak sürekli olarak primer kültürlerinde başarılı bir şekilde kurulmasının neden olduğunu göstermektedir. Protokol kapsamında Kritik adımlar cerrahi ekipman sterilizasyon ve doku kültürü standart steril teknikler şunlardır. farelerin yaş da önemli bir adımdır. 8-12 gün eski yenidoğanlarda sürekli başarılı primer kültürleri verim. Küçük yenidoğanlarda izole stromal hücreleri başarıyla elde edilmemiştir edilmemiştir. Eski farelerin miyofibroblast gibi stromal hücreler kurmak için girişimleri devam etmektedir. Diğerleri dört ila sekiz haftalık fareler 8 özefagus fibroblast başarılı nesil bildirdi.
Kolon miyofibroblastlar kurulması aksine, kirlilik e nadir bir konudursıçangil miyofibroblastların kültürlerinin stablishment antibiyotikler kültür ortamında dahil edildiğinde. Kültürler yenidoğan farelerden kurulan Çünkü, bir sınırlayıcı faktör küçük bir doku boyutu ve muskularis propria ve sıyırma kolaylıkla mümkün değildir olmasıdır. Öte yandan, insan özofagusta, muskularis propria kolayca ayırt ve muskularis mukoza ayrılır olduğunu. enzimatik sindirim ve kültür koşulları, fare veya insan yemek borusu üzerinden de kurulabilir kültürlerde immün ya da epitelyal hücrelerin büyümesi için elverişli değildir. İnsan rezeksiyon örnekleri belki de doku geçiren işleme büyük ölçmek ve kültür ortamında kullanım antibiyotiklere rağmen bakteriyel kontaminasyon savunmasız kalır. Standart doku kültürü teknikleri ardından ve titizlikle cerrahi aletleri sterilize kontaminasyon riskini azaltır.
Primer kültür avantajı bu hücrelerin nispeten unmanipulated ve daha th yansıtabilir olduğunuölümsüz hücre çizgileri 9 ile karşılaştırıldığında, e, in vivo bir ortam.
açıklanan teknik düz ileri ve en laboratuvarlar vasıtasıyla içindedir. hücre hatları karşı primer kültürlerinde dezavantajı 15 geçişinin dışında hücreler genetik mutasyona ve nihai yaşlanması duyarlı olmasıdır. Buna ek olarak, fare ya da insanlardan elde edilen birincil kültürleri doğal değişkenlik hücre çizgilerinde de gözlendi değil. Özofagus, fibroblast izolasyonu için alternatif yöntemler 10 tarif edilmiştir. Kültürde bu hücrelerin karakterizasyonu ancak vimentin ifade sınırlı edilmiş veya vimentin ifade ve zayıf α-SMA 10 pozitif sadece hücreleri göstermiştir.
Bu teknik, hakim sonra, birincil kültürleri, hastalıklı insan yemek borusu reseksiyon örneklerinden tespit edilebilir. Bu yöntemler, araştırmacılar, farklı klinik a izole etmek yeteneği ve Kültür stromal hücreler sağlamaknd deneysel koşullar, gruplar arasında karşılaştırmalar izin. Kültür miyofibroblast benzeri stromal hücreler aynı zamanda potansiyel olarak bu eozinofillerin 3 veya organotipik kültürü 8 Diğer hücrelerle Organotipik ya da ko-kültür modellerinde kullanılmak üzere adapte edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Bu çalışma Gut Fizyoloji ve Sağlık (AS) ve Wright Vakfı Pilot Ödülü (AS) NIH / NCI K08CA153036-01A1 (AS), Sağlık AGA-General Mills Bell Enstitüsü ve Beslenme Araştırmacı Ödülü tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue culture reagents | |||
| HBSS | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Dispase | GIBCO, Invitrogen | 17105-041 | |
| Collagenase XI | Sigma-Aldrich | C9407 | |
| DMEM | GIBCO, Invitrogen | 11965-092 | |
| Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F42442 | |
| Transferrin | Roche | 10-652-202-001 | |
| trypsin/EDTA | Corning | 25-052-Cl | |
| Epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Reagents for immunostaining | |||
| Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Mouse mAB to α-SMA | abcam | ab7817 | |
| Rabbit pAB to vimentin | abcam | ab45939 | |
| Cy2 conjugated Goat anti Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 111-225-144 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | |
| CD31 conjugated to eFluor 450 | eBioscience | 48-0319-41 | |
| CD90 conjugated to APC | eBioscience | 17-0909-41 | |
| Annexin V and 7AAD | BD Pharmigen | 559763 | |
| Mouse Fc block for CD16/CD32 | BD Pharmigen | 2136662 | |
| Equipment | |||
| 5 ml tube | Eppendorf | 30108310 | |
| Inverted microscope | Motic | AE31 | |
| Biosafety cabinet and incubators | Nuaire | http://www.nuaire.com/products/ | |
| 4-well chamber slides | Thermo Scientific | 177437 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Olympus Vacuum-Driven Filter System | Genesee Scientific | 25-227 | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse TE300 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| T25 Flasks | TRP | 90026 | |
| T75 Flasks | Corning | 43064 | |
| Dissection scissors | |||
| Dissection forceps | |||
| Single tipped Q-Tips | Kendall | 540500 | |
| Software | |||
| Metamorph software (Molecular Devices) | Molecular Devices | ||
| FACSCAlibur | BD Bioscience | ||
| FACSVerse | BD Bioscience | ||
References
- Stappenbeck, T. S., Miyoshi, H. The role of stromal stem cells in tissue regeneration and wound repair. Science. 324 (5935), 1666-1669 (2009).
- Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. Mesenchymal cells of the intestinal lamina propria. Annu Rev Physiol. 73, 213-237 (2011).
- Rieder, F., et al. T-Helper 2 Cytokines, Transforming Growth Factor beta1, and Eosinophil Products Induce Fibrogenesis and Alter Muscle Motility in Patients With Eosinophilic Esophagitis. Gastroenterology. 146 (5), 1266-1277 (2014).
- Powell, D. W., et al. Paracrine cells important in health and disease. The American Journal of Physiology. 277 (1 Pt. 1), C1-9 (1999).
- Powell, D. W., et al. Intestinal subepithelial myofibroblasts. The American Journal of Physiology. 277 (2 Pt. 1), C183-201 (1999).
- Shaker, A., et al. Stromal cells participate in the murine esophageal mucosal injury response. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (7), 662-672 (2013).
- Shaker, A., et al. Epimorphin deletion protects mice from inflammation-induced colon carcinogenesis and alters stem cell niche myofibroblast secretion. The Journal of Clinical Investigation. 120 (6), 2081-2093 (2010).
- Kalabis, J., et al. Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture. Nature Protocols. 7 (2), 235-246 (2012).
- Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).
- Rieder, F., et al. Gastroesophageal reflux disease-associated esophagitis induces endogenous cytokine production leading to motor abnormalities. Gastroenterology. 132 (1), 154-165 (2007).
