Abstract
Murine und menschliche Speiseröhre Myofibroblasten werden über enzymatische Verdauung erzeugt. Neugeborene (8-12 Tage alt) murine Speiseröhre wird geerntet, zerkleinert, gewaschen und bis zur enzymatischen Verdau mit Kollagenase und Dispase für 25 min unterzogen. Menschliche Speiseröhre Resektionsproben aus Muscularis propria und Adventitia befreit und der verbleibende Schleimhaut zerkleinert und einem enzymatischen Verdau mit Kollagenase und Dispase für 6 h unterzogen. Kultivierte Zellen exprimieren α-SMA und Vimentin und Desmin ausdrückliche schwach oder gar nicht. Die Kulturbedingungen sind nicht förderlich für das Wachstum von Epithelzellen, hämatopoietische oder Endothelzellen. Kultur Reinheit wird durch durchflusszytometrische Beurteilung der Zelloberflächenmarker Expression potentieller Gefährdungs hämatopoetischen und Endothelzellen bestätigt. Das beschriebene Verfahren ist einfach und führt zu einer konsistenten Erzeugung nicht hematopoieitc nicht endothelial Stromazellen. Einschränkungen dieser Technik sind inhärent auf die Verwendung vonPrimärkulturen in der Molekularbiologie Studien, dh die unvermeidlichen Schwankungen zwischen den Kulturen in den verschiedenen Mäusen oder Menschen fest gestoßen. Primäre Kulturen sind jedoch ein repräsentativer Reflexion des in vivo-Zustand im Vergleich zu Zelllinien. Diese Verfahren stellen auch Forscher die Fähigkeit zur Isolierung und Kultur Stromazellen aus verschiedenen klinischen und experimentellen Bedingungen, so dass Vergleiche zwischen den Gruppen. Dadurch gekennzeichnet Speiseröhren Stromazellen können auch in funktionalen Studien, die epithelial-stromale Wechselwirkungen in Erkrankungen der Speiseröhre verwendet werden.
Introduction
Epithelial-stromale Wechselwirkungen an der Regulation einer Vielzahl von Gastrointestinaltrakt Funktionen einschließlich Schleimhautregeneration, Reparatur, Fibrose und Karzinogenese 1,2 beteiligt. Diese Wechselwirkungen sind am besten in den Dünndarm und Dickdarm untersucht und kann in ähnlicher Weise eine Rolle bei der Schleimhaut der Speiseröhre Erkrankungen 3. Eine Subpopulation von Darm und Kolon Stromazellen bezeichnet Myofibroblasten wurde gezeigt, dass bei der Vermittlung der Gewebeschädigung, Entzündung teil und Reparatur 4,5. Im distalen Gastrointestinaltrakt werden diese spindelförmige Zellen angrenzend an die Basalmembran an der Grenzfläche zwischen Epithel und Lamina propria und werden als α-SMA und Vimentin positiv definiert, pan-Cytokeratin negativ und schwach positive oder Desmin negativ 5.
Die Speiseröhre Stroma wurde nicht konsequent auf zellulärer oder molekularer Ebene charakterisiert. Unsere Arbeit im murinen Speiseröhre demonstrated α-SMA und Vimentin-Zellen in der Speiseröhre Stroma, gelegentlich darunter liegenden zu dem Plattenepithel 6. Epithelial-Stroma-Wechselwirkungen in der Schleimhaut der Speiseröhre Erkrankungen wie Magen- und Speiseröhren vermittelten Verletzung 6 und eosinophile Ösophagitis 3 in Verbindung gebracht. Fibrotischen Strikturen auch eine bekannte Komplikation der Schädigung der Speiseröhre und Stromazellen in der Pathogenese von gastrointestinalen Fibrose in Verbindung gebracht. Isolation dieser Zellen wird dazu beitragen, zu tun, die notwendigen Studien zur gestörten Signalwege zu untersuchen.
Diese Vorlage enthält die erforderlichen Primärkulturen von α-SMA positiv, Vimentin positiven Myofibroblasten, dass bestehende Wissenslücken in Bezug auf Signalwege vermitteln, diese Interaktionen angesprochen werden kann etablieren Techniken. Die beschriebene Technik wurde erfolgreich von den Autoren verwendet wird, um primäre murine Colon Myofibroblasten 7 und furthe etablierenr für die Einrichtung von murinen 6 und Menschen Myofibroblasten-ähnlichen Speiseröhren Stromazellen angepasst.
Wir beschreiben hier Bedingungen benötigt, um festzustellen und zu charakterisieren diese Kulturen von Maus oder Mensch Ösophagus vor in Zukunft funktionelle Studien verwenden etabliert. Kulturen angebaut und für bis zu 15 Passagen genutzt werden. Isolation und Etablierung von Primärkulturen über die Methoden unten beschrieben erzeugt Stromazellen mit Myofibroblasten Phänotyp; α-SMA, Vimentin positiv und schwach positiv oder negativ für Desmin und Cytokeratin negativ. Dieser Phänotyp unterscheidet sich vom Phänotyp des Ösophagus Fibroblasten, die überwiegend Vimentin ist positiv, α-SMA negativen 3 oder der α-SMA positiv, Vimentin-negativen Phänotyp des Muscularis mucosae 6.
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Protocol
Das Protokoll zu Tierversuchen, die Grundlagen und Ziele der Forschung durchzuführen, von der University of Southern California Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss eingereicht und genehmigt wurden.
Das Protokoll für die Einrichtung von Primärkulturen von de-identifizierte menschliche Speiseröhre Proben wurde von der University of Southern California Institutional Review Board genehmigt.
1. Besorgen Sie Maus oder Mensch Ösophagus
- Erhalten Maus Ösophagus:
- Euthanize die 8-12 Tage alten Maus mit 2% Isofluran Inhalationsdosis durch Genickbruch folgte.
- Pin das Tier sich mit Bauch nach oben und benetzen die Bauchseite mit 70% Ethanol. Mit einer Pinzette greifen und heben Sie die Haut anterior der Harnröhrenöffnung mit einer Pinzette. Verwenden Sie gerade Standard-OP-Schere entlang der ventralen Mittellinie von der Harnröhrenöffnung bis zum Kinn geschnitten. Achten Sie darauf, nur die Haut geschnitten. </ Li>
- Einen Einschnitt von der Harnröhrenöffnung nach unten auf das Knie auf beiden Seiten des Tieres, wodurch ein umgekehrtes "Y". Eine weitere Einschnitt auf beiden Seiten des Tieres entlang der Rippen.
- Die Haut sorgfältig schälen auf beiden Seiten, aus der zugrunde liegenden Bauchfell und den Brustkorb und legte sich an den Seiten. Untersuchen der Brustkorb über der Brusthöhle und das Peritoneum über der Bauchhöhle.
- Heben Sie das Bauchfell mit einer Pinzette und durchschneiden bis zum Zwerchfell und Brustkorb und zeigte Schere nach oben, um Schäden an Bauch Inhalte zu verhindern. Gently heben Sie den linken Leberlappen, legen das darunterliegende Magen, der Speiseröhre und Magen-Kreuzung und die Bauch Teil der Speiseröhre.
- Verwenden autoklaviert chirurgische Scheren durch das Brustbein und Brustkorb entlang der Mittellinie bis zu den Hals Gürtel geschnitten. Punkt Schere nach oben, um eine Beschädigung der thorakalen Inhalte zu verhindern. Voll den Inhalt des ExposesBrusthöhle durch Ziehen des Brustkorbs zu den Seiten.
- Das Herz und die beiden Lungenlappen vorsichtig entfernen. Absorbieren überschüssiges Blut mit Q-Tips. Die Brust-Ösophagus ist ein schmaler, flexibler Schlauch liegen hinter der Luftröhre und anterior der Brustwirbel.
HINWEIS: Die Speiseröhre kann schwierig sein, in murinen Neugeborenen identifizieren. Lokalisierung des Ösophagus und Magen-Kreuzung macht Speiseröhren Identifikation unkompliziert. - Befolgen Sie sorgfältig die Speiseröhre aus dem Magen, sezieren die umliegende Gefäßsystem, Fett und Gekröse den ganzen Weg bis zu der Speiseröhre Ursprung im Halsraum. Chirurgische Schere mit stumpfer Spitze am besten für diesen Zweck.
- Resezieren die gesamte Länge der Speiseröhre und in Hanks 'ausgeglichener Salzlösung (HBSS) zur weiteren Verarbeitung weiter unten beschrieben. Entfernen Sie einen Teil des Magens zur Orientierung, wenn gewünscht.
HINWEIS: Aufgrund der kleinen Gewebegröße, die Trennung der Muscularis propria von der Muskelist Schleimhaut nicht in murine Neugeborenen Speiseröhre erreichbar und die gesamte Speiseröhre zu Verarbeitung nachfolgend beschriebenen unterzogen.
- Erhalten Menschen Ösophagus:
- Waschen Sie Ösophagusresektion Proben (typischerweise 5 cm oder weniger) mit HBSS und entfernen Sie alle angeschlossenen Bindegewebe, Fett oder Gefäßsystem.
- Resektion eines Teils der Probe und setzen in Formalin für zukünftige histologische Untersuchung, falls gewünscht.
- Trennen Sie die übrigen Schleimhaut aus Basis Muscularis propria durch scharfe Dissektion.
- Geschnitten Schleimhaut in Unterzentimeter Fragmente und unter der nachstehend beschriebenen Protokoll.
HINWEIS: Human Speiseröhre Resektionen in PBS für bis zu 6 Stunden vor der Verarbeitung nachfolgend beschrieben gelagert werden. Quelle der Ösophagektomie Proben wird diktieren, Probengröße und Laborabhängig sein.
2. Isolieren murinen und humanen Ösophagus-Stromazellen
- Isolieren der Speiseröhre Stromazellen from murinen und menschlichen Gewebes durch eine Kombination von mechanischen und enzymatischen Verdau.
- Mechanisch verdauen durch Zerkleinern des Gewebes mit einer Schere und mehrmaligem Waschen mit HBSS. Enzymatisch zu verdauen durch Inkubieren des Gewebes mit 300 U / ml Kollagenase XI und 0,1 mg / ml Dispase, für 25 min (murine Gewebe) oder bis zu 6 Stunden (menschliches Gewebe). Stellen Sie sicher, dass Instrumente zur Zerkleinerung verwendet wurden autoklaviert und sterilisiert.
HINWEIS: Kollagenasen sind Enzyme, die Kollagen, eine extrazelluläre Matrix zur Aufnahme von tierischem Gewebe zusammen verantwortlich Protein zu brechen. Kollagenase XI hat hohe Collagenase-Aktivität und hat Erfolg in dieser Isolierungsprotokoll gesehen. Dispase ist ein bakterielles Enzym mit milden proteolytische Spaltaktivität, welche Zellmembran-Aktivität bewahrt und wird in Kombination mit Kollagenase als Sekundärenzym verwendet. - Zeigen Schleimhautfragmente aus der Maus oder menschlichem Gewebe in 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen oder 5 ml jeweils erhalten, die HBSS. Mince Gewebe weiterin 2-3 mm große Stücke mit einer Schere mit einem offenen Spitzenbreite, die in ihre Röhrchen passen. Planen Sie ausreichend Zeit, damit für Ösophagus-Schleimhaut-Fragmente an den Boden des Röhrchens sedimentieren.
- Langsam dekantieren HBSS, darauf achten, daß das Gewebe versehentlich zu verwerfen. Ersetzen mit frischem HBSS folgenden durch leichtes Schütteln. Alternativ zu entfernen HBSS mit einer 1 ml Pipette.
- Waschen Gewebe auf diese Weise insgesamt 8 Mal unter leichtem Schütteln in zwischen den Waschgängen so dass genügend Zeit für Speiseröhren Fragmente zwischen jedem Wasch sedimentieren.
HINWEIS: Human Tissue mehr benötigen Hacken, dass Neugeborene Mausgewebe.
- Mechanisch verdauen durch Zerkleinern des Gewebes mit einer Schere und mehrmaligem Waschen mit HBSS. Enzymatisch zu verdauen durch Inkubieren des Gewebes mit 300 U / ml Kollagenase XI und 0,1 mg / ml Dispase, für 25 min (murine Gewebe) oder bis zu 6 Stunden (menschliches Gewebe). Stellen Sie sicher, dass Instrumente zur Zerkleinerung verwendet wurden autoklaviert und sterilisiert.
- Inkubieren murinen Gewebe mit 300 U / ml Kollagenase XI und 0,1 mg / ml Dispase für 25 min auf einem Schüttler bei niedriger Geschwindigkeit bei Raumtemperatur eingestellt.
- Inkubieren menschlichem Gewebe mit 300 U / ml XI Kollagenase und 0,1 mg / ml Dispase für bis zu 6 Stunden, auf einem Schüttler bei niedriger Geschwindigkeit bei Raumtemperatur eingestellt.
HINWEIS: Die Verfügbarkeit von menschlichen esophagus variabel ist. Menschen Ösophagusmukosa mit Enzymen für bis zu 6 h führt zu erfolgreichen Generation von Primärkulturen inkubiert.
- Inkubieren menschlichem Gewebe mit 300 U / ml XI Kollagenase und 0,1 mg / ml Dispase für bis zu 6 Stunden, auf einem Schüttler bei niedriger Geschwindigkeit bei Raumtemperatur eingestellt.
- Nach enzymatische Verdauung, Hackfleisch Gewebe weiter mit Schere und Zentrifuge bei 200 g für 10 min.
- Überstand verwerfen. Übertragen der Pellets, die aus einer gemischten Zellsuspension auf eine 5-ml-Röhrchen und waschen 5mal in Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 2% Sorbitol ergänzt um nicht lebensfähige Zellen und Zelltrümmer zu entfernen.
- Samenzellen in 6-Well-Platten und die Kultur in DMEM mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 10 mg / ml Insulin, 10 ug / ml Transferrin, 10 ug / ml Gentamicin und 2 ng / ml epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) . Vakuumfilter (0,22 um) Alle Komponenten außer EGF die nach Filtration zugesetzt werden können. Verteilen Zellen aus menschlichen Resektionsproben erhalten unter mehreren Platten mit 6 Vertiefungen, abhängig von der Größe der Resektion.
- Sobald Brunnen sind 80% konfluent, Gang anhaftenden Zellen zu T25-Kolben unsing 0,05% Trypsin / Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA). Neutralisieren mit Medien und Spin bei 400 x g.
- Bei einem 6 gut Gang zu einem T25-Kolben, Passage-Zellen bei einer 1: 1-Verhältnis. 3-Verhältnis: 2 oder 1: Konfluente T25-Kolben kann zu einem 1 agiert werden. Um den Durchgang von einer T25-Flasche mit einem T75-Kolben, mit einem 1: 1 Verhältnis. Medienwechsel alle 2-3 Tage, unabhängig von dem Behälter.
- Wachsen Zellen bei 37 ºC in einem befeuchteten 5% CO 2 -Inkubator und Kultur in den oben beschriebenen myofibroblast Medien.
HINWEIS: Epithelzellen nicht unter diesen Kultur oder Gang Bedingungen zu überleben. Zellen zur Charakterisierung und in den unten beschriebenen Studien verwendet werden, sind zwischen den Passagen 5 und 15. - Cryo-Erhaltung Zellen in flüssigem N 2 durch Zugabe von 10% Dimethylsulfoxid in die Myofibroblasten Medien.
3. Charakterisieren murinen und humanen Ösophagus-Stromazellen
- Untersuchen Sie die Morphologie der Zellen mit einem inversen Mikroskop. Beachten Sie die spindelförmigeMorphologie der anhaftenden Zellen (Abbildung 1).
- Charakterisierung kultivierten Zellen durch Auswerten der folgenden Zytoskelett-Marker: α-SMA, Vimentin, Desmin und Cytokeratin. Stromazellen mit Myofibroblasten-ähnlichen Phänotyp exprimieren Zytoskelett myofibroblast Marker α-SMA und Vimentin (Abbildung 2).
- Zur weiteren Unterscheidung kultivierten Stromazellen aus Muskelzellen, für Desmin Immunfärbung. Zur Durchführung des Immunfärbung auf kultivierte Zellen, die Platte 1,5 x 10 4 Zellen in 4-Well-Kammerobjektträgern und wachsen in Myofibroblasten Medien für 24 Stunden. Stromazellen mit Myofibroblasten-ähnlichen Phänotyp wird schwach oder nicht vorhanden Desmin-Expression. Stromalen Zellen fehlt die Expression des epithelialen Marker pan-Cytokeratin (Daten nicht gezeigt).
HINWEIS: Bewertung der Kulturen gehört die Bewertung von Zytoskelett Marker durch Immunzytochemie und Zelloberflächenmarker mittels Durchflusszytometrie. Immuncytochemie als primäre Methode zur Charakterisierung als der Ex verwendetpression Profil der Proteine des Zytoskeletts ist einzigartig für den Fibroblasten, Myofibroblasten oder Muskelzelle. Durchflusszytometrie stellt die Reinheit der Kultur durch Auswertung Zelloberflächenexpression von Epithel-, Endothel- und blutbildenden Zellen-Marker. CD90 ist nützlich als Zusatz Verfahren zur Identifizierung von menschlichen Stromazellen, wie es sowohl an menschlichen Fibroblasten und Myofibroblasten ausgedrückt. CD90 ist nicht hilfreich bei der Charakterisierung von murinen Stromazellen, wie es auch von Maus-T-Zellen exprimiert wird.
- Zur weiteren Unterscheidung kultivierten Stromazellen aus Muskelzellen, für Desmin Immunfärbung. Zur Durchführung des Immunfärbung auf kultivierte Zellen, die Platte 1,5 x 10 4 Zellen in 4-Well-Kammerobjektträgern und wachsen in Myofibroblasten Medien für 24 Stunden. Stromazellen mit Myofibroblasten-ähnlichen Phänotyp wird schwach oder nicht vorhanden Desmin-Expression. Stromalen Zellen fehlt die Expression des epithelialen Marker pan-Cytokeratin (Daten nicht gezeigt).
- Nachdem die Zellen erreichen 60% Zusammenfluss gründlich Folien mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und befestigen mit Methanol. Inkubieren Zellen in Methanol für 10 min bei -20 ° C, dann in PBS bei 4 ° C bis zur Verwendung.
- Folgen Sie Standard-Immunfärbung Protokoll.
- Kurz vor dem Aufbringen des primären Antikörpers, blockieren die fixierten Zellen mit 5% goatserum in PBS. Verdünnen Sie primäre und sekundäre Antikörper in 5% Ziegenserum als auch.
- Für den Nachweis von α-SMA und Vimentin, verwenden Sie dieFolgende Antikörper und Konzentrationen: Mouse mAb zu α-SMA bei 1: 250 Verdünnung und Rabbit pAb zu Vimentin bei 1: 500-Verdünnung.
- Inkubieren mit primärem Antikörper bei Raumtemperatur über Nacht bei 4 ° C, Spülen 3 mal mit PBS und fügen sekundären Antikörper Rhodamin-konjugiertes Ziege-anti-Maus bei einer Verdünnung von 1: 200 und Cy2 konjugierten Ziegen anti Kaninchen bei einer Verdünnung von 1: 1000 für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
- Gegenfärbung Kerne mit 4 ', 6-Diamidino-2Phenylindole (DAPI) in einer Konzentration von 1 ug / ml für 1 Minute und dann mit PBS waschen. Analysieren Sie Dias mit einem inversen Mikroskop.
- Reinheit der Kulturen durch die Prüfung der murinen und humanen Ösophagus-Zellen, die für blutbildende (CD45) und Endothelzellen (CD31) Zelloberflächenmarker mittels Durchflusszytometrie (Abbildung 3). Charakterisierung menschlicher Zellen durch die Expression von stromalen Zelloberflächenmarker CD90.
HINWEIS: CD90 kann nicht verwendet werden, um murine Stromazellen murine T cel identifizierenls drücken auch CD90.- Lösen kultivierten Maus Speiseröhren Stromazellen von den Kulturflaschen durch Behandlung mit nicht-enzymatischen Zelldissoziationslösung bei 37 ° C für 10 min, mit FACS-Puffer zweimal gewaschen, gezählt und mit FITC-CD45 und CD31-APC mit relevanten Isotypenkontrollen gefärbten gemäß Standard-Färbeverfahren.
- Sammeln Zellen mittels FACS Calibur und Daten mit FlowJo Software analysieren. Vor dem Färben von Zellen, Antikörper zu optimieren und titriert Konzentrationen mit Isotypkontrollen, normale Maus Milz und Knochenmarkzellen.
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Representative Results
Ösophagus-Stroma-Zellen isoliert durch mechanische und enzymatische Verdauung werden zunächst vernickelt und in 6-Well-Platten kultiviert. Untersuchung von Zellen mit einem inversen Mikroskop innerhalb von Stunden nach Plattierung zeigt eine gemischte Zellsuspension lose anhaftenden zum Plattenboden (1A). Im Laufe der nächsten 24 Stunden, sind spindelförmige Zellen, fest haft an den Plattenboden beobachtet Aufnahmen aus der gemischten Zellsuspension (1B) .Diese sprießen Zellen auf das gesamte Gebiet eines Brunnens auf 5 Tage und erfolgreich agiert werden, behalten die Morphologie für mindestens 15 Passagen. Spindelförmige, adhärenten Zellen werden in geringer Dichte (1C), und wenn nahezu konfluenten (1D) beobachtet.
Immunfärbung von Primärkulturen von Speiseröhren Stromazellen in Kammer-Objektträgern gewachsen zeigt reichliche Expression von Myofibroblasten Zytoskelett-Marker α-SMA und Vimentin (Abbure 2), schwache Expression von Desmin und abwesend Zytokeratin.
Primärkulturen von Speiseröhren Myofibroblasten kann weiter für die Zell Reinheit durch Prüfung von hämatopoetischen und endothelialen Zelloberflächenmarker untersucht werden. Vorwärts- und Seitenstreuung für primäre murine Speiseröhren Stromazellen gefolgt von Gating und Analyse von lebenden Zellen für die Zelloberflächenproteine (3A) hergestellt. Primären murinen Speiseröhren Stromazellen fehlt Expression von hämatopoetischen CD45 (3B) und Endothelzellen-CD31 (3C) Zelloberflächenmarker.
Abb. 1: Primärkulturen von Maus-Ösophagus Stromazellen bei verschiedenen Passagen Untersuchung der murinen Stromazellen mit einem inversen Mikroskop innerhalb weniger Stunden nach Isolierung und Beschichtung zeigt eine Gruppe von gemischten cells lose anhaftenden Zellen an den Boden der Platte (A). Nach 24 bis 48 Stunden in Kultur, spindelförmige Zellen sprießen aus dem jetzt anhaftende Cluster (B). Spindelförmige Morphologie der anhaftenden Zellen besteht bei niedrigen (C) und hoher (D) Dichte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen. (Bilder mit freundlicher Genehmigung von Shaker et al. 6 verwendet wird).
Abbildung 2: Murine Speiseröhren Stromazellen in Primärkultur gewachsen auszudrücken Myofibroblasten Marker α-SMA und Vimentin Primäre murine Speiseröhren Stromazellen wurden auf Kammer-Objektträgern zu moderaten (AC) gewachsen und für α-SMA und Vimentin immun und niedriger Dichte (DF).. Esophageal Stromazellen reichlich Ausdruck α-SMA (A, D) und Vimentin (B, E). Murine Speiseröhren Stromazellen Zusammenarbeit zum Ausdruck bringen diese Myofibroblasten Markern (C, F). (Bilder mit freundlicher Genehmigung von Shaker et al. 6 verwendet wird). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 3: Primärkulturen von Maus-Ösophagus Myofibroblasten Zellen fehlt hämatopoetischen und endothelialen Zelloberflächenmarker Die Dot-Plot von murinen Speiseröhren Stromazellen, zeigt die FSC und SSC Eigenschaften dieser Zellpopulation.. Insgesamt 32,4% der Ereignisse gesteuerten (A) wurden die Expression von hämatopoetischen (CD45) und Endothelzellen (CD31) Zelloberflächenmarker durch eine einzelne i ausgewertetmmunostain nach Norm Färbeprotokollen. Die nicht-spezifische Färbung wurde für jeden Antikörper mit Isotypkontrollen bestimmt. Primäre Kulturen von murinen Speiseröhren Stromazellen exprimieren keine CD45 (B) oder CD31 (C). FSC: Vorwärtsstreuung; SSC: Seitwärtsstreuung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
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Discussion
Die Techniken zur Primärkultur Generation sind in der Regel ähnlich bei der Verwendung von murinen oder menschlichen Gewebes mit Hacken und Aufschlusszeiten für Gewebegröße angepasst. Unsere Erfahrungen mit murinen Gewebe schlägt vor, dass mit den oben beschriebenen Methoden konsequent in erfolgreiche Etablierung der Primärkulturen führen. Kritische Schritte innerhalb des Protokolls sind die Sterilisation von chirurgischen Geräten und folgenden Norm sterile Techniken der Gewebekultur. Das Alter der Mäuse ist auch ein entscheidender Schritt. 8-12 Tage alten Neugeborenen erfolgreich Primärkulturen durchgängig erhalten. Stromazellen von jüngeren Neugeborenen isoliert wurden nicht nicht erfolgreich erzeugt. Versuche, Myofibroblasten ähnlichen Stromazellen aus älteren Mäusen zu etablieren sind im Gange. Andere haben erfolgreiche Generation von Ösophagus-Fibroblasten von vier bis acht Wochen alten Mäusen 8 ausgewiesen.
Im Gegensatz Gründung Kolon Myofibroblasten, ist die Verunreinigung ein seltenes Thema in establishment von Kulturen von murinen Myofibroblasten wenn Antibiotika im Nährmedium enthalten. Weil Kulturen werden von Neugeborenen Mäusen, ist ein limitierender Faktor kleine Gewebe Größe und Abisolieren von Muscularis propria ist nicht ohne weiteres möglich. Auf der anderen Seite, im menschlichen Speiseröhre, ist Muscularis propria leicht unterscheidbar und von der Muscularis mucosa getrennt. Die enzymatische Verdauung und Kulturbedingungen sind nicht förderlich für das Wachstum von Immun- oder epitheliale Zellen in Kulturen von Maus oder Mensch Speiseröhre etabliert. Menschliche Resektionsproben vor anfällig für bakterielle Kontaminationen trotz der Verwendung von Antibiotika in das Kulturmedium, vielleicht wegen des größeren quantify Gewebe Gegenstand der Verarbeitung sind. Im Anschluss an Standard-Gewebekulturtechniken und konsequent Sterilisation chirurgischer Instrumente verringert Risiko einer Kontamination.
Der Vorteil der Primärkultur ist, dass diese Zellen sind relativ unmanipulierten und kann besser Rechnung zu tragen the in vivo-Umgebung im Vergleich zu immortalisierten Zellinien 9.
Die beschriebene Technik ist geradlinig und ist im Rahmen der Möglichkeiten der meisten Laboratorien. Der Nachteil der Primärkulturen gegenüber Zelllinien ist, dass Zellen über Durchgang 15 sind anfällig für genetische Mutation und eventuelle Seneszenz. Zusätzlich haben Primärkulturen von Mäusen oder Menschen erhalten inhärente Variabilität nicht in Zelllinien beobachtet. Alternative Methoden für Speiseröhren Fibroblasten-Isolierung wurden 10 beschrieben. Charakterisierung dieser Zellen in Kultur wurde jedoch bis Vimentinexpression begrenzt wurden oder Zellen, die Vimentin auszudrücken und nur schwach α-SMA positive 10 gezeigt.
Sobald diese Technik bewältigt wurde, können Primärkulturen von Resektion Proben von erkrankten menschlichen Speiseröhre festgestellt werden. Diese Methoden stellen Forschern die Möglichkeit zur Isolierung und Kultur Stromazellen aus verschiedenen klinischen and experimentellen Bedingungen, so dass Vergleiche zwischen den Gruppen. Kultivierte myofibroblast artigen Stromazellen können auch potentiell zur Verwendung in organotypischen oder Co-Kulturmodell mit anderen Zellen wie Eosinophile 3 oder in organotypischen Kultur 8 angepasst werden.
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Disclosures
Diese Arbeit wird durch NIH / NCI K08CA153036-01A1 (AS), AGA-General Mills Bell-Institut für Gesundheit und Ernährungsforschung Scholar Award in Gut Physiologie und Gesundheit (AS) und einem Wright Foundation Pilot Award (AS) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue culture reagents | |||
| HBSS | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Dispase | GIBCO, Invitrogen | 17105-041 | |
| Collagenase XI | Sigma-Aldrich | C9407 | |
| DMEM | GIBCO, Invitrogen | 11965-092 | |
| Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F42442 | |
| Transferrin | Roche | 10-652-202-001 | |
| trypsin/EDTA | Corning | 25-052-Cl | |
| Epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Reagents for immunostaining | |||
| Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Mouse mAB to α-SMA | abcam | ab7817 | |
| Rabbit pAB to vimentin | abcam | ab45939 | |
| Cy2 conjugated Goat anti Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 111-225-144 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | |
| CD31 conjugated to eFluor 450 | eBioscience | 48-0319-41 | |
| CD90 conjugated to APC | eBioscience | 17-0909-41 | |
| Annexin V and 7AAD | BD Pharmigen | 559763 | |
| Mouse Fc block for CD16/CD32 | BD Pharmigen | 2136662 | |
| Equipment | |||
| 5 ml tube | Eppendorf | 30108310 | |
| Inverted microscope | Motic | AE31 | |
| Biosafety cabinet and incubators | Nuaire | http://www.nuaire.com/products/ | |
| 4-well chamber slides | Thermo Scientific | 177437 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Olympus Vacuum-Driven Filter System | Genesee Scientific | 25-227 | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse TE300 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| T25 Flasks | TRP | 90026 | |
| T75 Flasks | Corning | 43064 | |
| Dissection scissors | |||
| Dissection forceps | |||
| Single tipped Q-Tips | Kendall | 540500 | |
| Software | |||
| Metamorph software (Molecular Devices) | Molecular Devices | ||
| FACSCAlibur | BD Bioscience | ||
| FACSVerse | BD Bioscience | ||
References
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