בידוד של myofibroblasts מעכבר והוושט אדם

Abstract

myofibroblasts העכברי והוושט אנושי נוצרים באמצעות עיכול אנזימטי. ילוד הוושט עכברי (ישן 8-12 יום) שנקטפו, טחון, שטף, ונתונים לעיכול אנזימטי עם collagenase וdispase במשך 25 דקות. דגימות כריתת הוושט אדם ניטלו ממנו propria muscularis וadventitia והרירית הנותרת טחונות, ונתונים לעיכול אנזימטי עם collagenase וdispase עד 6 שעות. תאים בתרבית להביע α-SMA וvimentin וdesmin המפורש חלש או בכלל לא. תנאי תרבות הם לא תורמים לצמיחה של אפיתל, דם, או תאי האנדותל. טוהר תרבות הוא אישר עוד יותר על ידי הערכת cytometric זרימה של ביטוי סמן תא שטח של hematopoietic המזהם הפוטנציאלי ותאי האנדותל. הטכניקה המתוארת היא פשוטה ותוצאות בדור של אי-hematopoieitc, תאי סטרומה שאינם עולה בקנה אחד אנדותל. מגבלות של שיטה זו הן אינהרנטי לשימוש בתרבויות עיקריות בלימודי ביולוגיה מולקולריים, כלומר, השתנות בלתי נמנעות נתקלו בין תרבויות הוקמו על פני עכברים או בני אדם שונים. תרבויות עיקריות עם זאת הן השתקפות נציג יותר של מדינת in vivo בהשוואה לשורות תאים. שיטות אלה מספקים גם חוקרים היכולת לבודד ותאי סטרומה התרבות ממצבים קליניים וניסויים שונים, המאפשר השוואה בין קבוצות. גם תאי סטרומה הוושט מאופיינים ניתן להשתמש במחקרים תפקודיים חוקרים אינטראקציות אפיתל-סטרומה בהפרעות בושט.

Introduction

אינטראקציות אפיתל-סטרומה מעורבות ברגולציה של מגוון רחב של פונקציות במערכת עיכול כוללים התחדשות רירית, תיקון, סיסטיק, והיווצרות סרטן ^1,2. אינטראקציות אלה נחקרו הטובים ביותר במעי הדק ובמעי הגס ועלולות דומה משחקות תפקיד בהפרעות ברירית הוושט ^3. תת-אוכלוסייה של myofibroblasts תאי סטרומה מעי הגס וכינה הודגמה להשתתף בתיווך פגיעה ברקמות, דלקת ולתקן ^4,5. במערכת עיכול דיסטלי, תאי ציר בצורה הבאות נמצאים בסמוך לקרום במרתף בממשק שבין propria האפיתל וlamina ומוגדרים כα-SMA וvimentin חיובי, פאן-cytokeratin השלילי, וחולשה חיובית או שלילי desmin ^5.

סטרומה הוושט לא התאפיינה בקפדנות ברמה תאית או מולקולרית. העבודה שלנו בוושט העכברי עוברת דהα-SMA monstrated תאים וvimentin בסטרומה הוושט, לעתים subjacent לאפיתל קשקש ^6. אינטראקציות אפיתל-סטרומה היו מעורבות בהפרעות ברירית הוושט כגון פגיעת גסטרו-הוושט תיווך ⁶ ושט אאוזינופילית ^3. הגבלות fibrotic גם סיבוך ידוע של תאי פציעה וסטרומה הוושט היה מעורבת בפתוגנזה של סיסטיק עיכול. בידוד של תאים אלה יסייע להשיג את המחקרים הדרושים כדי לחקור מסלולי איתות מופרעים.

הגשה זו מספקת את הטכניקות הדרושות כדי להקים תרבויות עיקריות של myofibroblasts α-SMA החיובי, vimentin החיובי כך פערים קיימים בידע לגבי מסלולי איתות תיווך אינטראקציות אלה ניתן לטפל. הטכניקה המתוארת שמשה בהצלחה על ידי מהחברים להקים myofibroblasts העיקרי עכברי המעי הגס ⁷ וfurther מותאם להקמת עכברית ⁶ ותאי סטרומה אדם כמו myofibroblast-הוושט.

במסמך זה אנו מתארים תנאים הנדרשים כדי להקים ולאפיין תרבויות אלה הוקמו מעכבר או וושט אדם לפני השימוש במחקרים תפקודיים עתיד. ניתן לגדל תרבויות ומנוצלות עד ליום 15 במעברים. בידוד והקמת התרבויות העיקריות באמצעות השיטות מפורטות להלן מייצר תאי סטרומה עם פנוטיפ myofibroblast; α-SMA, vimentin חיובי, וחולשה חיובי או שלילי לdesmin, וcytokeratin שלילי. פנוטיפ זו שונה מהפנוטיפ של פיברובלסטים הוושט שהיא בעיקר vimentin חיובי, α-SMA השלילי ³ או הפנוטיפ השלילי החיובי, vimentin α-SMA של muscularis mucosae ^6.

Protocol

הפרוטוקול לביצוע ניסויים בבעלי חיים, את הרציונל ומטרות של המחקר, הוגשו ואושר על ידי אוניברסיטת קליפורניה המוסדית הטיפול בבעלי חיים בדרום וועדת שימוש.

הפרוטוקול להקמת תרבויות עיקריות מדגימות esophagectomy אדם דה-מזוהים אושר על ידי האוניברסיטה של ​​דרום קליפורניה Institutional Review Board.

1. השג עכבר או וושט אדם

1. להשיג עכבר וושט:
   1. להרדים את העכבר ישן 8-12 יום עם 2% ממנת יתר נשימתית isoflurane ואחריו נקע בצוואר הרחם.
   2. הצמד את החיה למטה עם בטן כלפי מעלה ולהרטיב את פני השטח הגחון עם אתנול 70%. עם מלקחיים, לתפוס ולהרים את העור הקדמי לפתיחת השופכה עם מלקחיים. השתמש במספריים כירורגית ישר סטנדרטיים לחתוך לאורך קו האמצע הגחון מפתיחת השופכה לסנטר. היזהר לחתוך רק את העור. </ Li>
   3. עושה חתך משופכת פתיחה כלפי מטה עד הברך בשני הצדדים של החיה, ויצר במהופך "Y". לעשות חתך נוסף בשני הצדדים של החיה לאורך כלוב הצלעות.
   4. לקלף בזהירות את העור בשני הצדדים, את של הצפק הבסיס והצלעות, ולהניח לצדדים. לבחון את כלוב הצלעות מעל חלל בית החזה ואת הצפק שמעל חלל הבטן.
      1. הרם את הצפק עם מלקחיים ולחתוך אותו לכלוב צלעות והסרעפת, מצביע כלפי מעלה מספריים כדי למנוע נזק לתכולת בטן. בעדינות להרים את האונה השמאלית של הכבד, לחשוף את הבטן הבסיסית, צומת הוושט-קיבה וחלק הבטן של הוושט.
   5. השתמש במספריים כירורגית autoclaved לחתוך את עצם החזה וצלעות לאורך קו האמצע עד חגורת צוואר הרחם. מספריים נקודה כלפי מעלה כדי למנוע נזק לתכולת בית החזה. באופן מלא לחשוף את התוכןחלל בית חזה על ידי משיכת כלוב הצלעות לצדדים.
   6. הוצא בעדינות את הלב ושני האונות של הריאות. ספוג בדם עודף עם Q-טיפים. הוושט החזי אחורי צר, גמיש צינור משקר לקנה הנשימה והקדמי לחולית בית החזה.
      הערה: הוושט יכול להיות קשה לזהות בילודים עכבריים. לוקליזציה של צומת הוושט-קיבה גורמת זיהוי הוושט פשוט.
   7. בצע בזהירות את הוושט מהקיבה, לנתח כלי דם, השומן מסביב ולפדר עד מוצא הוושט בחלל צוואר הרחם כל הדרך. מספריים כירורגיות עם קצה קהה עבודה הטובה ביותר למטרה זו.
   8. לכרות כל אורכו של הוושט והמקום בפתרון 'הנקס המאוזן מלח (HBSS) לעיבוד נוסף שיפורט להלן. הסר חלק מהקיבה למטרות נטייה אם תרצה בכך.
      הערה: בשל גודל רקמה קטן, הפרדת propria muscularis מהשריריםהוא הרירית אינה ברת השגה בושט ילוד עכברי וכל הוושט הוא נתון לעיבוד מתואר להלן.
2. להשיג וושט אדם:
   1. לשטוף דגימות כריתת הוושט (בדרך כלל 5 סנטימטר או פחות) עם HBSS ולהסיר את כל רקמה, שומן, כלי דם או חיבור מצורפים.
   2. לכרות חלק של הדגימה ומניח בפורמלין לבדיקה היסטולוגית עתיד אם תרצה בכך.
   3. הפרד את הרירית שנותרה מpropria muscularis הבסיסי על ידי נתיחה חדה.
   4. חותך רירית לרסיסי סנטימטר משנה ובכפוף לפרוטוקול המתואר להלן.
      הערה: כריתות וושט אדם יכולה להיות מאוחסנת בPBS עד 6 שעות לפני העיבוד המתואר להלן. המקור של דגימות esophagectomy יכתיב גודל דגימה ויהיה תלוי במעבדה.

2. תאים בודד Murine ואדם הוושט סטרומה

1. בודד תאי סטרומה הוושט fעכברי rom ורקמה אנושית על ידי שילוב של מערכת עיכול מכאנית והאנזימטית.
   1. באופן מכאני על ידי לעכל קוצץ את הרקמה עם מספריים ושטיפות מרובות עם HBSS. אנזימי עיכול על ידי דוגרים הרקמה עם 300 U / ml XI collagenase ו 0.1 מ"ג / מיליליטר dispase במשך 25 דקות (רקמה עכברית) או לתקופה של עד 6 שעות (רקמה אנושית). ודא שמכשירים המשמשים למתייפייף כבר autoclaved ומעוקר.
      הערה: Collagenases הם אנזימים המפרקים את הקולגן, חלבון מטריצה ​​תאי אחראי על החזקת רקמות בעלי חיים יחד. יש Collagenase XI פעילות collagenase גבוה וזכה להצלחה בפרוטוקול בידוד זה. Dispase היא אנזים חיידקים עם פעילות ניתוק proteolytic קלה ששומר פעילות קרום תא, והוא משמש בשילוב עם collagenase כאנזים המשני.
   2. הנח שברי רירית המתקבלים מעכבר או רקמה אנושית ב1.7 מיליליטר מיקרו צנטריפוגות או 5 צינורות מיליליטר בהתאמה, המכילים HBSS. רקמת בשר טחון נוסףל2-3 חתיכות מ"מ באמצעות מספריים עם רוחב קצה פתוח שיתאים לתוך צינורות המתאימים. לאפשר מספיק זמן כדי לאפשר לברים ברירית הוושט למשקעים התחתון של הצינור.
   3. לאט למזוג HBSS, נזהר שלא לבטל את הרקמה בטעות. החלף עם HBSS הטרי הבא על ידי טלטול עדין. לחלופין, להסיר את HBSS עם טפטפת מיליליטר 1.
   4. לשטוף רקמות באופן זה בסך הכל 8 פעמים עם רעד עדין בין שוטף מאפשר זמן לברי הוושט למשקעים בין כל שטיפה.
      הערה: רקמה אנושית תדרוש יותר מיותרת שרקמת עכבר ילוד.
2. דגירה רקמה עכברית עם 300 XI collagenase ו 0.1 מ"ג / מיליליטר dispase במשך 25 דקות על שייקר נדנדה להגדיר במהירות איטית בטמפרטורת חדר U / ml.
   1. דגירה רקמה אנושית עם 300 collagenase U / ml XI ו 0.1 מ"ג / מיליליטר dispase עד 6 שעות, על שייקר נדנדה להגדיר במהירות איטית בטמפרטורת חדר.
      הערה: זמינות של esopha אדםגאס הוא משתנה. רירית הוושט אדם הודגרו עם אנזימים לתקופה של עד 6 שעות בתוצאות דור מוצלח של תרבויות עיקריות.
3. לאחר עיכול אנזימטי, רקמת בשר טחון נוסף עם מספריים וצנטריפוגות ב XG 200 עבור 10 דקות.
4. בטל supernatant. העבר את הכדור, בהיקף של השעיה תא מעורבת לצינור 5 מ"ל ולשטוף 5 פעמים בנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM) בתוספת 2% סורביטול לחסל תאים ופסולת nonviable.
5. תאי זרע ב6-גם צלחות ותרבות בDMEM עם סרום 10% שור עוברי (FBS), 10 מ"ג / מיליליטר אינסולין, 10 מיקרוגרם / מיליליטר transferrin, 10 מיקרוגרם / מיליליטר גנטמיצין, ו -2 ng / ml גורם הגדילה באפידרמיס (EGF) . מסנן אבק (0.22 מיקרומטר) את כל המרכיבים מלבד EGF אשר ניתן להוסיף לאחר סינון. להפיץ תאים המתקבלים מדגימות כריתה אנושיות בין 6 צלחות היטב מרובות, תלוי בגודל הכריתה.
6. ברגע בארות הן 80% ומחוברות, תאים חסיד מעבר לT25 צנצנותינו0.05% טריפסין / חומצת ing ethylenediaminetetraacetic (EDTA). לנטרל עם תקשורת וספין ב 400 x גרם.
   1. למעבר 6 גם בבקבוק T25, תאי מעבר בביחס 1: 1. ניתן passaged צלוחיות ומחוברות T25 של 1: 2 או 1: 3 יחס. למעבר מבקבוק T25 לבקבוק T75, להשתמש ביחס של 1: 1. תקשורת שינוי כל 2-3 ימים, ללא קשר לספינה.
   2. לגדל תאים ב 37 מעלות צלזיוס בחממת 5% humidified CO ₂ ותרבות בתקשורת myofibroblast שתוארה לעיל.
      הערה: תאי אפיתל אינם שורדים בתנאי התרבות או מעבר הללו. תאים המשמשים לאפיון ובמחקרים שתוארו להלן בין הקטעים 5 ו -15.
   3. קריו לשמר תאים בנוזל N ₂ על ידי הוספת 10% sulfoxide דימתיל לתקשורת myofibroblast.

3. תאים מאפיינים Murine ואדם הוושט סטרומה

1. בדוק את המורפולוגיה של תאים עם מיקרוסקופ הפוכה. שים לב לכישור-הצורהמורפולוגיה של תאים חסיד (איור 1).
2. לאפיין תאים בתרבית על ידי הערכה של סמני cytoskeletal הבאים: α-SMA, vimentin, desmin, וcytokeratin. תאי סטרומה עם פנוטיפ כמו myofibroblast-להביע סמני myofibroblast cytoskeletal α-SMA וvimentin (איור 2).
   1. להבחין נוסף תאי סטרומה בתרבית מתאי שריר, immunostain לdesmin. כדי לבצע immunostaining על תאים בתרבית, צלחת 1.5 x 10 ⁴ תאים בשקופיות קאמריות 4 היטב ולגדול בתקשורת myofibroblast למשך 24 שעות. תאי סטרומה עם פנוטיפ כמו myofibroblast-יהיו ביטוי desmin חלש או לא קיימים. תאי סטרומה חסרי ביטוי של הפאן-cytokeratin סמן אפיתל (מידע לא מוצג).
      הערה: הערכה של תרבויות כוללת הערכה של סמני cytoskeletal על ידי סמני immunocytochemistry ופני תא על ידי הזרימה cytometry. Immunocytochemistry משמש כשיטת העיקרית של אפיון כלשעברפרופיל pression של חלבוני cytoskeletal הוא ייחודי לפיברובלסטים, myofibroblast או תא שריר. Cytometry זרימה קובעת טוהר תרבות על ידי הערכת ביטוי פני תא של אפיתל, אנדותל, וסמני תאי hematopoietic. CD90 הוא מועיל כשיטת משלים של זיהוי תאי סטרומה אדם כפי שהוא בא לידי ביטוי בשני fibroblasts וmyofibroblasts האנושיים. CD90 הוא לא מועיל באפיון של תאי סטרומה עכבריים כפי שבאו לידי ביטוי גם על ידי תאי T עכבריים.
3. לאחר תאים מגיעים 60% מפגש, לשטוף שקופיות עם פוספט שנאגרו מלוח (PBS) ולתקן עם מתנול. דגירה תאים במתנול במשך 10 דקות ב -20 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לאחסן בPBS על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
4. עקוב פרוטוקול immunostaining סטנדרטי.
5. בקצרה, לפני החלת הנוגדן הראשוני, לחסום את התאים הקבועים עם goatserum 5% ב- PBS. לדלל נוגדנים ראשוניים ומשניים ב -5% בסרום עז גם כן.
   1. לצורך זיהוי של α-SMA וvimentin, השתמש בהנוגדנים הבאים וריכוזים: עכבר מאב לα-SMA ב 1: 250 דילול והארנב PAB לvimentin ב 1: 500 דילול.
   2. דגירה עם נוגדן ראשוני בטמפרטורת חדר למשך הלילה ב 4 ° C, לשטוף 3 פעמים עם PBS ולהוסיף נוגדנים משני עכבר אנטי עיזים מצומדות Rhodamine בדילול של 1: 200 וCy2 ארנב אנטי עיזים מצומדת בדילול של 1: 1,000 לשעה 1 בטמפרטורת חדר.
   3. גרעיני Counterstain עם 4 ', 6-Diamidino-2Phenylindole (DAPI) בריכוז של 1 מיקרוגרם / מיליליטר 1 דקות ולאחר מכן לשטוף עם PBS. לנתח שקופיות עם מיקרוסקופ הפוכה.
6. להקים טוהר תרבויות על ידי בדיקה של תאי הוושט עכבריים ואנושיים לhematopoietic (CD45) והאנדותל (CD31) סמנים פני תא על ידי הזרימה cytometry (איור 3). לאפיין תאים אנושיים עוד יותר על ידי ביטוי של CD90 הסמן פני תא סטרומה.
   הערה: CD90 לא יכול לשמש לזיהוי תאי סטרומה עכבריים כcel T העכבריls גם להביע CD90.
   1. ניתוק תאי סטרומה הוושט עכבר בתרבית מתרבות צלוחיות על ידי טיפול בתא אינו אנזימטית דיסוציאציה פתרון על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, לשטוף עם חיץ FACS פעמיים, נספר ומוכתם עם FITC-CD45 וAPC-CD31 עם פקדי isotype רלוונטיים, על פי לנהלי צביעה סטנדרטיים.
   2. איסוף תאים באמצעות Calibur FACS ולנתח נתונים עם תוכנת FlowJo. לפני תאים מכתימים, לייעל נוגדנים ולכייל ריכוזים באמצעות פקדי isotype, טחול עכבר רגיל, ותאי מח עצם.

Representative Results

תאי סטרומה הוושט המבודדים באמצעות עיכול מכאני והאנזימטית לראשונה מצופים ותרבותי ב6 צלחות גם. בדיקה של תאים עם מיקרוסקופ הפוך בתוך שעות של ציפוי מדגימה השעיה תא מעורבת חסיד רופף לתחתית הצלחת (איור 1 א). במהלך שעות הבאות 24, תאים דמויי כישור בתקיפות חסיד לתחתית הצלחת הם נצפו ירי מההשעיה המעורב התא (איור 1) .These תאי הנבטה מכסים את כל השטח של באר בתוך 5 ימים וניתן passaged בהצלחה, שמירה על מורפולוגיה לפחות 15 קטעים. תאים חסיד דמוי כישור הם נצפו בצפיפות נמוכה (איור 1 ג) וכאשר כמעט מחוברות (1D איור).

Immunostaining של תרבויות העיקריות של תאי סטרומה הוושט גדלו בשקופיות קאמריות מדגים ביטוי בשפע של סמני cytoskeletal myofibroblast α-SMA וvimentin (איוריור 2), ביטוי חלש של desmin, וcytokeratin נעדר.

תרבויות עיקריות של myofibroblasts הוושט יכולות להיבחן נוספת לטוהר תא על ידי בדיקה של hematopoietic וסמנים פני תא האנדותל. קדימה וצד הפיזור הוקמו לתאים ראשוניים עכבריים הוושט סטרומה ואחריו gating וניתוח של תאי חיים לחלבונים בתא שטח (איור 3 א). תאי סטרומה עיקריים עכבריים הוושט חסר הבעה של CD45 hematopoietic (איור 3) ותא האנדותל CD31 (איור 3 ג) סמנים פני תא.

איור 1:. תרבויות עיקריות של תאי סטרומה הוושט עכבריים בקטעים שונים של בחינת תאי סטרומה עכבריות עם מיקרוסקופ הפוך בתוך שעות של בידוד וציפוי מדגימה אשכול המעורב ceLLS תאים חסיד רופף לתחתית הצלחת (). לאחר 24-48 שעות בתרבות, תאים דמויי כישור צומחים מתוך האשכול עכשיו חסיד (B). מורפולוגיה ציר בצורה של תאים חסיד נמשכת בנמוך (C) וצפיפות גבוהה (D). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. (איורים בשימוש באישור מאכר et al. ^6).

איור 2: תאי סטרומה הוושט Murine גדלו בתרבות העיקרית להביע סמני myofibroblast α-SMA וvimentin תאי סטרומה ראשיים עכבריים הוושט גדלו על שקופיות קאמריות וimmunostained עבור α-SMA וvimentin במתון (AC) וצפיפות נמוכה (DF).. Esophageaתאי סטרומה l שפע להביע (A, D) וvimentin-SMA α (B, E). תאי סטרומה הוושט עכבריים שיתוף להביע סמני myofibroblast אלה (C, F). (איורים בשימוש באישור מאכר et al. ^6). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3: תרבויות עיקריות של תאי myofibroblasts הוושט עכבריים חסרי hematopoietic וסמנים פני תא אנדותל עלילת הנקודה של תאי סטרומה הוושט עכבריים, מדגימה את FSC ומאפייני SSC של אוכלוסייה זו של תאים.. כולל של 32.4% מאירועים היו סגור (), ביטוי של hematopoietic (CD45) והאנדותל (CD31) סמנים פני תא הוערכו על ידי i יחידהmmunostain על פי פרוטוקולים סטנדרטיים מכתים. צביעה ספציפיות שנקבעה לכל נוגדן באמצעות פקדי isotype. תרבויות עיקריות של תאי סטרומה הוושט עכבריים לא להביע CD45 (B) או CD31 (C). FSC: פיזור קדימה; SSC: פיזור צד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

הטכניקות לדור התרבות העיקרית הן בדרך כלל דומות בעת שימוש ברקמה עכברית או אדם עם זמנים וגנדרניים ועיכול מותאם לגודל רקמה. הניסיון שלנו עם רקמה עכברית מצביע על כך ששימוש בשיטות שתוארו לעיל לגרום באופן עקבי בהקמה מוצלחת של תרבויות עיקריות. צעדים קריטיים בפרוטוקול כוללים עיקור של ציוד כירורגי ולאחר טכניקות סטרילי סטנדרטיים של תרבית רקמה. הגיל של העכברים הוא גם שלב קריטי. 8 - ישנים ילודים יום 12 בעקביות להניב תרבויות עיקריות מוצלחות. תאי סטרומה המבודדים מילודים צעירים לא היו לא נוצרו בהצלחה. ניסיונות להקים תאי סטרומה כמו myofibroblast-מעכברים מבוגרים באופן שוטפים. אחרים דיווחו דור מוצלח של fibroblasts הוושט מעכברים בן ארבעה עד שמונה בשבוע ^8.

בניגוד להקמת myofibroblasts מעי הגס, זיהום הוא בעיה שכיחה בדוארstablishment של תרבויות של myofibroblasts העכברי כאשר אנטיביוטיקה כלולות במדיום התרבות. בגלל תרבויות הוקמו מעכברי ילוד, גורם מגביל הוא גודל רקמה קטן והפשטה של ​​propria muscularis אינו אפשרי בקלות. מצד השני, בוושט האנושי, propria muscularis הוא להבחין בקלות והופרד מרירית muscularis. תנאי העיכול והתרבות האנזימטית הם לא תורמים לצמיחה של תאי מערכת חיסון או אפיתל בתרבויות הוקמו מעכבר או וושט אנושי. דגימות כריתה אנושיות יישארו פגיעות לזיהום חיידקים למרות האנטיביוטיקה השימוש במדיום התרבות, אולי בגלל לכמת הגדול יותר של עיבוד רקמות עובר. בעקבות טכניקות תרבית רקמה סטנדרטית וקפדנות חיטוי מכשירי ניתוח מקטין סיכון לזיהום.

היתרון של התרבות העיקרית הוא שהתאים אלה הם יחסית unmanipulated ועשויים לשקף טוב יותר את הדואר in vivo סביבה בהשוואה לשורות תאים הונצחו ^9.

הטכניקה המתוארת היא ישר קדימה ונמצאת באמצעי רוב המעבדות. החסרון של תרבויות עיקריות לעומת שורות תאים הוא שתאים מעבר מעבר 15 רגישים למוטציה גנטית והזדקנות סופו של דבר. בנוסף, תרבויות עיקריות שהתקבלו בעכברים או בני אדם שיש לי שונות הגלומות לא נצפו בשורות תאים. שיטות חלופיות לבידוד פיברובלסטים הוושט תוארו ^10. אפיון של תאים אלה בתרבות אולם היה מוגבל לביטוי vimentin או הוכיח תאים המבטאים vimentin ורק בחולשה α-SMA חיובי ^10.

ברגע שטכניקה זו כבר שולטת, ניתן להקים תרבויות עיקריות מדגימות כריתה של וושט אדם חולה. שיטות אלה מספקות לחוקרים את היכולת לבודד ותאי סטרומה התרבות מקליניים שונהnd תנאי ניסוי, המאפשרים השוואה בין קבוצות. תאי סטרומה כמו myofibroblast-תרבותיים יכולים להיות גם פוטנציאל מותאם לשימוש במודלי organotypic או התרבות המשותפת עם תאים אחרים כגון אאוזינופילים ³ או בתרבות organotypic ^8.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue culture reagents
HBSS	Sigma Aldrich	H6648
Dispase	GIBCO, Invitrogen	17105-041
Collagenase XI	Sigma-Aldrich	C9407
DMEM	GIBCO, Invitrogen	11965-092
Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876
FBS	Sigma-Aldrich	F42442
Transferrin	Roche	10-652-202-001
trypsin/EDTA	Corning	25-052-Cl
Epidermal growth factor	Sigma-Aldrich	E9644
Reagents for immunostaining
Goat serum	Sigma Aldrich	G9023
Mouse mAB to α-SMA	abcam	ab7817
Rabbit pAB to vimentin	abcam	ab45939
Cy2 conjugated Goat anti Rabbit	Jackson ImmunoResearch	111-225-144
DAPI	Sigma-Aldrich	D8417
CD31 conjugated to eFluor 450	eBioscience	48-0319-41
CD90 conjugated to APC	eBioscience	17-0909-41
Annexin V and 7AAD	BD Pharmigen	559763
Mouse Fc block for CD16/CD32	BD Pharmigen	2136662
Equipment
5 ml tube	Eppendorf	30108310
Inverted microscope	Motic	AE31
Biosafety cabinet and incubators	Nuaire		http://www.nuaire.com/products/
4-well chamber slides	Thermo Scientific	177437
Refrigerated centrifuge	Eppendorf	5810R
Olympus Vacuum-Driven Filter System	Genesee Scientific	25-227
Fluorescent microscope	Nikon	Eclipse TE300
6-well plates	Corning	3516
T25 Flasks	TRP	90026
T75 Flasks	Corning	43064
Dissection scissors
Dissection forceps
Single tipped Q-Tips	Kendall	540500
Software
Metamorph software (Molecular Devices)	Molecular Devices
FACSCAlibur	BD Bioscience
FACSVerse	BD Bioscience