Abstract
通过酶消化产生小鼠和人的食管肌成纤维细胞。新生儿（8-12天龄）鼠食管收获，切碎，清洗，并进行酶促消化用胶原酶和分散酶25分钟。人食管切除标本被剥离固有肌层和外膜的，剩余的粘膜被切碎，并经受酶促消化用胶原酶和分散酶长达6小时。培养的细胞表达α-SMA和波形和快递结蛋白弱或根本没有。培养条件不利于上皮，造血，或内皮细胞的生长。培养纯度通过潜在污染造血细胞和内皮细胞的细胞表面标志物表达的流式细胞仪评估进一步证实。所描述的技术很简单，导致一致的新一代非hematopoieitc，非内皮细胞间质中。这种技术的局限性是固有的使用分子生物学的研究， 也就是小学文化，不可避免的遇到变异在不同老鼠或人类建立文化之间。然而，小学文化是在体内状态的比较有代表性的反映相比，细胞系。这些方法还提供了调查以分离的能力，并从不同的临床和实验条件培养基质细胞，使组间的比较。其特征食管基质细胞还可以在功能性研究调查食管疾病上皮 - 基质相互作用使用。
Introduction
上皮-间质相互作用中涉及的各种胃肠道功能，包括黏膜再生，修复，纤维化和癌变1,2的调节。这些相互作用已被研究最多在小肠和结肠，并且可以类似地发挥在食管粘膜紊乱3的作用。肠和结肠的基质细胞被称为成肌纤维细胞的一个亚群已被证实参与介导组织损伤，炎症和修复4,5。在远端胃肠道，这些梭形细胞位于邻近所述基底膜在上皮和粘膜固有层之间的界面，并被定义为α-SMA和波形蛋白阳性，泛细胞角蛋白阴性，弱阳性或阴性结蛋白5。
食管基质未被严格特征在于在细胞或分子水平。我们在鼠食管工作脱monstratedα-SMA和波形蛋白的细胞在食管基质，偶尔下层的鳞状上皮6。上皮-间质相互作用已牵涉食管粘膜障碍如胃食管损伤介导6和嗜酸细胞性食管3。纤维化狭窄也食管损伤和间质细胞的公知的并发症有牵连胃肠纤维化的发病机制。这些细胞的分离将帮助完成必要的研究，调查疯狂的信号通路。
这次提交提供必要建立α-SMA阳性，波形积极肌纤维母细胞原代培养，使得知识有关的信号通路介导这些相互作用存在的差距可以解决的技术。所描述的技术已成功地用于由作者建立原代鼠结肠肌成纤维细胞7和furthe适合建立小鼠6和人类肌成纤维细胞样食管间质细胞的河
在此我们描述建立和表征小鼠或将来的功能研究，使用前人类食道建立这些文化需要的条件。培养物可以生长并用于向上以15的通道。隔离并建立原代培养物的通过的方法概述如下生成的基质细胞与成肌纤维细胞表型; α-SMA，波形蛋白阳性以及弱阳性或阴性结蛋白，和细胞角蛋白阴性。这种表型是从食道成纤维细胞的表型主要是波形蛋白阳性，α-SMA的负3或粘膜肌层6的α-SMA阳性，波形蛋白阴性表型明显。
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Protocol
的协议来执行动物实验，其理由和研究的目的，是由南加州机构动物护理和使用委员会的大学提交和批准。
该协议建立了从去鉴定人食管癌标本原代培养批准了南加州机构审查委员会的大学。
1.获取鼠标或人类食管
- 获得鼠标食道：
- 安乐死8-12天的小鼠用2％异氟烷吸入过量颈椎脱位。
- 针的动物与腹部朝上向下和润湿腹侧表面用70％的乙醇。用钳子，抓住并提起皮肤前到尿道口钳。使用标准的直外科剪刀沿着从尿道开口到下巴的腹中线切开。小心切只有皮肤。</ li>
- 使从尿道下方上的动物两侧的膝盖开口的切口，形成一个倒的“Y”。使在沿肋笼动物两侧另一个切口。
- 小心剥离皮肤两侧，离底层腹膜和肋骨，打下向两侧。检查左肋覆盖在胸腔和腹膜覆盖腹腔。
- 抬起用钳子腹膜和切穿它到隔膜和肋骨，向上指向剪刀，以防止损坏腹腔内容。轻轻抬起肝左叶，露出底层的胃，食管胃交界处的食道的腹部部分。
- 使用高压灭菌手术剪通过胸骨和肋骨沿中线到颈椎腰带削减。点剪刀向上，以防止损坏的胸内容。充分暴露的内容胸腔拉动左肋向两侧。
- 轻轻取出心脏和肺的两叶。吸收多余的血液与Q-提示。胸食管是一个狭长的，柔性管躺在后方气管和前向胸椎。
注：食道可能难以识别鼠新生儿。食管胃交界处的本地化，使食管识别简单。 - 认真遵循食道从胃，解剖周围的血管，脂肪和肠系膜一路攀升至食管起源于宫颈腔。手术剪与钝头最适合于此目的。
- 切除食道和发生在Hanks'平衡盐溶液（HBSS），用于进一步的处理如下所述的整个长度。如果需要的话为取向的目的移除胃的一部分。
注：由于小规模组织，固有肌层从肌层分离是粘膜是无法实现在小鼠新生儿食道和整个食管进行下面的处理进行说明。
- 获得人食道：
- 用HBSS洗食管切除标本（一般为5厘米以内），并删除任何附加的结缔组织，脂肪，血管或。
- 切除的样本的一部分，并放置在福尔马林中以备将来组织学检查，如果需要的。
- 由锐性剥离分开底层固有肌层其余粘膜。
- 切断黏膜成子厘米的片段，并受到下面描述的协议。
注：人食道切除可以存储在PBS长达6小时前处理进行说明。食管癌的标本来源将决定试样尺寸并且将实验室的依赖。
2.隔离小鼠和人的食管间质细胞
- 分离食管间质细胞˚FROM鼠和人体组织中的机械和酶消化的组合。
- 通过切碎用剪刀和多次洗涤用HBSS组织机械地消化。通过温育与300U / ml胶原酶XI和0.1毫克/毫升分散酶25分钟（鼠组织），或长达6小时（人组织）的组织酶促消化。确保用于切碎仪器已经高压灭菌消毒。
注：胶原酶是分解胶原蛋白，负责保持动物组织在一起的细胞外基质蛋白的酶。胶原酶XI具有较高的胶原酶活性，并已经看到了这种隔离协议的成功。分散酶是细菌酶的轻度蛋白水解解离的活性，可以保留细胞膜的活性，并结合使用胶原酶作为辅助酶。 - 放置来自小鼠或人的组织中1.7毫升微型离心机或5毫升管分别得到粘膜片段，含有HBSS中。百果组织进一步成用剪刀以开放的尖端宽度将适用于各管2-3毫米的碎片。留出足够的时间，以便食管粘膜碎片沉淀到试管底部。
- 慢慢倒出HBSS，小心不要无意中丢弃的组织。更换新鲜HBSS继轻轻摇动。另外，除去HBSS用1毫升吸管。
- 以这种方式，共8次，洗涤时间，允许食管片段每次洗涤之间滓之间轻轻摇动在洗净组织。
注：人体组织将需要更多切碎的新生小鼠组织。
- 通过切碎用剪刀和多次洗涤用HBSS组织机械地消化。通过温育与300U / ml胶原酶XI和0.1毫克/毫升分散酶25分钟（鼠组织），或长达6小时（人组织）的组织酶促消化。确保用于切碎仪器已经高压灭菌消毒。
- 孵育鼠组织与300U / ml胶原酶XI和0.1毫克/毫升分散酶25分钟上的摇床上设定为低速，在室温下进行。
- 孵育人体组织与300U / ml的十一胶原酶和0.1mg / ml的分散酶长达6小时，在摇床上设定为低速，在室温下进行。
注：可用性人类esopha的GUS是可变的。人类食管粘膜孵育酶长达6小时的结果成功代原代培养的。
- 孵育人体组织与300U / ml的十一胶原酶和0.1mg / ml的分散酶长达6小时，在摇床上设定为低速，在室温下进行。
- 酶消化后，肉组织进一步用剪刀和离心机在200×g离心10分钟。
- 弃去上清液。传送颗粒，它由混合细胞悬浮液以5毫升管洗5次中的Dulbecco改进的Eagle培养基（DMEM），补充有2％的山梨糖醇，以消除不能存活的细胞和碎片。
- 种子细胞在6孔板并培养在DMEM，用10％胎牛血清（FBS），10毫克/毫升的胰岛素，10μg/ ml的转铁蛋白，10微克/毫升庆大霉素，和2纳克/毫升的表皮生长因子（EGF） 。真空过滤器（0.22微米），它可以在过滤后加入除EGF的所有组件。分发从人切除标本获得的细胞多6孔板中，根据不同的切除大小。
- 一旦井80％融合，通过贴壁细胞T25烧瓶我们荷兰国际集团0.05％胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）。中和与媒体和旋以400×g的。
- 对于6孔通路到T25培养瓶中，传代细胞以1：1的比例。 2或1：3的比例汇合的T25烧瓶可以在1可以传代。从T25培养瓶中于T75烧瓶中通过，使用1：1的比例。改变媒体不管容器的每2-3天。
- 生长在潮湿的5％CO 2培养箱培养并在上述成肌纤维细胞的培养基，在37ºC。
注：上皮细胞没有这些文化和通道的条件下生存。用于表征，并在下面描述的研究细胞通路5和15之间。 - 通过加入10％二甲亚砜的肌成纤维细胞培养基冷冻保存的细胞在液体N 2。
3.定性小鼠和人的食管间质细胞
- 检查细胞的形态与倒置显微镜。观察纺锤形贴壁细胞的形态（ 图1）。
- α-SMA，波形蛋白，结蛋白，和细胞角蛋白：通过下述骨架标记物评价表征培养细胞。基质细胞与肌成纤维细胞样表型表达的细胞骨架肌成纤维细胞标记物α-SMA和波形蛋白（ 图2）。
- 为了进一步从肌肉细胞，免疫染色结蛋白区分培养基质细胞。执行免疫染色上培养的细胞，板1.5×10 4个细胞在4孔腔室玻片并生长在肌成纤维细胞培养基24小时。间质细胞，肌成纤维细胞样表型将有弱或缺乏结蛋白的表达。基质细胞缺乏上皮标记的泛细胞角蛋白的表达（数据未示出）。
注：文化的评估，包括对细胞骨架标记免疫细胞化学和细胞表面标志物用流式细胞仪评价。免疫细胞化学用作表征的主要方法为前细胞骨架蛋白PRESSION轮廓是独特的成纤维细胞，肌成纤维细胞或肌细胞。流式细胞仪通过评估上皮，内皮，细胞和造血细胞标志物的细胞表面表达建立培养纯度。 CD90是有帮助识别人类基质细胞，因为它是表达对人类成纤维细胞和肌成纤维细胞的辅助方法。 CD90是不是在小鼠基质细胞的表征有帮助，因为它也通过鼠的T细胞表达的。
- 为了进一步从肌肉细胞，免疫染色结蛋白区分培养基质细胞。执行免疫染色上培养的细胞，板1.5×10 4个细胞在4孔腔室玻片并生长在肌成纤维细胞培养基24小时。间质细胞，肌成纤维细胞样表型将有弱或缺乏结蛋白的表达。基质细胞缺乏上皮标记的泛细胞角蛋白的表达（数据未示出）。
- 后的细胞达到60％汇合时，冲洗载玻片用磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，用甲醇固定。在-20℃下孵育细胞在甲醇中10分钟，然后在PBS中储存于4℃直至使用。
- 按照标准的染色协议。
- 简单地说，前施加第一抗体，阻断固定的细胞用PBS中的5％goatserum。稀释在5％山羊血清初级和次级抗体以及。
- 为了检测α-SMA和波形，请使用下列抗体和浓度：小鼠mAb到α-SMA，在1：250的稀释和兔多克隆到波形蛋白在1：500的稀释。
- 在室温下，初级抗体孵育过夜，在4℃，冲洗3次，用PBS中并在一稀释的1添加二级抗体罗丹明缀合的山羊抗小鼠：200和的Cy2偶联的山羊抗兔的稀释度为1：1000 1小时在室温下。
- 对细胞核用4'，6-二脒基2Phenylindole吲哚（DAPI）以1μg/ ml的1分钟的浓度，并然后用PBS洗涤。分析幻灯片倒置显微镜。
- 通过检查鼠和人食管癌细胞的造血（CD45）和内皮（CD31）的细胞表面通过流式细胞术标记（ 图3）建立培养物的纯度。由基质细胞表面标记物CD90的表达进一步表征人类细胞。
注：CD90不能用于鉴定小鼠基质细胞如小鼠T CELLS也表达CD90。- 通过用非酶细胞解离溶液处理分离从培养瓶中培养的小鼠食管基质细胞，在37℃下进行10分钟，用FACS缓冲液两次，计数并用FITC标记的CD45和APC-CD31与相关同种型对照，根据标准的染色程序。
- 收集利用流式细胞仪刀魂细胞分析与软件的FlowJo数据。前染色细胞，优化抗体和滴定使用同种型对照，正常小鼠脾和骨髓细胞的浓度。
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Representative Results
食管基质细胞使用机械和酶消化分离的最初铺板并在6孔板中培养。检查细胞以电镀后数小时内倒置显微镜的演示了一个混合细胞悬浮液松散粘连到板的底部（ 图1A）。在接下来的24小时，纺锤形细胞牢固地粘附到板底观察从混合细胞悬浮液（ 图1B）。这些发芽细胞覆盖的整个面积的5天内良好，可以成功地传代，保持形态的拍摄至少15代。纺锤形贴壁细胞以低密度（ 图1C），并且当接近汇合（ 图1D）中观察到。
在玻片增长食管间质细胞原代培养的免疫证明了肌成纤维细胞骨架指标α-SMA和波形丰富的表达（ 图URE 2），结蛋白弱表达，细胞角蛋白缺失。
食管肌成纤维细胞原代培养可以通过检查造血细胞和内皮细胞表面标志物进行进一步检查细胞纯度。前向和侧向散射，是为原代鼠食管基质细胞随后门控和活细胞的细胞表面蛋白（ 图3A）的分析。原代鼠食管基质细胞缺乏造血CD45（ 图3B）和内皮细胞CD31（ 图3C）的细胞表面标志物的表达。
图1：小鼠基质细胞分离和电镀后数小时内倒置显微镜的鼠食管基质细胞的不同传代原代培养检验表明混合CE集群LLS松散粘连细胞与板底部（A）中。 24-48小时培养后，纺锤状细胞萌芽从现在粘附簇（B）中 。贴壁细胞呈梭形形态仍然存在，在低（C）和高（D）的密度。 请点击此处查看该图的放大版本。 （从振动筛等 6许可使用数字）。
图2：在原代培养物生长的鼠食管基质细胞表达成肌纤维细胞标记物α-SMA和波形蛋白初级鼠食管基质细胞在中等（交流）上生长室载玻片和免疫染色α-SMA和波形蛋白和低密度（DF）。 Esophagea升基质细胞大量表达α-SMA（A，D）和波形（B，E）。小鼠食管间质细胞共表达这些肌成纤维细胞标志物（C，F）。 （从振动筛等 6许可使用数字）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：鼠食管肌纤维母细胞的原代培养物缺乏造血细胞和内皮细胞表面标记的鼠食管基质细胞的点图，展示了FSC和细胞这一人群的SSC的特性。共有事件的32.4％进行门控（A）中 ，造血的表达（CD45）和内皮（CD31）的细胞表面标记是由一个单一的I评价根据标准染色方案mmunostain。非特异性染色被用于使用同种型对照各抗体来确定。鼠食管基质细胞的原代培养物不表达CD45（B）或CD31（C）。 FSC：前向散射; SSC：方散。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
该技术主要培养一代大体相似使用具有适于组织大小切碎和消化时间鼠或人体组织时。我们用小鼠组织的经验表明，用上述的方法始终导致成功建立原代培养物的。在协议中的关键步骤包括手术设备，消毒和下面的组织培养标准的无菌技术。小鼠的年龄也是一个关键步骤。 8 - 19日龄新生儿持续取得成功的主要文化。基质细胞从年轻的新生儿隔离尚未尚未成功生成。试图从老年小鼠建立肌成纤维细胞样基质细胞正在进行中。其他人报告成功代食管成纤维细胞的四到八个周龄小鼠8。
不同于建立结肠肌成纤维细胞，污染是在电子商务的罕见问题当抗生素被包含在培养基中的小鼠成肌纤维细胞的培养物的stablishment。因为培养物从新生儿小鼠建立，一个限制因素是小尺寸的组织和固有肌层剥离是不容易可行的。另一方面，在人的食道，固有肌层容易区分，并从粘膜肌层分离。酶消化和培养条件不利于免疫或上皮细胞的生长，从小鼠或人食道建立培养物。人体切除标本保持组织经受处理的较大量化也许是因为易受细菌污染，尽管在培养基中使用抗生素，。下列标准组织培养技术和严格消毒的手术器械减轻污染的风险。
原代培养的优点是，这些细胞是相对未经处理，并且可以更好地反映第E在体内环境相比永生化细胞系9。
所描述的技术是直接的，并且大多数实验室的装置内。原代培养物对细胞系的缺点在于超越通道15细胞易受基因变异和最终衰老。此外，来自小鼠或人获得的原代培养物具有固有的可变性的细胞系没有观察到。替代方法为食管成纤维隔离已经描述10。这些细胞在培养中的表征然而一直局限于波形蛋白表达或已证实细胞表达波形蛋白，并且仅微弱α-SMA阳性10。
一旦此技术已经被掌握，原代培养物可从患病的人食道切除标本来建立。这些方法提供调查隔离的能力和文化间质细胞从不同的临床一第二实验条件下，使组间的比较。培养的成肌纤维细胞样基质细胞还可以潜在地适于用在器官或共培养模型使用与其他细胞如嗜酸性粒细胞3或在器官培养8。
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Disclosures
这项工作是在肠道生理健康（AS）和赖特基金会试点奖（AS）支持NIH / NCI K08CA153036-01A1（AS），生AGA，通用磨坊贝尔研究所和营养学研究学者奖。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue culture reagents | |||
| HBSS | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Dispase | GIBCO, Invitrogen | 17105-041 | |
| Collagenase XI | Sigma-Aldrich | C9407 | |
| DMEM | GIBCO, Invitrogen | 11965-092 | |
| Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F42442 | |
| Transferrin | Roche | 10-652-202-001 | |
| trypsin/EDTA | Corning | 25-052-Cl | |
| Epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Reagents for immunostaining | |||
| Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Mouse mAB to α-SMA | abcam | ab7817 | |
| Rabbit pAB to vimentin | abcam | ab45939 | |
| Cy2 conjugated Goat anti Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 111-225-144 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | |
| CD31 conjugated to eFluor 450 | eBioscience | 48-0319-41 | |
| CD90 conjugated to APC | eBioscience | 17-0909-41 | |
| Annexin V and 7AAD | BD Pharmigen | 559763 | |
| Mouse Fc block for CD16/CD32 | BD Pharmigen | 2136662 | |
| Equipment | |||
| 5 ml tube | Eppendorf | 30108310 | |
| Inverted microscope | Motic | AE31 | |
| Biosafety cabinet and incubators | Nuaire | http://www.nuaire.com/products/ | |
| 4-well chamber slides | Thermo Scientific | 177437 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Olympus Vacuum-Driven Filter System | Genesee Scientific | 25-227 | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse TE300 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| T25 Flasks | TRP | 90026 | |
| T75 Flasks | Corning | 43064 | |
| Dissection scissors | |||
| Dissection forceps | |||
| Single tipped Q-Tips | Kendall | 540500 | |
| Software | |||
| Metamorph software (Molecular Devices) | Molecular Devices | ||
| FACSCAlibur | BD Bioscience | ||
| FACSVerse | BD Bioscience | ||
References
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