Abstract
Muizen en menselijke slokdarm myofibroblasten worden gegenereerd via enzymatische afbraak. Neonaat (8-12 dagen oud) murine slokdarm wordt geoogst, fijngemaakt, gewassen en onderworpen aan enzymatische digestie met collagenase en dispase 25 min. Menselijke oesofageale resectiepreparaten ontdaan van muscularis propria en adventitia en de resterende mucosa wordt gehakt, en onderworpen aan enzymatische digestie met collagenase en dispase tot 6 uur. Gekweekte cellen brengen α-SMA en vimentine en uitdrukkelijke desmin zwak of helemaal niet. Kweekomstandigheden zijn niet bevorderlijk voor de groei van epitheliale, hematopoietische of endotheelcellen. Culture zuiverheid wordt verder bevestigd door flowcytometrische evaluatie celoppervlak marker expressie van potentieel verontreinigende hematopoietische en endotheelcellen. De beschreven techniek is eenvoudig en resulteert in consistente generatie niet-hematopoieitc, niet-endotheliale stromale cellen. Beperkingen van deze techniek zijn inherent aan het gebruik vanprimaire culturen in de moleculaire biologie studies, dat wil zeggen, de onvermijdelijke variatie aangetroffen onder in verschillende muizen of mensen gevestigde culturen. Primaire kweken zijn echter een meer representatieve afspiegeling van de in vivo toestand tegenover cellijnen. Deze werkwijzen geven ook onderzoekers de mogelijkheid het isoleren en kweken stromale cellen van verschillende klinische en experimentele omstandigheden, zodat vergelijkingen tussen groepen. Kenmerk slokdarm stromale cellen kunnen ook worden gebruikt in functionele studies die epitheliale-stromale interacties in slokdarm aandoeningen.
Introduction
Epitheliale-stromale interacties zijn betrokken bij de regulatie van een verscheidenheid van het maagdarmkanaal functies, waaronder mucosale regeneratie, reparatie, fibrose, en carcinogenese 1,2. Deze interacties zijn best bestudeerd in de dunne en dikke darm en kunnen eveneens een rol spelen bij slokdarmkanker mucosale stoornissen 3 spelen. Een subpopulatie van darm en colon stromale cellen genoemd myofibroblasten is aangetoond deelnemen bemiddelen weefselschade, inflammatie en reparatie 4,5. In de distale maagdarmkanaal, worden deze spoelvormige cellen gelegen naast de basaalmembraan op het grensvlak tussen epitheel en lamina propria en gedefinieerd als α-SMA en vimentine positieve pan-cytokeratine negatief en zwak positief of negatief desmine 5.
De slokdarm stroma is niet rigoureus gekarakteriseerd op cellulair of moleculair niveau. Ons werk in het muizen slokdarm heeft Demonstrated α-SMA en vimentine cellen in de slokdarm stroma, soms onderliggend aan het plaveiselepitheel 6. Epitheliale-stromale interacties zijn betrokken bij oesofageale slijmvlies aandoeningen zoals gastro-oesofageale gemedieerde schade 6 en eosinofiele oesofagitis 3. Fibrotische stricturen ook een bekende complicatie van oesofageale schade en stromale cellen zijn betrokken bij de pathogenese van gastro fibrose. Isolatie van deze cellen zal helpen bereiken van de nodige studies om gestoorde signaalwegen te onderzoeken.
Deze inzending geeft de technieken die nodig zijn om primaire culturen van α-SMA positief, vimentine positieve myofibroblasten zodanig dat de bestaande lacunes in de kennis over signaalwegen bemiddelen deze interacties kunnen worden gericht vast te stellen. De beschreven techniek werd met succes gebruikt door de auteurs primaire murine colon myofibroblasten 7 en furthe vaststellenr aangepast voor oprichting van muizen 6 en menselijke myofibroblast-achtige oesofageale stromale cellen.
Hierin beschrijven we condities die nodig is om en karakteriseren vastgesteld uit muizen of menselijke slokdarm voorafgaand aan gebruik in toekomstige functionele studies culturen. Culturen kunnen worden gekweekt en gebruikt voor maximaal 15 passages. Isolatie en oprichting van primaire culturen via de methoden die hieronder beschreven genereert stromale cellen met een myofibroblast fenotype; α-SMA, vimentine positief, en zwak positief of negatief voor desmine, en cytokeratine negatief. Dit fenotype verschilt van het fenotype van de slokdarm fibroblast dat overwegend vimentine positief, α-SMA negatief 3 of α-SMA positieve, vimentine negatief fenotype van de muscularis mucosae 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het protocol voor dierproeven, de motivering en doelstellingen van het onderzoek uit te voeren, werden voorgelegd aan en goedgekeurd door de Universiteit van Zuid-Californië Institutional Animal Care en gebruik Comite.
Het protocol voor de oprichting van primaire culturen van de-geïdentificeerde menselijke specimens slokdarmresectie werd goedgekeurd door de University of Southern California Institutional Review Board.
1. Vraag Muis of Human slokdarm
- Verkrijgen Mouse Slokdarm:
- Euthanaseren de 8-12 dagen oude muis met 2% isofluraan inhalatie overdosis gevolgd door cervicale dislocatie.
- Speld het dier naar beneden met de buik naar boven en nat het ventrale oppervlak met 70% ethanol. Met een pincet, pak en til de huid juist voor de urethra opening met een pincet. Gebruik standaard rechtdoor chirurgische schaar langs de ventrale middellijn van de urethrale opening naar de kin te snijden. Wees voorzichtig om alleen de huid snijden. </ Li>
- Een insnijding van de urethrale opening beneden de knie aan beide zijden van het dier, die een omgekeerde "Y". Maak een insnijding aan beide zijden van het dier langs de ribbenkast.
- Trek voorzichtig de huid aan beide zijden af van de onderliggende buikvlies en de ribbenkast, en lag aan de zijkanten. Onderzoek de ribbenkast bovenop de borstholte en het peritoneum bovenop de buikholte.
- Til het buikvlies met een pincet en dwars door het aan het membraan en de ribbenkast, wijzend schaar omhoog om schade aan de abdominale inhoud te verhinderen. Til de linker kwab van de lever, de onderliggende maag, de slokdarm, maag overgang en het abdominale gedeelte van de slokdarm bloot.
- Gebruik geautoclaveerd chirurgische schaar door het borstbeen en ribben langs de middellijn naar de cervicale gordel te snijden. Point schaar omhoog om beschadiging van de thoracale inhoud te voorkomen. De inhoud van de volledig blootborstholte door aan de ribben aan de zijkanten.
- Verwijder voorzichtig het hart en de beide lobben van de longen. Overtollige bloed te absorberen met Q-tips. De thoracale slokdarm is een smalle flexibele buis liggend posterieur van de luchtpijp en de voorste naar de thoracale wervel.
OPMERKING: De slokdarm kan moeilijk te identificeren in muizen pasgeborenen zijn. Lokalisatie van de slokdarm-maag overgang maakt slokdarmkanker identificatie eenvoudig. - Volg zorgvuldig de slokdarm omhoog uit de maag, het ontleden van de omringende bloedvaten, vet en mesenterium helemaal tot aan de slokdarm oorsprong in de cervicale holte. Chirurgische schaar met stompe punt werken het beste voor dit doel.
- Resect de gehele lengte van de slokdarm en plaats in Hanks 'gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) voor verdere verwerking hierna beschreven. Verwijderen van een gedeelte van de maag ter oriëntatie indien gewenst.
LET OP: Door kleine weefsel grootte, scheiding van muscularis propria van de gespierdemucosa is niet haalbaar in muriene neonaat slokdarm en de gehele slokdarm is een bewerking hieronder beschreven.
- Verkrijgen Human Slokdarm:
- Was slokdarm resectiepreparaten (meestal 5 cm of minder) met HBSS en verwijder alle aangesloten bindweefsel, vet, of vaatstelsel.
- Resectie van een deel van het monster en plaats in formaline voor latere histologische onderzoek indien gewenst.
- Scheid de resterende slijmvlies van onderliggende muscularis propria door scherpe dissectie.
- Snijd slijmvlies in sub centimeter fragmenten en onderworpen aan de hieronder beschreven protocol.
OPMERKING: Menselijke slokdarm resecties in PBS bewaard worden 6 uur voorafgaand aan de verwerking hieronder beschreven. Bron van slokdarmresectie exemplaren zal preparaatgrootte dicteren en zal het laboratorium afhankelijk zijn.
2. Isoleren van muis en mens Oesofageale stromale cellen
- Isoleer oesofageale stromale cellen from murine en menselijke weefsel door een combinatie van mechanische en enzymatische digestie.
- Mechanisch verteren door hakken het weefsel met een schaar en meerdere wasbeurten met HBSS. Enzymatisch verteren door incuberen van het weefsel met 300 U / ml collagenase XI en 0,1 mg / ml dispase 25 min (murine weefsel) of tot 6 uur (menselijk weefsel). Ervoor te zorgen dat instrumenten gebruikt voor hakken zijn geautoclaveerd en gesteriliseerd.
OPMERKING: Collagenasen zijn enzymen die collageen, een extracellulaire matrix eiwit dat verantwoordelijk is voor het houden van dierlijk weefsel bij elkaar. Collagenase XI heeft hoge collagenase activiteit en heeft succes in dit isolement protocol gezien. Dispase is een bacterieel enzym met proteolytische milde dissociatie activiteit die celmembraan activiteit behoudt en wordt gebruikt in combinatie met collagenase als een secundair enzym. - Plaats mucosale fragmenten respectievelijk verkregen uit muis of menselijk weefsel in 1,7 ml micro-centrifuge of 5 ml buizen, met HBSS. Mince weefsel verderin 2-3 mm stukken met een schaar met een open uiteinde breedte die past in de respectieve buizen. Voldoende tijd om voor slokdarm mucosale fragmenten sedimenteren op de bodem van de buis.
- Langzaam decanteren HBSS, dat evenwel niet tot het weefsel per ongeluk weggooien. Vervang met verse HBSS volgende door voorzichtig schudden. Als alternatief, verwijder HBSS met een pipet 1 ml.
- Was tissue op deze wijze totaal 8 keer onder zacht schudden tussen wasbeurten waardoor tijd slokdarm fragmenten sediment tussen elke wassing.
OPMERKING: Human weefsel zal meer nodig hakken die pasgeborene muis weefsel.
- Mechanisch verteren door hakken het weefsel met een schaar en meerdere wasbeurten met HBSS. Enzymatisch verteren door incuberen van het weefsel met 300 U / ml collagenase XI en 0,1 mg / ml dispase 25 min (murine weefsel) of tot 6 uur (menselijk weefsel). Ervoor te zorgen dat instrumenten gebruikt voor hakken zijn geautoclaveerd en gesteriliseerd.
- Incubeer muizen weefsel met 300 U / ml collagenase XI en 0,1 mg / ml dispase gedurende 25 min op een schommelende schudder ingesteld op een laag toerental bij kamertemperatuur.
- Incubeer lichaamsmateriaal met 300 U / ml collagenase XI en 0,1 mg / ml dispase tot 6 uur, op een schommelende schudder ingesteld op een laag toerental bij kamertemperatuur.
NB: De beschikbaarheid van menselijke esophagus is variabel. Menselijke oesofageale slijmvlies geïncubeerd met enzymen voor 6 uur leidt tot succesvolle vorming van primaire kweken.
- Incubeer lichaamsmateriaal met 300 U / ml collagenase XI en 0,1 mg / ml dispase tot 6 uur, op een schommelende schudder ingesteld op een laag toerental bij kamertemperatuur.
- Na enzymatische digestie, gehakt weefsel verder met een schaar en centrifugeer bij 200 xg gedurende 10 min.
- Verwijder het supernatant. Breng de pellet bestaat uit een gemengde celsuspensie aan een 5 ml buisje en was 5 keer in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) gesupplementeerd met 2% sorbitol tot levensvatbare cellen en afval te elimineren.
- Zaad cellen in 6-well platen en cultuur in DMEM met 10% foetaal runderserum (FBS), 10 mg / ml insuline, 10 ug / ml transferrine, 10 ug / ml gentamicine, en 2 ng / ml epidermale groeifactor (EGF) . Vacuum alle componenten behalve EGF die kunnen worden toegevoegd na filtratie filter (0,22 pm). Verdeel cellen verkregen van humane monsters resectie met meerdere 6-well platen, afhankelijk van de grootte resectie.
- Zodra putten 80% confluent, passage hechtende cellen T25 kolven onsing 0.05% trypsine / ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA). Neutraliseren met media en draaien bij 400 x g.
- Voor 6 putjes doorgang naar een T25 kolf passage cellen bij een 1: 1 verhouding. Confluente T25 kolven worden gepasseerd op een 1: 2 of 1: 3 verhouding. Om passage uit een T25 kolf een T75 kolf gebruikt een 1: 1 verhouding. Verandering media om de 2-3 dagen, ongeacht het vaartuig.
- Kweek cellen bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO2 incubator en cultuur in myofibroblast media hierboven beschreven.
OPMERKING: Epitheelcellen niet overleven onder deze cultuur of passage voorwaarden. Cellen voor karakterisering en de hierna beschreven studies tussen doorgangen 5 en 15. - Cryo-behouden cellen in vloeibare N2 door 10% dimethylsulfoxide het myofibroblast media.
3. karakteriseren van muis en mens Oesofageale stromale cellen
- Onderzoek de morfologie van cellen met een omgekeerde microscoop. Let op de spindel-vormigemorfologie van hechtende cellen (Figuur 1).
- Karakteriseren gekweekte cellen door evaluatie van de volgende cytoskelet markers: α-SMA, vimentine, desmine, en cytokeratine. Stromale cellen met een myofibroblast fenotype expressie cytoskelet myofibroblast markers α-SMA en vimentine (figuur 2).
- Om verder te onderscheiden gekweekte stromale cellen van spiercellen, immunostain voor desmine. Om immunokleuren op gekweekte cellen uit te voeren, plaat 1,5 x 10 4 cellen in 4-goed kamer dia's en groeien in myofibroblast media voor 24 uur. Stromale cellen met een myofibroblast-achtige fenotype zal zwak of afwezig desmine expressie hebben. Stromale cellen missen expressie van de epitheliale marker pan-cytokeratine (gegevens niet getoond).
OPMERKING: Evaluatie van culturen omvat de evaluatie van het cytoskelet markers door immuuncytochemie en celoppervlaktemerkers door flowcytometrie. Immunocytochemie wordt gebruikt als de primaire methode van karakterisering als de expression profiel van cytoskeleteiwitten is uniek voor de fibroblast, myofibro- of spiercel. Flowcytometrie wordt cultuur zuiverheid evalueren celoppervlak van epitheliale, endotheliale en hemopoëtische cellen markers. CD90 is nuttig als een aanvullende werkwijze voor het identificeren humane stromale cellen zoals gezegd zowel humane fibroblasten en myofibroblasten. CD90 is nuttig in karakterisering van muizen bindweefselcellen zoals Ook van muizen T-cellen.
- Om verder te onderscheiden gekweekte stromale cellen van spiercellen, immunostain voor desmine. Om immunokleuren op gekweekte cellen uit te voeren, plaat 1,5 x 10 4 cellen in 4-goed kamer dia's en groeien in myofibroblast media voor 24 uur. Stromale cellen met een myofibroblast-achtige fenotype zal zwak of afwezig desmine expressie hebben. Stromale cellen missen expressie van de epitheliale marker pan-cytokeratine (gegevens niet getoond).
- Nadat de cellen 60% confluentie bereiken, spoel dia's met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en bevestig met methanol. Incubeer cellen in methanol gedurende 10 minuten bij -20 ° C en bewaar in PBS bij 4 ° C tot gebruik.
- Volg standaard immunostaining protocol.
- Kort vooraleer de primaire antilichaam, blokkeren de gefixeerde cellen met 5% goatserum in PBS. Verdunnen primaire en secundaire antilichamen in 5% geitserum ook.
- Voor detectie van α-SMA en vimentine, gebruik maken van dena antilichamen en concentraties: muis mAb α-SMA bij 1: 250 verdunning en konijn pAB te vimentine 1: 500 verdunning.
- Incubeer met primaire antilichaam bij kamertemperatuur overnacht bij 4 ° C, spoelen 3 maal met PBS en voeg secundaire antilichamen rhodamine geconjugeerd geit anti muis bij een verdunning van 1: 200 en Cy2 geconjugeerd geit anti konijn bij een verdunning van 1: 1000 1 uur bij kamertemperatuur.
- Tegenkleuring kernen met 4 ', 6-diamidino-2Phenylindole (DAPI) bij een concentratie van 1 ug / ml gedurende 1 min en vervolgens wassen met PBS. Analyseer dia met een omgekeerde microscoop.
- -zuiverheid Culturen door onderzoek van muizen en menselijke slokdarm cellen voor hematopoïetische (CD45) en endotheliale (CD31) celoppervlaktemarkers door flow cytometrie (figuur 3). Karakteriseren menselijke cellen verder door expressie van de stromale celoppervlak marker CD90.
OPMERKING: CD90 kan niet worden gebruikt om murine stromale cellen zoals muizen T cel identificerenls ook uiten CD90.- Maak gekweekte muizen oesofageale stromacellen uit de kolven door behandeling met niet-enzymatische cel dissociatie oplossing bij 37 ° C gedurende 10 min, gewassen met FACS-buffer tweemaal geteld en gekleurd met FITC-CD45 en CD31-APC relevante isotype controles volgens standaard kleuringen.
- Verzamel cellen met FACS Calibur en gegevens FlowJo software geanalyseerd. Vóór gekleurde cellen, optimaliseren antilichamen en titreer door gebruikmaking isotype controles normale muis milt en beenmerg cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Esophageal stromale cellen geïsoleerd met behulp van mechanische en enzymatische digestie worden eerst uitgeplaat en gekweekt in platen met 6 putjes. Onderzoek van cellen met een omgekeerde microscoop binnen uren na plating toont een gemengde celsuspensie losjes hechtend aan de onderste plaat (Figuur 1A). In de volgende 24 uur, worden spoelvormige cellen stevig hechtende de plaatbodem waargenomen schieten uit het gemengde celsuspensie (Figuur 1B) .Deze kiemen cellen het gehele gebied van een goed binnen 5 dagen en met succes kan worden gepasseerd, behoud morfologie gedurende tenminste 15 passages. Spoelvormige hechtende cellen worden waargenomen bij lage dichtheid (figuur 1C) en bij bijna samenvloeiende (figuur 1D).
Immunokleuring van primaire culturen van slokdarmkanker stromale cellen gekweekt in de kamer dia toont overvloedige uiting van myofibro- cytoskelet markers α-SMA en vimentine (Figure 2), zwakke expressie van desmine, en afwezig cytokeratine.
Primaire culturen van slokdarmkanker myofibroblasten kan verder voor mobiele zuiverheid worden onderzocht door onderzoek van hematopoietische en endotheliale celoppervlaktemerkers. Voorwaartse en zijwaartse verstrooiing worden vastgesteld voor primaire murine oesofageale stromale cellen gevolgd door gating en analyse van levende cellen op celoppervlak-eiwitten (Figuur 3A). Primaire murine oesofageale stromale cellen missen expressie van hematopoiëtische CD45 (Figuur 3B) en endotheelcellen CD31 (Figuur 3C) celoppervlak markers.
Figuur 1:. Primaire kweken van murine oesofageale stromale cellen bij verschillende passages Onderzoek van muizen stromale cellen met een omgekeerde microscoop binnen uren na isolatie en plateren toont een cluster van gemengde cells losjes hechtende cellen aan de plaat bodem (A). Na 24-48 uur in kweek, spoelvormige cellen ontspruiten uit de nu hechtende cluster (B). Spoelvormige morfologie van hechtende cellen blijft bij lage (C) en hoge (D) dichtheid. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. (cijfers die worden gebruikt met toestemming van Shaker et al. 6).
Figuur 2: Muizen-oesofageale stromale cellen gekweekt in primaire cultuur te uiten myofibro- markers α-SMA en vimentine Primaire muizen oesofageale stromale cellen werden gekweekt op kamer dia's en immunostained voor α-SMA en vimentine bij matige (AC) en lage dichtheid (DF).. Esophageal stromale cellen rijkelijk uiten α-SMA (A, D) en vimentine (B, E). Muizen oesofageale stromale cellen co-express deze myofibro- markers (C, F). (Cijfers die worden gebruikt met toestemming van Shaker et al. 6). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Primaire culturen van muizen slokdarm myofibroblasten cellen missen hematopoietische en endotheliale celoppervlaktemerkers De dot plot van muizen oesofageale stromale cellen, toont de FSC en SSC kenmerken van deze populatie van cellen.. Een totaal van 32,4% van het evenement gated (A) Expressie van hematopoietische (CD45) en endotheliale (CD31) celoppervlak merkers werden geëvalueerd door een immunostain volgens standaard kleuringsprotocollen. Niet-specifieke kleuring werd voor elk antilichaam met isotype controles. Primaire kweken van murine slokdarm stromale cellen niet tot expressie CD45 (B) of CD31 (C). FSC: voorwaartse verstrooiing; SSC: side scatter. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De technieken voor het primaire cultuur generatie zijn over het algemeen gelijk bij het gebruik van muizen of menselijk weefsel met hakken en spijsvertering tijden aangepast voor weefsel grootte. Onze ervaring met murine weefsel suggereert dat volgens de hierboven beschreven werkwijzen consequent leiden succes een primaire kweken. Kritische stappen in het protocol zijn onder sterilisatie van chirurgische apparatuur en volgende standaard steriele technieken van weefselkweek. De leeftijd van de muizen ook een kritische stap. 8-12 dagen oude neonaten consequent opbrengst succesvolle primaire culturen. Stromale cellen geïsoleerd van jongere pasgeborenen zijn niet niet met succes gegenereerd. Pogingen om myofibroblast-achtige stromale cellen vestigen van oudere muizen zijn aan de gang. Anderen hebben gemeld succesvolle generatie van de slokdarm fibroblasten 4-8 weken oude muizen 8.
In tegenstelling tot de oprichting van het colon myofibroblasten, vervuiling is een frequent probleem in ePRICHTING van kweken van murine myofibroblasten wanneer antibiotica in het kweekmedium. Omdat kweken worden vastgesteld van foetus muizen, een beperkende factor is klein weefselgrootte en strippen van muscularis propria niet gemakkelijk haalbaar. Anderzijds, in de menselijke slokdarm, muscularis propria is gemakkelijk te onderscheiden en gescheiden van de muscularis mucosa. De enzymatische spijsvertering en kweekomstandigheden zijn niet bevorderlijk voor de groei van het immuunsysteem of epitheelcellen in gevestigde uit muizen of menselijke slokdarm culturen. Menselijke resectiepreparaten gevoelig voor bacteriële besmetting blijven ondanks het gebruik van antibiotica in het kweekmedium, misschien vanwege de grotere Kwantificeren van weefselverwerking ondergaan. Volgende standaard weefselkweek technieken en rigoureus steriliseren van chirurgische instrumenten vermindert risico op besmetting.
Het voordeel van primaire kweek is dat deze cellen relatief unmanipulated en kan beter rekening the in vivo vergeleken bij geïmmortaliseerde cellijnen 9.
De beschreven techniek is ongecompliceerd en is met de middelen van de meeste laboratoria. Het nadeel van primaire kweken versus cellijnen is dat cellen boven doorgang 15 zijn gevoelig voor genetische mutatie en uiteindelijke senescentie. Daarnaast kunnen primaire kweken verkregen uit muizen of mensen inherente variabiliteit waargenomen in cellijnen. Alternatieve methoden voor slokdarmkanker fibroblast isolatie zijn beschreven 10. Karakterisering van deze cellen in cultuur echter is beperkt tot vimentine expressie of zijn cellen die vimentine uiten en zijn slechts zwak α-SMA positieve 10 aangetoond.
Zodra deze techniek wordt beheerst, kan primaire culturen worden vastgesteld op basis van resectiepreparaten van zieke menselijke slokdarm. Deze methoden geven onderzoekers de mogelijkheid het isoleren en kweken stromale cellen van verschillende klinische eennd experimentele omstandigheden, zodat vergelijkingen tussen groepen. Gekweekte myofibroblast-achtige stromale cellen kunnen mogelijk ook worden aangepast voor gebruik in organotypische of co-kweek modellen met andere cellen zoals eosinofielen 3 of organotypische kweek 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dit werk wordt ondersteund door NIH / NCI K08CA153036-01A1 (AS), AGA-General Mills Bell Institute of Health and Nutrition Research Scholar Award in Gut Fysiologie en Gezondheid (AS) en een Wright Foundation Pilot Award (AS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue culture reagents | |||
| HBSS | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Dispase | GIBCO, Invitrogen | 17105-041 | |
| Collagenase XI | Sigma-Aldrich | C9407 | |
| DMEM | GIBCO, Invitrogen | 11965-092 | |
| Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F42442 | |
| Transferrin | Roche | 10-652-202-001 | |
| trypsin/EDTA | Corning | 25-052-Cl | |
| Epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Reagents for immunostaining | |||
| Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Mouse mAB to α-SMA | abcam | ab7817 | |
| Rabbit pAB to vimentin | abcam | ab45939 | |
| Cy2 conjugated Goat anti Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 111-225-144 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | |
| CD31 conjugated to eFluor 450 | eBioscience | 48-0319-41 | |
| CD90 conjugated to APC | eBioscience | 17-0909-41 | |
| Annexin V and 7AAD | BD Pharmigen | 559763 | |
| Mouse Fc block for CD16/CD32 | BD Pharmigen | 2136662 | |
| Equipment | |||
| 5 ml tube | Eppendorf | 30108310 | |
| Inverted microscope | Motic | AE31 | |
| Biosafety cabinet and incubators | Nuaire | http://www.nuaire.com/products/ | |
| 4-well chamber slides | Thermo Scientific | 177437 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Olympus Vacuum-Driven Filter System | Genesee Scientific | 25-227 | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse TE300 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| T25 Flasks | TRP | 90026 | |
| T75 Flasks | Corning | 43064 | |
| Dissection scissors | |||
| Dissection forceps | |||
| Single tipped Q-Tips | Kendall | 540500 | |
| Software | |||
| Metamorph software (Molecular Devices) | Molecular Devices | ||
| FACSCAlibur | BD Bioscience | ||
| FACSVerse | BD Bioscience | ||
References
- Stappenbeck, T. S., Miyoshi, H. The role of stromal stem cells in tissue regeneration and wound repair. Science. 324 (5935), 1666-1669 (2009).
- Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. Mesenchymal cells of the intestinal lamina propria. Annu Rev Physiol. 73, 213-237 (2011).
- Rieder, F., et al. T-Helper 2 Cytokines, Transforming Growth Factor beta1, and Eosinophil Products Induce Fibrogenesis and Alter Muscle Motility in Patients With Eosinophilic Esophagitis. Gastroenterology. 146 (5), 1266-1277 (2014).
- Powell, D. W., et al. Paracrine cells important in health and disease. The American Journal of Physiology. 277 (1 Pt. 1), C1-9 (1999).
- Powell, D. W., et al. Intestinal subepithelial myofibroblasts. The American Journal of Physiology. 277 (2 Pt. 1), C183-201 (1999).
- Shaker, A., et al. Stromal cells participate in the murine esophageal mucosal injury response. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (7), 662-672 (2013).
- Shaker, A., et al. Epimorphin deletion protects mice from inflammation-induced colon carcinogenesis and alters stem cell niche myofibroblast secretion. The Journal of Clinical Investigation. 120 (6), 2081-2093 (2010).
- Kalabis, J., et al. Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture. Nature Protocols. 7 (2), 235-246 (2012).
- Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).
- Rieder, F., et al. Gastroesophageal reflux disease-associated esophagitis induces endogenous cytokine production leading to motor abnormalities. Gastroenterology. 132 (1), 154-165 (2007).
