Abstract
マウスおよびヒト食道筋線維芽細胞は、酵素消化を介して生成されます。新生児（8-12日齢）マウス食道は、収穫みじん切り、洗浄し、そして25分間、コラゲナーゼおよびディスパーゼによる酵素消化に供される。人間の食道切除標本は、固有筋層と外膜を剥奪され、残りの粘膜はミンチされ、最大6時間、コラゲナーゼとディスパーゼとの酵素消化にかけた。培養した細胞は、α-SMAおよびビメンチンを発現させ、全く弱いかデスミンを発現する。培養条件は、上皮、造血、または内皮細胞の成長に貢献しない。培養物の純度は、さらに潜在的な汚染造血および内皮細胞の細胞表面マーカー発現のフローサイトメトリー評価によって確認される。記載された技術は、簡単であり、非hematopoieitc、非内皮間質細胞の一貫した生成をもたらす。この技術の制限事項の使用に固有のものである分子生物学の研究で初代培養、 すなわち 、避けられないばらつきが異なるマウスまたはヒトを越えて確立の文化の中で発生しました。初代培養は、しかし細胞株に比べて、生体内の状態をより代表反映している。これらの方法はまた、群間の比較を可能にする、研究者に異なる臨床および実験条件からストロマ細胞を単離し、培養する能力を提供する。特徴付け食道間質細胞はまた、食道疾患における上皮 - 間質相互作用を調査する機能的研究に用いることができる。
Introduction
上皮-間質相互作用は、粘膜の再生、修復、線維症、および発癌1,2-含む胃腸管の様々な機能の調節に関与する。これらの相互作用は、最高の小腸および結腸において研究されており、同様に食道粘膜障害3において役割を果たし得る。腸および結腸の間質細胞と呼ばれる筋線維芽細胞の亜集団は、組織損傷、炎症の媒介に関与し、4,5を修復することが実証されている。遠位の胃腸管では、これらの紡錘形細胞が上皮及び固有層の間の界面での基底膜に隣接して配置されており、α-SMAおよびビメンチン陽性の、汎サイトケラチン陰性、及び弱陽性またはデスミン陰性5として定義される。
食道ストロマ厳密セルラーまたは分子レベルで特徴付けられていない。ネズミの食道における私たちの仕事は、デを持って扁平上皮6に時折下にある、食道間質におけるα-SMAおよびビメンチン細胞monstrated。上皮-間質相互作用は、そのような胃食道仲介傷害6と好酸球性食道炎3として食道粘膜障害に関係している。線維性狭窄はまた、胃腸線維症の病因に関与していた食道の傷害および間質細胞の既知の合併症である。これらの細胞の単離は、錯乱シグナル伝達経路を調査するために必要な研究を達成するのに役立ちます。
この投稿は、これらの相互作用を媒介するシグナル伝達経路に関する知識の既存のギャップに対処することができるように、α-SMA陽性の、ビメンチン陽性の筋線維芽細胞の初代培養を確立するために必要な技術を提供する。記載された技術が正常初代マウス結腸筋線維芽細胞7及びfurtheを確立するために、著者らによって使用されているRは、マウス6と人間の筋線維芽細胞のような食道間質細胞の確立のために適合した。
】ここで我々は、将来の機能研究に使用する前に、マウスまたはヒト食道から確立これらの培養を確立し、特徴づけるために必要な条件について説明します。培養物を増殖させ、最大で15継代のために利用することができる。以下に概説する方法を経由して一次培養物の単離と確立は、筋線維芽細胞表現型を有する間質細胞を生成します。 、正のビメンチン-SMA、α、およびデスミン弱陽性または陰性、及びサイトケラチン陰性であった。この表現型は3負または粘膜筋板6のα-SMA陽性の、ビメンチン陰性表現型α-SMA、主にビメンチン陽性である食道線維芽細胞の表現型とは区別される。
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Protocol
動物実験、根拠や研究の目的を実行するためのプロトコルは、南カリフォルニア機関動物実験委員会の大学から提出され、承認された。
デ·同定されたヒト食道切除標本から初代培養を確立するためのプロトコルは、南カリフォルニア大学倫理委員会で承認されました。
1.マウスまたはヒト食道を入手
- マウス食道を取得します。
- 頸椎脱臼に続いて2％イソフルラン吸入過剰摂取で8〜12日齢のマウスを安楽死させる。
- 上下に面する腹動物を固定し、70％エタノールで腹側表面を濡らす。鉗子で、つかみ、ピンセットで尿道口に皮膚の前方を持ち上げる。あごに尿道口から腹側正中に沿って切断するための標準的なストレート外科用ハサミを使用してください。皮膚のみをカットするように注意してください。</ LI>
- "Y"逆さまを形成する、動物の両側の膝に下向きに開いて尿道から切開を行います。胸郭に沿って動物の両側に別の切開を行います。
- 慎重に根本的な腹膜と胸郭のオフを、両側の皮をはがし、そして両側に横たわっていた。胸腔と腹腔の上にある腹膜の上にある胸郭を調べます。
- 鉗子で腹膜を持ち上げ、横隔膜と肋骨ケージにそれをカットアップ、腹部の内容への損傷を防ぐために上向きにハサミを指している。静かに、肝臓の左葉を持ち上げ、基礎となる胃、食道·胃接合部と食道の腹部部分を露出させる。
- 子宮頸ガードルまでの正中線に沿って胸骨と肋骨を切断するためにオートクレーブ処理外科用ハサミを使用してください。胸部内容への損傷を防ぐために上向きにハサミを向け。完全に内容を公開する両側に胸郭を引いて胸腔。
- 静かに心臓や肺の両葉を取り除く。 Q-ヒント過剰な血液を吸収する。胸部食道は胸椎に気管と前の後方に横たわって狭い、フレキシブルチューブです。
NOTE：食道、マウス新生児識別することは困難である。食道·胃接合部のローカライズは、食道の識別は簡単になります。 - 慎重に周囲の血管系、脂肪を解剖、胃から食道をフォローアップし、子宮頸キャビティ内の食道の原点までのすべての方法を腸間膜。鈍い先端を有する外科用ハサミは、この目的のために最適に動作。
- 食道の全長を切除し、以下に説明するさらなる処理のためにハンクス平衡塩溶液（HBSS）中に置く。必要に応じて、方向付けのために胃の一部を削除します。
注：小さな組織サイズのため、筋肉から固有筋層の分離粘膜は、マウス新生児食道達成できないし、全体の食道は、下記の処理が行われる。
- 人間の食道を取得します。
- HBSSで食道切除標本（典型的には、5 cm以下）を洗って接続されているすべての結合組織、脂肪、または血管系を削除します。
- 標本の一部を切除し、必要に応じて将来の組織学的検査のためにホルマリン中に置く。
- 鋭い切開によって、基礎となる固有筋層から残りの粘膜を分離する。
- サブセンチフラグメントおよび以下に記載されているプロトコルの対象に粘膜をカット。
注：ヒト食道切除は、後述する処理の前に、最大6時間、PBS中で保存することができる。食道標本の供給源は、試料サイズが決まると実験依存することになる。
2.アイソマウスおよびヒト食道間質細胞
- fは食道の間質細胞を単離する機械的および酵素消化の組み合わせにより、ROMのマウスおよびヒト組織。
- 機械的にHBSSではさみと複数回の洗浄で組織を切り刻むことでダイジェスト。酵素的に300 U / mlのコラゲナーゼXIおよび0.1mg / 25分（マウス組織）のために、または最大6時間（ヒト組織）mlのディスパーゼで組織をインキュベートすることにより、ダイジェスト。ミンチに使用する器具はオートクレーブし、滅菌されていることを確認します。
NOTE：コラゲナーゼは、コラーゲン、一緒に動物組織を保持する責任細胞外マトリックスタンパク質を分解する酵素である。コラゲナーゼXIは、高いコラゲナーゼ活性を有しており、この分離プロトコルの成功を見ている。ディスパーゼは、細胞膜活性を保持し、二次酵素としてコラゲナーゼと組み合わせて使用される穏やかなタンパク質分解解離活性を有する細菌酵素である。 - HBSSを含む、それぞれ1.7ミリリットルマイクロ遠心または5 mlチューブでマウスまたはヒト組織から得た粘膜の断片を置きます。さらに組織をみじん切りそれぞれのチューブに収まるオープン先端幅とハサミを使用して2〜3ミリメートル片に。食道粘膜の断片は、チューブの底に沈殿さを可能にするために十分な時間を確保してください。
- ゆっくりと不注意に組織を破棄しないように注意しながら、HBSSをデカント。穏やかに振とうすることにより、以下の新鮮なHBSSで交換してください。別の方法として、1ミリリットルピペットでHBSSを削除します。
- 穏やかに食道断片は、各洗浄の間に沈降する時間を得るための洗浄の間で振とうしながら、このように8回の合計を組織を洗ってください。
注：ヒト組織は、よりその新生児のマウス組織を刻みが必要になります。
- 機械的にHBSSではさみと複数回の洗浄で組織を切り刻むことでダイジェスト。酵素的に300 U / mlのコラゲナーゼXIおよび0.1mg / 25分（マウス組織）のために、または最大6時間（ヒト組織）mlのディスパーゼで組織をインキュベートすることにより、ダイジェスト。ミンチに使用する器具はオートクレーブし、滅菌されていることを確認します。
- 300 U / mlのコラゲナーゼXIし、室温で低速でロッキングシェーカーセットで25分間0.1 mg / mlのディスパーゼを有するマウス組織をインキュベートする。
- 室温で低速に設定したロッキングシェーカー上、最大で6時間300 U / mlの第XIコラゲナーゼ及び0.1 mg / mlのディスパーゼでヒト組織をインキュベートします。
注：人間esophaの可用性GUSは可変である。初代培養の成功した世代で最大6時間の結果のための酵素とインキュベートしたヒト食道粘膜。
- 室温で低速に設定したロッキングシェーカー上、最大で6時間300 U / mlの第XIコラゲナーゼ及び0.1 mg / mlのディスパーゼでヒト組織をインキュベートします。
- 酵素消化した後、10分間200×gではさみや遠心分離機とのさらなるミンチ組織。
- 上清を捨てる。非生存細胞および破片を除去するために、2％ソルビトールを添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で5回の5mlチューブに混合細胞懸濁液からなるペレットを移し、洗浄する。
- 10％ウシ胎児血清（FBS）を含むDMEM中で6ウェルプレートに、培養中の種子細胞、10mg / mlのインスリン、10μg/ mlのトランスフェリン、10μg/ mlのゲンタマイシン、および2 / mlの上皮成長因子（EGF） 。真空フィルター（0.22μm）で濾過した後に添加することができるEGF以外のすべてのコンポーネント。切除サイズに応じて、複数の6ウェルプレートの中で人間の切除標本から得られた細胞を分配する。
- 井戸が80％コンフルエントになったら、T25への通路接着細胞は私たちをフラスコる0.05％トリプシン/エチレンジアミン四酢酸（EDTA）。 400×gでメディアやスピンで中和。
- 1：1の比率でのT25フラスコ、継代細胞に6ウェル通過のため。 2または1：3の比率コンフルエントT25フラスコ1に継代することができる。 1の比率：T75フラスコにT25フラスコから通路に、1を使用。関係なく、容器の2〜3日おきにメディアを変更します。
- メディアは、上述の筋線維芽細胞において、加湿5％CO 2インキュベーターと培養液中で37ºCで細胞を増殖させる。
注：上皮細胞はこれらの培養または継代条件下では生存しない。特徴づけのために、以下に記載の研究に用いた細胞は、継代5と15の間である。 - 筋線維芽細胞の培地に10％ジメチルスルホキシドを添加することにより、液体N 2中で細胞を凍結保存する。
3.特徴付けマウスおよびヒト食道間質細胞
- 倒立顕微鏡で細胞の形態を調べます。紡錘形を守って接着性細胞の形態（ 図1）。
- α-SMA、ビメンチン、デスミン、およびサイトケラチン：以下の細胞骨格のマーカーを評価することによって培養細胞を特徴づける。筋線維芽細胞様の表現型との間質細胞は、α-SMAおよびビメンチン（ 図2）細胞骨格筋線維芽細胞マーカーを発現する。
- さらにデスミンための免疫染色筋細胞から培養された間質細胞を区別する。培養細胞での免疫染色を行うために、4ウェルチャンバースライド中で1.5×10 4個の細胞をプレーティングし、24時間、筋線維芽細胞の培地中で成長する。筋線維芽細胞様の表現型との間質細胞が弱いか存在しないデスミンの発現を持つことになります。間質細胞は、上皮マーカーパンサイトケラチンの発現を欠く（データは示さず）。
注：培養物の評価は、フローサイトメトリー、免疫細胞化学及び細胞表面マーカーによる細胞骨格マーカーの評価を含む。免疫細胞化学は、元のように特性化の主な方法として使用されている細胞骨格タンパク質のPRESSIONプロファイルは、線維芽細胞、筋線維芽細胞や筋細胞のためにユニークです。フローサイトメトリーは、上皮、内皮および造血細胞マーカーの細胞表面発現を評価することにより、培養純度を確立します。 CD90は、それがヒト線維芽細胞および筋線維芽細胞の両方で発現されるヒト間質細胞を同定する補助的方法として有用である。それはまた、マウスT細胞によって発現されるCD90は、マウス間質細胞の特徴付けに有用ではない。
- さらにデスミンための免疫染色筋細胞から培養された間質細胞を区別する。培養細胞での免疫染色を行うために、4ウェルチャンバースライド中で1.5×10 4個の細胞をプレーティングし、24時間、筋線維芽細胞の培地中で成長する。筋線維芽細胞様の表現型との間質細胞が弱いか存在しないデスミンの発現を持つことになります。間質細胞は、上皮マーカーパンサイトケラチンの発現を欠く（データは示さず）。
- 細胞が60％コンフルエンスに達した後、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）でスライドをリンスし、メタノールで固定する。 -20℃で10分間、メタノール中で細胞をインキュベートし、その後、使用するまで4℃でPBS中に保存する。
- 標準の免疫染色プロトコルに従ってください。
- 簡単に言えば、一次抗体を適用する前、PBS中の5％goatserumで固定した細胞をブロックする。同様に、5％ヤギ血清で一次および二次抗体を希釈します。
- α-SMAおよびビメンチンの検出のために、使用する以下の抗体および濃度：マウスmAbは、α-SMAを次のように1：500希釈：1でのビメンチンに250希釈し、ウサギたpAB。
- 1の希釈で200およびCy2とコンジュゲートヤギ抗ウサギ：PBSで3回洗浄し、1の希釈で二次抗体ローダミン結合ヤギ抗マウスを追加し、4℃で一晩室温で一次抗体と共にインキュベートし、1時間1,000室温で。
- 次に、対比の1分間に1μg/ mlの濃度で4核 '、6-ジアミジノ-2Phenylindole（DAPI）およびPBSで洗浄した。倒立顕微鏡でスライドを分析します。
- 造血のためのマウスおよびヒトの食道細胞の検査（CD45）およびフローサイトメトリーによる内皮細胞（CD31）の細胞表面マーカー（ 図3）によって、培養物の純度を確立する。間質細胞表面マーカーCD90の発現によって、ヒト細胞を特徴づける。
NOTE：CD90は、マウスTセルネズミ間質細胞を同定するために使用することができないLSはまた、CD90を発現する。- 10分間37℃で非酵素的細胞解離溶液で処理することにより培養フラスコから培養マウス食道の間質細胞を切り離し、二回FACS緩衝液で洗浄し、関連するアイソタイプコントロールでFITC-CD45およびAPC-CD31を用いて計数し、染色し、従っ標準染色手順に。
- FACSキャリバーを用いて細胞を収集し、FlowJoソフトウェアを使用してデータを分析する。細胞を染色する前に、抗体を最適化し、アイソタイプ対照、正常マウスの脾臓および骨髄細胞を用いて濃度を滴定する。
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Representative Results
機械的および酵素消化を用いて単離し食道間質細胞は、最初に6ウェルプレートに播種し、培養する。めっき時間以内に倒立顕微鏡を用いた細胞の検査は、プレート底部（ 図1A）に緩く付着混合細胞懸濁液を実証する。次の24時間にわたり、プレート底部にしっかりと付着した紡錘状の細胞は、細胞がウェル内の5日間の全領域をカバーし、形態を維持し、正常に継代することができる。これらの出芽混合細胞懸濁液（ 図1B）から撮影観察される少なくとも15継代のために。紡錘型接着細胞を低密度（ 図1C）とするときほぼコンフルエント（ 図1D）で観測されている。
チャンバースライドで生育させ、食道間質細胞の初代培養物の免疫染色（ 図 α-SMAおよびビメンチン筋線維芽細胞の細胞骨格マーカーの豊富な発現を示すURE 2）、デスミンの弱い発現、および不在サイトケラチン。
食道筋線維芽細胞の初代培養物は、さらに、造血および内皮細胞表面マーカーの検査によって、細胞純度を調べることができる。前方および側方散乱は、細胞表面タンパク質（ 図3A）のためのゲーティング及び生細胞の分析を行った初代マウス食道の間質細胞のために確立されている。初代マウス食道間質細胞は、造血CD45（ 図3B）および内皮細胞のCD31（ 図3C）細胞表面マーカーの発現を欠く。
図1：単離およびめっきの時間内の異なる継代におけるマウス食道間質細胞の初代培養物を倒立顕微鏡でマウス間質細胞の検査は、混合したCEのクラスタを示しプレート底部（A）に緩く接着細胞LLS。培養液中で24〜48時間後に、紡錘状の細胞は今付着したクラスター（B）から発芽。接着細胞の紡錘状の形態は低い（C）で解決しないと高い（D）密度。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 （シェーカーらから許可を得て使用。図6）。
図2：初代培養で増殖させたマウスの食道間質細胞は、α-SMAおよびビメンチン筋線維芽細胞マーカーを発現する初代マウス食道間質細胞は、チャンバースライド上で増殖させ、適度な（AC）と低密度（DF）でα-SMAおよびビメンチンのために免疫染色した。 Esophagealの間質細胞を豊富にα-SMA（A、D）およびビメンチン（B、E）を発現する。マウス食道間質細胞は、これらの筋線維芽細胞のマーカー（C、F）を共発現。 （シェーカーらから許可を得て使用。図6）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：マウス食道筋線維芽細胞の初代培養物は、造血および内皮細胞表面マーカーを欠くマウス食道間質細胞のドットプロットは、FSCおよびこの細胞集団のSSCの特性を実証する。イベントの32.4％の合計は、造血の発現（CD45）および内皮（CD31）の細胞表面マーカーは、単一のiで評価した（A）ゲートし標準の染色プロトコルに従ってmmunostain。非特異的染色は、アイソタイプコントロールを使用して、各抗体について測定した。ネズミ食道間質細胞の初代培養は、CD45（B）またはCD31（C）を発現しない。 FSC：前方散乱。 SSC：側方散乱。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
組織のサイズに適合さミンチ消化時間で、マウスまたはヒト組織を使用するときに初代培養生成のための技術は、一般的に類似している。マウス組織での経験は、上記の方法を使用して一貫して一次培養物の確立に成功をもたらすことを示唆している。プロトコル内の重要なステップは、手術器具の滅菌を含む組織培養の標準的な滅菌技術に従って。マウスの年齢も重要なステップです。 8から12日齢の新生児は、一貫して成功した初代培養をもたらす。若い新生児から単離された間質細胞は正常に生成されていないされていない。古いマウスから筋線維芽細胞のような間質細胞を確立するための試みは継続中である。その他は、4〜8週齢のマウス8から食道線維芽細胞の正常な生成を報告している。
結腸筋線維芽細胞の確立とは異なり、汚染がE中のまれな問題である抗生物質を培地に含まれているマウスの筋線維芽細胞の培養物のstablishment。培養物を、新生児マウスから確立されているため、制限要因は、小さな組織サイズおよび固有筋層の剥離が容易に実現可能ではないです。一方、人間の食道に、固有筋層は、容易に識別し、粘膜筋板から分離される。酵素消化および培養条件は、マウスまたはヒト食道から確立培養において免疫または上皮細胞の増殖を助長するものではない。ヒトの切除標本は恐らくは処理を受けている組織のより大きな数量化を、培養培地中の抗生物質の使用にもかかわらず、細菌汚染を受けやすいままである。標準的な組織培養技術に従い、厳密に手術器具を滅菌することは汚染の危険性を軽減する。
初代培養の利点は、これらの細胞は比較的未操作であり、より良い目を反映する可能性があることである不死化細胞株9に比べて、電子インビボ環境。
記載された技術は、ストレートフォワードであり、ほとんどの研究室の手段の範囲内である。細胞株に対する初代培養の欠点は、通路15を超えて、細胞が遺伝子突然変異および最終的な老化の影響を受けやすいということである。加えて、マウスまたはヒトから得られた初代培養細胞株では観察されない固有の変動を有している。食道線維芽細胞を単離するための代替方法は、10に記載されている。培養中のこれらの細胞の特徴付けは、しかしながら、ビメンチンの発現に限定されているか、またはビメンチンを発現し、弱くのみα-SMA陽性の10である細胞を示した。
この技術は、習得された後、初代培養物は、罹患ヒト食道の切除標本から確立することができる。これらのメソッドは、研究者の異なる臨床Aからの間質細胞を分離し、培養する機能を提供ndは実験条件は、群間の比較を可能にする。培養された筋線維芽細胞様の間質細胞はまた、潜在的に、好酸球3または器官型培養物8と他の細胞との器官または共培養モデルにおける使用に適合させることができる。
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Disclosures
この作品は、NIH / NCI K08CA153036-01A1（AS）、健康のAGA-ゼネラル·ミルズベル研究所ガット生理学と健康で栄養研究員賞（AS）とライト財団パイロット賞（AS）によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue culture reagents | |||
| HBSS | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Dispase | GIBCO, Invitrogen | 17105-041 | |
| Collagenase XI | Sigma-Aldrich | C9407 | |
| DMEM | GIBCO, Invitrogen | 11965-092 | |
| Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F42442 | |
| Transferrin | Roche | 10-652-202-001 | |
| trypsin/EDTA | Corning | 25-052-Cl | |
| Epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Reagents for immunostaining | |||
| Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Mouse mAB to α-SMA | abcam | ab7817 | |
| Rabbit pAB to vimentin | abcam | ab45939 | |
| Cy2 conjugated Goat anti Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 111-225-144 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | |
| CD31 conjugated to eFluor 450 | eBioscience | 48-0319-41 | |
| CD90 conjugated to APC | eBioscience | 17-0909-41 | |
| Annexin V and 7AAD | BD Pharmigen | 559763 | |
| Mouse Fc block for CD16/CD32 | BD Pharmigen | 2136662 | |
| Equipment | |||
| 5 ml tube | Eppendorf | 30108310 | |
| Inverted microscope | Motic | AE31 | |
| Biosafety cabinet and incubators | Nuaire | http://www.nuaire.com/products/ | |
| 4-well chamber slides | Thermo Scientific | 177437 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Olympus Vacuum-Driven Filter System | Genesee Scientific | 25-227 | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse TE300 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| T25 Flasks | TRP | 90026 | |
| T75 Flasks | Corning | 43064 | |
| Dissection scissors | |||
| Dissection forceps | |||
| Single tipped Q-Tips | Kendall | 540500 | |
| Software | |||
| Metamorph software (Molecular Devices) | Molecular Devices | ||
| FACSCAlibur | BD Bioscience | ||
| FACSVerse | BD Bioscience | ||
References
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