Abstract
Murina och mänsklig esofagus myofibroblaster genereras via enzymatisk nedbrytning. Neonatal (8-12 dagar gamla) murina matstrupe skördas, malet, tvättas, och utsattes för enzymatisk spjälkning med kollagenas och dispas i 25 min. Mänskliga esofagus resektion exemplaren tagen muscularis propria och adventitia och resterande slemhinnan är malet, och utsattes för enzymatisk spjälkning med kollagenas och dispas för upp till 6 timmar. Odlade celler uttrycker α-SMA och vimentin och express desmin svagt eller inte alls. Odlingsbetingelser är inte bidrar till tillväxten av epitelial, hematopoetisk eller endotelceller. Kultur renhet bekräftas ytterligare av flödescytometrisk utvärdering av cellytmarkör uttryck för potentiell kontamine hematopoetiska och endotelceller. Den beskrivna tekniken är enkel och resulterar i en konsekvent alstring av icke-hematopoieitc, icke-endoteliala stromaceller. Begränsningar med denna teknik är inneboende i användningen avprimära kulturer i molekylärbiologiska studier, dvs, den oundvikliga variabiliteten stött mellan kulturer etablerade på olika möss eller människor. Primära kulturer är dock en mer representativ bild av tillståndet in vivo jämfört med cellinjer. Dessa metoder ger också utredarna möjlighet att isolera och kultur stromaceller från olika kliniska och experimentella förhållanden, vilket gör jämförelser mellan grupper. Karaktäriserade esofagus stromaceller kan också användas i funktionella studier som undersöker epiteliala-stromal interaktioner i esofagus sjukdomar.
Introduction
Epitelceller-stromal interaktioner är involverade i regleringen av olika mag-tarmkanalen funktioner inklusive mucosal förnyelse, reparation, fibros och cancer 1,2. Dessa interaktioner har bäst studerade i tunntarmen och tjocktarmen och kan på liknande sätt spela en roll i esofagus slemhinnor sjukdomar 3. En subpopulation av intestinala och kolon stromaceller benämnda myofibroblaster har visats delta i mediering vävnadsskada, inflammation och reparera 4,5. I den distala magtarmkanalen, dessa spindelformade celler belägna intill basalmembranet vid gränssnittet mellan epitel och lamina propria och definieras som α-SMA och vimentin positivt, pan-cytokeratin negativ, och svagt positiv eller negativ desmin 5.
Esofagus stroma har inte rigoröst karakteriseras vid en cellulär eller molekylär nivå. Vårt arbete i murina matstrupen har frånmonstrated α-SMA och vimentin celler i matstrupen stroma, ibland underliggande till skivepitel 6. Epiteliala-stromala interaktioner har implicerats i esofageala mukosala störningar, såsom gastro-esofageal medierad skada 6 och eosinofil esofagit 3. Fibrotiska förträngningar är också en känd komplikation vid esofagus skador och stromaceller har varit inblandade i patogenesen för gastrointestinal fibros. Isolering av dessa celler kommer att hjälpa uppnå nödvändiga studier för att undersöka sinnesrubbat signalvägar.
Denna inlämning ger de tekniker som behövs för att fastställa primära kulturer av α-SMA positiva, vimentin positiva myofibroblaster så att befintliga kunskapsluckor när det gäller signalvägar som förmedlar dessa interaktioner kan åtgärdas. Den teknik som beskrivs har framgångsrikt använts av författarna att etablera primära murina colonic myofibroblaster 7 och further anpassad för etablering av murina 6 och mänskliga myofibroblast liknande esofagus stromaceller.
Häri beskriver vi förutsättningar för att etablera och karakterisera dessa kulturer etablerade från mus eller människa matstrupe före användning i framtida funktionella studier. Kulturer kan odlas och användas för upp vid 15 passager. Isolering och etablering av primära kulturer genom de metoder som beskrivs nedan genererar stromaceller med myofibroblast fenotyp; α-SMA, vimentin positiv och svagt positiv eller negativ för desmin och cytokeratin negativt. Denna fenotyp är distinkt från fenotypen av esofagus fibroblast som är övervägande vimentin positiv, α-SMA negativ tre eller α-SMA positiv, vimentin negativa fenotypen av muscularis mucosae 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet att utföra djurförsök, motiven och mål forskning, lämnades in och godkänts av University of Southern California Institutional Animal Care och användning kommittén.
Protokollet för etablering av primära kulturer från avidentifieras humana esophagectomy exemplar godkändes av University of Southern California Institutional Review Board.
1. Skaffa Mus eller Human matstrupen
- Erhåll Mus Matstrupe:
- Euthanize 8-12 dagar gammal mus med 2% isofluran inhalant överdos följt av halsdislokation.
- Nåla djuret ner med magen uppåt och väta ventrala ytan med 70% etanol. Med pincett, ta tag och lyft upp huden främre till urinrörsöppningen med pincett. Använd standard raka kirurgiska sax för att klippa längs den ventrala mittlinjen från urinrörets mynning till hakan. Var noga med att skära bara huden. </ Li>
- Gör ett snitt från urinrörets öppning nedåt till knät på båda sidor om djuret, som bildar en upp och ner "Y". Gör en annan snitt på båda sidor om djuret längs bröstkorgen.
- Dra försiktigt huden på båda sidor, bort av den underliggande bukhinnan och bröstkorgen, och lägg åt sidorna. Undersök bröstkorgen som ligger över brösthålan och peritoneum ligger över bukhålan.
- Lyft upp bukhinnan med pincett och skär genom det upp till membranet och bröstkorgen, pekar sax uppåt för att förhindra skador på buken innehållet. Lyft försiktigt upp den vänstra loben av levern, exponera den underliggande magen, esofagus och magsäck korsningen och den abdominala delen av matstrupen.
- Använd autoklaveras kirurgisk sax för att skära genom bröstbenet och bröstkorgen längs mittlinjen fram till den cervikala gördel. Point sax uppåt för att förhindra skador på bröstkorg innehållet. Fullt exponera innehållet ibrösthålan genom att dra i bröstkorgen till sidorna.
- Ta försiktigt bort hjärtat och båda loberna i lungorna. Sug överflödigt blod med Q-tips. Den bröstkorg matstrupen är en smal, flexibel slang liggande posterior till luftstrupen och anterior till bröstkotan.
OBS: Matstrupen kan vara svårt att identifiera i murina nyfödda. Lokalisering av matstrupen-gastric korsning gör esofagus identifiering okomplicerad. - Följ noggrant matstrupen upp från magen, dissekera den omgivande vaskulaturen, fett och tarmkäx hela vägen upp till den esofageala ursprung i hals kaviteten. Kirurgiska sax med trubbiga spetsen fungerar bäst för detta ändamål.
- Resekera hela längden av matstrupen och placera i Hanks balanserade saltlösning (HBSS) för ytterligare bearbetning som beskrivs nedan. Avlägsna en del av magsäcken för orienteringsändamål om så önskas.
OBS: På grund av små vävnadsstorlek, separation av muscularis propria från muskelär slemhinnan inte uppnås i murina nyfödda matstrupe och hela matstrupen utsätts för bearbetning som beskrivs nedan.
- Erhåll Humant Matstrupe:
- Tvätta esofagus resektion exemplar (vanligen 5 cm eller mindre) med HBSS och ta bort eventuella bifogade bindväv, fett, eller kärl.
- Resekera en del av provet och placera i formalin för framtida histologisk undersökning om så önskas.
- Separera de återstående slemhinna från underliggande muscularis propria med skarp dissektion.
- Skär slemhinnan i under centimeters fragment och med förbehåll för det protokoll som beskrivs nedan.
OBS: Mänskliga matstrupe resektioner kan lagras i PBS under upp till 6 h före bearbetningen beskrivs nedan. Källa till esophagectomy exemplar kommer att diktera provet storlek och kommer att vara beroende laboratorium.
2. Isolera Murina och Human Esofagus stromaceller
- Isolera esofagus stromaceller from murin och human vävnad genom en kombination av mekanisk och enzymatisk digestion.
- Mekaniskt smälta genom finhacka vävnaden med sax och flera tvättar med HBSS. Enzymatiskt smälta genom att inkubera vävnaden med 300 U / ml kollagenas XI och 0,1 mg / ml dispas under 25 min (murin vävnad) eller i upp till 6 h (mänsklig vävnad). Se till att instrument som används för malningen har autoklaveras och steriliseras.
OBS: Kollagenaser är enzymer som bryter ner kollagen, ett extracellulärt matrixprotein som ansvarar för att hålla djurvävnad tillsammans. Kollagenas XI har hög kollagenas aktivitet och har sett framgång i denna isolering protokoll. Dispas är ett bakteriellt enzym med milt proteolytisk dissociation aktivitet som bevarar cellmembranet aktivitet och används i kombination med kollagenas som en sekundär enzym. - Placera slemhinnor fragment erhållna från mus eller människa vävnad i 1,7 ml mikrocentrifug eller 5 ml rör respektive, innehållande HBSS. Mal vävnad ytterligarein 2-3 mm stycken med användning av sax med en öppen spets bredd som kommer att passa in i respektive rör. Avsätt tillräckligt med tid för att möjliggöra esofagus slemhinnor fragment sedimentera till botten av röret.
- Sakta dekantera HBSS, försiktigt så att inte oavsiktligt kassera vävnaden. Ersätt med färsk HBSS efter genom försiktig skakning. Alternativt, ta bort HBSS med en 1 ml pipett.
- Tvätta vävnaden på detta sätt totalt åtta gånger med försiktig skakning i mellan tvättar vilket ger tid för esofageala fragment sedimentera mellan varje tvätt.
OBS: Human vävnad kommer att kräva mer mals den nyfödda mus vävnad.
- Mekaniskt smälta genom finhacka vävnaden med sax och flera tvättar med HBSS. Enzymatiskt smälta genom att inkubera vävnaden med 300 U / ml kollagenas XI och 0,1 mg / ml dispas under 25 min (murin vävnad) eller i upp till 6 h (mänsklig vävnad). Se till att instrument som används för malningen har autoklaveras och steriliseras.
- Inkubera murina vävnad med 300 U / ml kollagenas XI och 0,1 mg / ml dispas för 25 min på en gungande shaker inställd på en låg hastighet vid rumstemperatur.
- Inkubera mänsklig vävnad med 300 U / ml XI kollagenas och 0,1 mg / ml dispas för upp till 6 tim, på en gungande shaker inställd på en låg hastighet vid rumstemperatur.
OBS: Tillgänglighet av mänsklig esophagus är variabel. Human matstrupen slemhinna inkuberades med enzymer för upp till 6 tim leder framgångsrik generation primärkulturer.
- Inkubera mänsklig vävnad med 300 U / ml XI kollagenas och 0,1 mg / ml dispas för upp till 6 tim, på en gungande shaker inställd på en låg hastighet vid rumstemperatur.
- Efter enzymatisk digerering, färs vävnad ytterligare med saxar och centrifugera vid 200 xg under 10 min.
- Kassera supernatanten. Överför pelleten, bestående av en blandad cellsuspension till en 5 ml rör och tvätta 5 gånger i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) kompletterat med 2% sorbitol för att eliminera icke-viabla celler och rester.
- Seed-celler i 6-brunnars plattor och kultur i DMEM med 10% fetalt bovint serum (FBS), 10 mg / ml insulin, 10 | ig / ml transferrin, 10 | ig / ml gentamicin och 2 ng / ml epidermal tillväxtfaktor (EGF) . Vakuumfilter (0,22 um) alla komponenter utom EGF som kan läggas efter filtrering. Fördela celler erhållna från humana resektion prover mellan flera sex-brunnars plattor, beroende på resektion storleken.
- När brunnar är 80% sammanflytande, passage vidhäftande celler till T25 kolvar ossing 0,05% trypsin / etylendiamintetraättiksyra (EDTA). Neutralisera med media och snurra på 400 x g.
- För en 6 väl passage till en T25-kolv, passage celler vid en 1: 1-förhållande. Konfluenta T25 kolvar kan passe på en 1: 2 eller 1: 3-förhållande. Till passage från en T25 kolv till en T75 kolv, använd en 1: 1-förhållande. Ändra media var 2-3 dagar oavsett fartygets.
- Odla cellerna vid 37 ° C i en fuktad 5% CO2-inkubator och kultur på myofibroblast medier som beskrivits ovan.
OBS: Epitelceller inte överleva under dessa kultur eller passagevillkoren. Celler som används för karakterisering och i de studier som beskrivs nedan är mellan passagerna 5 och 15. - Cryo-bevara celler i flytande N 2 genom att lägga 10% dimetylsulfoxid till myofibroblast media.
3. Karakterisera Murina och Human Esofagus stromaceller
- Undersök morfologin hos celler med ett inverterat mikroskop. Observera spolformadmorfologi av adherenta celler (figur 1).
- Karakterisera odlade celler genom utvärdering av följande cytoskelettala markörer: α-SMA, vimentin, desmin och cytokeratin. Stromaceller med myofibroblast liknande fenotyp uttrycker cytoskelettala myofibroblast markörer α-SMA och vimentin (Figur 2).
- För att ytterligare särskilja odlade stromaceller från muskelceller, immunostain för desmin. För att utföra immunfärgning på odlade celler, plåt 1.5 x 10 4 celler i 4 brunnar kammare diabilder och växa i myofibroblast media för 24 timmar. Stromaceller med myofibroblast liknande fenotyp kommer att ha svag eller frånvarande desmin uttryck. Stromaceller saknar expression av den epiteliala markör pan-Cytokeratin (data ej visade).
OBS: Bedömning av kulturer omfattar utvärdering av cytoskelettala markörer genom immuncytokemi och cellytmarkörer genom flödescytometri. Immuncytokemi används som den primära metoden för karakterisering som frittpresprofil cytoskelettproteiner är unik för fibroblast, myofibroblast eller muskelcell. Flödescytometri etablerar kultur renhet genom att utvärdera cellytan uttryck av epitel, endotelceller och hematopoetiska celler markörer. CD90 är användbart som en kompletterande metod för att identifiera humana stromaceller som det uttrycks på både mänskliga fibroblaster och myofibroblaster. CD90 är inte till hjälp för karakterisering av murina stromaceller som det också uttrycks av murina T-celler.
- För att ytterligare särskilja odlade stromaceller från muskelceller, immunostain för desmin. För att utföra immunfärgning på odlade celler, plåt 1.5 x 10 4 celler i 4 brunnar kammare diabilder och växa i myofibroblast media för 24 timmar. Stromaceller med myofibroblast liknande fenotyp kommer att ha svag eller frånvarande desmin uttryck. Stromaceller saknar expression av den epiteliala markör pan-Cytokeratin (data ej visade).
- Efter det att cellerna når 60% konfluens, skölj objektglasen med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och fixera med metanol. Inkubera cellerna i metanol under 10 min vid -20 ° C, sedan lagra i PBS vid 4 ° C fram till användning.
- Följ standardimmunfärgning protokoll.
- I korthet, före applicering av primär antikropp, blockera de fixerade cellerna med 5% goatserum i PBS. Späd primära och sekundära antikroppar i 5% get serum samt.
- För detektion av α-SMA och vimentin, användFöljande antikroppar och koncentrationer: Mus mAb till α-SMA vid 1: 250 utspädning och Kanin pAB till vimentin vid 1: 500 utspädning.
- Inkubera med primär antikropp vid rumstemperatur över natten vid 4 ° C, skölj 3 gånger med PBS och till sekundära antikroppar Rhodamine konjugerat get-anti-mus i en spädning av 1: 200 och Cy2-konjugerad get-anti-kanin vid en utspädning av 1: 1000 under 1 h vid rumstemperatur.
- Motfärg kärnor med 4 ', 6-diamidino-2Phenylindole (DAPI) vid en koncentration av 1 | ig / ml under 1 minut och sedan tvätta med PBS. Analysera bilder med ett inverterat mikroskop.
- Upprätta renhet av kulturer genom undersökning av murina och humana esofagus celler för hematopoetiska (CD45) och endotelceller (CD31) cellytmarkörer av flödescytometri (Figur 3). Karakterisera mänskliga celler vidare medelst uttryck av den stromala cellytemarkören CD90.
OBS: CD90 kan inte användas för att identifiera murina stromaceller som murina T cells uttrycker också CD90.- Dra av odlade mus esofagus stromaceller från odlingskolvarna genom behandling med icke-enzymatisk Cell Dissociation Solution vid 37 ° C under 10 min, tvättades med FACS-buffert två gånger, räknades och färgades med FITC-CD45 och APC-CD31 med relevanta isotypkontrollerna, enligt standardfärgningsförfaranden.
- Samla celler med FACS Calibur och analysera data med FlowJo programvara. Före färgning celler, optimera antikroppar och titrera koncentrationer med hjälp isotypkontroller, vanlig mus mjälte, och benmärgsceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Esophageal stromala celler som isolerats med användning av mekanisk och enzymatisk digere initialt pläterade och odlades i 6 brunnars plattor. Undersökning av celler med ett inverterat mikroskop inom timmar efter plätering demonstrerar en blandad cellsuspension löst vidhäftande till plattans botten (Figur 1A). Under nästa 24 tim, är spindelformade celler fast vidhäftande till plattan botten observerade skytte från den blandade cellsuspensionen (Figur 1B) .Dessa gro celler täcka hela området av en väl inom 5 dagar och kan passe framgångsrikt, behålla morfologi under åtminstone 15 passager. Spolformad adherenta celler observeras vid låg densitet (figur 1C) och när nära-konfluenta (figur 1D).
Immunfärgning av primära kulturer av esofagus stromaceller odlas i kammar diabilder visar rikligt uttryck av myofibroblast cytoskelettala markörer α-SMA och vimentin (Figure 2), svag uttryck för desmin och frånvarande cytokeratin.
Kan undersökas Primära kulturer av esofagus myofibroblaster vidare för cell renhet genom undersökning av hematopoetiska och endoteliala cellytmarkörer. Framåt och sidospridning är etablerade för primära murina esofageala stromala celler följt av grindning och analys av levande celler för cellyteproteiner (figur 3a). Primära murina esofagus stromaceller saknar uttryck av hematopoetisk CD45 (Figur 3B) och endotelceller CD31 (Figur 3C) cellytmarkörer.
Figur 1:. Primära kulturer av murina esofagus stromaceller vid olika passager Undersökning av murina stromaceller med ett inverterat mikroskop inom timmar av isolering och plätering visar ett kluster av blandad ceLLS löst vidhäftande celler till plattans botten (A). Efter 24-48 timmar i kultur, spindelformade celler gro från nu vidhäftande kluster (B). Spolformad morfologi vidhäftande celler kvarstår vid låg (C) och hög (D) täthet. Klicka här för att se en större version av denna siffra. (Siffrorna används med tillstånd från Shaker et al. 6).
Figur 2: Murina esofagus stromaceller odlas i primär kultur uttrycker myofibroblast markörer α-SMA och vimentin Primära murina esofagus stromaceller odlades på kammar diabilder och immunostained för α-SMA och vimentin vid måttlig (AC) och låg densitet (DF).. Esophageal stromaceller rikligt uttrycker α-SMA (A, D) och vimentin (B, E). Murina matstrupen stromaceller samar uttrycka dessa myofibroblast markörer (C, F). (Siffror som används med tillstånd från Shaker et al. 6). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Primära kulturer av murina esofageala myofibroblaster celler saknar hematopoetiska och endoteliala cellytmarkörer Den punktdiagram av murina esophageal stromaceller, demonstrerar FSC och SSC egenskaperna hos denna population av celler.. Totalt 32,4% av händelser gated (A), var uttryck för hematopoetisk (CD45) och endotelceller (CD31) cellytemarkörer utvärderas av en enda immunostain enligt standardfärgningsprotokoll. Ospecifik färgning bestämdes för varje antikropp med användning isotypkontrollerna. Primära kulturer av murina esofagus stromaceller uttrycker inte CD45 (B) eller CD31 (C). FSC: framåtspridning; SSC: sidospridning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Teknikerna för primär kultur generation är i allmänhet likartad när murina eller mänsklig vävnad med Kött och matsmältning tider anpassade för vävnadsstorlek. Vår erfarenhet med mus vävnad antyder att användning av de metoder som beskrivs ovan konsekvent leda lyckad etablering av primära kulturer. Kritiska steg inom protokollet omfattar sterilisering av kirurgisk utrustning och efter standardiserade sterila tekniker för vävnadsodling. Åldern på mössen är också ett kritiskt steg. 8-12 dagar gamla nyfödda konsekvent ge framgångsrika primära kulturer. Stromaceller isolerade från yngre nyfödda har inte inte lyckats genereras. Försök att upprätta myofibroblast liknande stromaceller från äldre möss pågår. Andra har rapporterat framgångsrika generation esofagus fibroblaster från fyra till åtta veckor gamla möss 8.
Till skillnad från etablering av kolon myofibroblaster är förorening ett ovanligt problem i ekontraktet av kulturer av murina myofibroblaster när antibiotika inkluderas i odlingsmediet. Eftersom kulturer är etablerade från nyfödda möss, är en begränsande faktor liten vävnadsstorlek och strippning av muscularis propria inte är lätt genomförbar. Å andra sidan, i den mänskliga matstrupen är muscularis propria lätt urskiljbara och separeras från muscularis mucosa. De enzymatiska matsmältningen och odlingsbetingelser är inte bidrar till tillväxten av immun- eller epitelceller i kulturer etablerade från mus eller människa matstrupen. Mänskliga resektion exemplar kvar sårbara för bakteriell kontamination trots antibiotika användning i odlingsmediet, kanske på grund av den större kvantifiera av vävnad som behandlas. Efter standardvävnadsodlingstekniker och strikt sterilisering kirurgiska instrument minskar risken för kontaminering.
Fördelen med primär kultur är att dessa celler är relativt omanipulerat och kan bättre spegla the in vivo miljö jämfört odödliga cellinjer 9.
Den beskrivna tekniken är okomplicerad och är inom medlen flesta laboratorier. Nackdelen med primärkulturer kontra cellinjer är att celler bortom passage 15 är mottagliga för genetisk mutation och slutligen åldrande. Dessutom primära kulturer erhållna från möss eller människor har inneboende variabilitet inte observerats i cellinjer. Alternativa metoder för esofagus fibroblast isolering har beskrivits 10. Karaktärisering av dessa celler i kultur men har begränsats till vimentin uttryck eller har visat celler som uttrycker vimentin och är endast svagt α-SMA positiva 10.
När denna teknik har bemästrat, kan primära kulturer etableras från resektion exemplar av sjuka människans matstrupen. Dessa metoder ger utredare möjlighet att isolera och kultur stromaceller från olika kliniska and experimentella förhållanden, vilket gör jämförelser mellan grupper. Odlade myofibroblast liknande stromaceller kan också potentiellt anpassad för användning i organotypiska eller co-kultur-modeller med andra celler, såsom eosinofiler 3 eller i organotypisk kultur 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Detta arbete stöds av NIH / NCI K08CA153036-01A1 (AS), AGA-General Mills Bell Institute of Health and Nutrition Research Scholar Award i Gut fysiologi och hälsa (AS) och en Wright Foundation Pilot Award (AS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue culture reagents | |||
| HBSS | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Dispase | GIBCO, Invitrogen | 17105-041 | |
| Collagenase XI | Sigma-Aldrich | C9407 | |
| DMEM | GIBCO, Invitrogen | 11965-092 | |
| Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F42442 | |
| Transferrin | Roche | 10-652-202-001 | |
| trypsin/EDTA | Corning | 25-052-Cl | |
| Epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Reagents for immunostaining | |||
| Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Mouse mAB to α-SMA | abcam | ab7817 | |
| Rabbit pAB to vimentin | abcam | ab45939 | |
| Cy2 conjugated Goat anti Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 111-225-144 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | |
| CD31 conjugated to eFluor 450 | eBioscience | 48-0319-41 | |
| CD90 conjugated to APC | eBioscience | 17-0909-41 | |
| Annexin V and 7AAD | BD Pharmigen | 559763 | |
| Mouse Fc block for CD16/CD32 | BD Pharmigen | 2136662 | |
| Equipment | |||
| 5 ml tube | Eppendorf | 30108310 | |
| Inverted microscope | Motic | AE31 | |
| Biosafety cabinet and incubators | Nuaire | http://www.nuaire.com/products/ | |
| 4-well chamber slides | Thermo Scientific | 177437 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Olympus Vacuum-Driven Filter System | Genesee Scientific | 25-227 | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse TE300 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| T25 Flasks | TRP | 90026 | |
| T75 Flasks | Corning | 43064 | |
| Dissection scissors | |||
| Dissection forceps | |||
| Single tipped Q-Tips | Kendall | 540500 | |
| Software | |||
| Metamorph software (Molecular Devices) | Molecular Devices | ||
| FACSCAlibur | BD Bioscience | ||
| FACSVerse | BD Bioscience | ||
References
- Stappenbeck, T. S., Miyoshi, H. The role of stromal stem cells in tissue regeneration and wound repair. Science. 324 (5935), 1666-1669 (2009).
- Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. Mesenchymal cells of the intestinal lamina propria. Annu Rev Physiol. 73, 213-237 (2011).
- Rieder, F., et al. T-Helper 2 Cytokines, Transforming Growth Factor beta1, and Eosinophil Products Induce Fibrogenesis and Alter Muscle Motility in Patients With Eosinophilic Esophagitis. Gastroenterology. 146 (5), 1266-1277 (2014).
- Powell, D. W., et al. Paracrine cells important in health and disease. The American Journal of Physiology. 277 (1 Pt. 1), C1-9 (1999).
- Powell, D. W., et al. Intestinal subepithelial myofibroblasts. The American Journal of Physiology. 277 (2 Pt. 1), C183-201 (1999).
- Shaker, A., et al. Stromal cells participate in the murine esophageal mucosal injury response. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (7), 662-672 (2013).
- Shaker, A., et al. Epimorphin deletion protects mice from inflammation-induced colon carcinogenesis and alters stem cell niche myofibroblast secretion. The Journal of Clinical Investigation. 120 (6), 2081-2093 (2010).
- Kalabis, J., et al. Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture. Nature Protocols. 7 (2), 235-246 (2012).
- Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).
- Rieder, F., et al. Gastroesophageal reflux disease-associated esophagitis induces endogenous cytokine production leading to motor abnormalities. Gastroenterology. 132 (1), 154-165 (2007).
