Abstract
Murine og menneskelig esophageal myofibroblasts genereres via enzymatisk fordøyelse. Neonatal (8-12 dager gamle) murine esophagus blir høstet, hakket, vasket og underkastet enzymatisk spaltning med kollagenase og dispase i 25 min. Humane esophageal reseksjon prøvene er strippet av muscularis propria og adventitia og den gjenværende mukosa er hakket, og underkastet enzymatisk spaltning med kollagenase og dispase i opptil 6 timer. Dyrkede celler uttrykker α-SMA og vimentin og ekspress desmin svakt eller ikke i det hele tatt. Kultur forholdene er ikke bidrar til vekst av epitel, blodkreft, eller endotelceller. Kultur renhet bekreftes ytterligere ved strømningscytometrisk evaluering av celleoverflatemarkør ekspresjon av potensielle forurensende hematopoetiske og endotelceller. Den beskrevne teknikk er enkel og resulterer i samsvar generasjon av ikke-hematopoieitc, ikke-endoteliale stromale celler. Begrensninger av denne teknikken er iboende i anvendelsen avprimærkulturer i molekylærbiologiske studier, dvs., den uunngåelige variabilitet oppstått mellom kulturer etablert på tvers av ulike mus eller mennesker. Primære kulturer er imidlertid en mer representativ refleksjon av in vivo tilstand sammenlignet med cellelinjer. Disse fremgangsmåter gir også søkere evnen til å isolere og kultur stromale celler fra forskjellige kliniske og eksperimentelle betingelser, slik at sammenligning mellom gruppene. Karakteriserte esophageal stromalceller kan også brukes i funksjonelle studier som undersøker epiteliale-stromal interaksjoner i esophageal lidelser.
Introduction
Epiteliale-stromal interaksjoner er involvert i reguleringen av en rekke gastrointestinale veis funksjoner inkludert slimhinnene gjenfødelse, reparasjon, fibrose, og carcinogenesis 1,2. Disse interaksjonene har vært beste studert i tynntarm og tykktarm, og kan likeledes spille en rolle i esophageal slimhinnelidelser tre. En subpopulasjon av intestinale og colonic stromale celler betegnes myofibroblasts er vist å delta i å mediere vevsskade, inflammasjon og reparere 4,5. I den distale mage-tarmkanalen, er disse spindelformede celler som ligger ved siden av basalmembran ved grenseflaten mellom epitel og lamina propria og er definert som α-SMA og vimentin positiv, pan-cytokeratin negativ, og svakt positiv eller negativ desmin 5.
Esophageal stroma er ikke blitt grundig karakterisert ved et cellulært eller molekylært nivå. Vårt arbeid i murine spiserøret har demonstrated α-SMA og vimentin celler i esophageal stroma, tidvis underliggende til plateepitel 6. Epiteliale-stromal interaksjoner har vært innblandet i esophageal slimhinnelidelser som gastro-esophageal mediert skade 6 og eosinofil øsofagitt tre. Fibrotic strikturer er også en kjent komplikasjon av esophageal skade- og stromale celler har vært innblandet i patogenesen av gastrointestinal fibrose. Isolering av disse cellene vil bidra til å oppnå de nødvendige undersøkelser for å undersøke gale signalveier.
I dette brevet gir de teknikker som er nødvendige for å etablere primærkulturer av α-SMA positive, vimentin positive myofibroblasts slik at eksisterende kunnskapshull når det gjelder signalveier som medierer disse interaksjoner kan adresseres. Teknikken beskrevet har blitt brukt av forfatterne å etablere primær murine colonic myofibroblasts 7 og further tilrettelagt for etablering av murine 6 og menneske myofibroblast lignende esophageal stromalceller.
Heri vi beskrive forholdene som trengs for å etablere og karakterisere disse kulturene etablerte fra mus eller menneskelige spiserøret før bruk i fremtidige funksjonelle studier. Kulturer kan dyrkes og anvendes for opptil 15 passasjer. Isolasjon og etablering av primærkulturer via metodene beskrevet nedenfor genererer stromale celler med en myofibroblast fenotype; α-SMA, vimentin positiv, og svakt positiv eller negativ for desmin, og cytokeratin negativ. Denne fenotypen er adskilt fra fenotypen av esophageal fibroblast som er overveiende positiv vimentin, α-SMA negativ 3 eller α-SMA-positive, vimentin negativ fenotype av muscularis slimhinner 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen som skal utføre dyreforsøk, begrunnelsen og målene til forskning, ble sendt inn og godkjent av University of Southern California Institutional Animal Care og bruk komité.
Protokollen for etablering av primærkulturer fra avidentifiserte menneskelige esophagectomy eksemplarer ble godkjent av University of Southern California Institutional Review Board.
1. Skaff Mus eller Menneskelig Esophagus
- Skaff Mouse Spiserøret:
- Avlive 8-12 dager gammel mus med 2% isofluran inhalant overdose etterfulgt av halsdislokasjon.
- Pin dyret ned med buken vendt opp og fukte ventral overflaten med 70% etanol. Med pinsett, ta tak og løfte opp huden anterior til urinrørsåpningen med pinsett. Bruk standard rett kirurgiske saks til å klippe langs ventral midtlinjen fra urinrørsåpningen til haken. Vær nøye med å klippe bare huden. </ Li>
- Gjøre et snitt fra urinrørsåpningen nedover til kneet på begge sider av dyret, og danner et opp-ned "Y". Lag en annen innsnitt på begge sider av dyret langs brystkassen.
- Skrelle forsiktig huden på begge sider, av av den underliggende bukhule og brystkassen, og legge til sidene. Undersøke brystkassen liggende brysthulen og bukhinnen liggende bukhulen.
- Løft opp peritoneum med pinsett og skjære gjennom det opp til mellomgulvet og brystkassen, peker saks oppover for å hindre skade på mageinnholdet. Løft forsiktig opp venstre leverlapp, avsløre underliggende magen, esophageal-mage knutepunkt og abdominal del av spiserøret.
- Bruk autoklaveres kirurgisk saks til å skjære gjennom brystbenet og brystkasse langs midtlinjen opp til livmorhals belte. Point saks oppover for å forhindre skade på thorax innholdet. Fullt eksponere innholdet ibrysthule ved å trekke i brystkassen til sidene.
- Fjern forsiktig hjerte og begge fliker av lungene. Absorbere overflødig blod med Q-tips. Den torakale Spiserøret er et smalt, fleksibelt rør liggende posterior til luftrøret og anterior til brystbenet.
MERK: Spiserøret kan være vanskelig å identifisere i murine nyfødte. Lokalisering av esophageal-mage veikryss gjør esophageal identifikasjon grei. - Følge nøye spiserøret opp fra magen, dissekere det omliggende blodkar, fett og mesenterium hele veien opp til den øsofageale opprinnelse i den cervikale hulrom. Kirurgiske saks med butt tupp fungerer best for dette formålet.
- Resect hele lengden av spiserøret og plasser i Hanks 'balanserte saltløsning (HBSS) for videre behandling som er beskrevet nedenfor. Fjerne en del av magen for orienteringsformål hvis ønskelig.
MERK: På grunn av liten vev størrelse, separasjon av muskularis propria fra den muskuløseer slimhinne er ikke oppnåelig i murine nyfødte spiserør og hele spiserøret blir utsatt for behandlingen beskrevet nedenfor.
- Skaff Menneskelig Spiserøret:
- Vask esophageal reseksjon prøver (vanligvis 5 cm eller mindre) med HBSS og fjerne eventuell tilknyttet bindevev, fett, eller blodkar.
- Resect en del av prøven, og plasser i formalin for fremtidig histologisk undersøkelse om ønskelig.
- Skille de resterslimhinnen fra underliggende muskularis propria ved skarp disseksjon.
- Skjær slimhinner i under centimeter fragmenter og under protokollen beskrevet nedenfor.
MERK: Menneskelige spiserør resections kan lagres i PBS i opptil seks timer før behandling beskrevet nedenfor. Kilde esophagectomy prøvene vil diktere prøvestørrelse og vil være laboratorieavhengig.
2. Koble mus og menneske Esophageal stromalceller
- Isolere esophageal stromalceller fROM murine og humane vev ved en kombinasjon av mekanisk og enzymatisk nedbrytning.
- Mekanisk fordøye ved hakking vevet med saks og flere vasker med HBSS. Enzymatisk digest ved inkubering av vevet med 300 U / ml kollagenase XI og 0,1 mg / ml i 25 minutter dispase (murine vev) eller i opp til 6 timer (humant vev). Sikre at instrumenter som brukes for hakking har blitt autoklaveres og steriliseres.
MERK: Kollagenaser er enzymer som bryter ned kollagen, et ekstracellulært matrix protein ansvarlig for å holde dyr vev sammen. Kollagenase XI har høy kollagenaseaktivitet og har sett suksess i dette isolert protokollen. Dispase er et bakterielt enzym med mild proteolytisk dissosiasjon aktivitet som bevarer cellemembranen aktivitet og benyttes i kombinasjon med kollagenase som et sekundært enzym. - Plassere slimhinne fragmenter hentet fra mus eller menneskelig vev i 1,7 ml mikro-sentrifuger eller 5 ml rør henholdsvis, som inneholder HBSS. Kjøttdeig vev videreinn 2-3 mm brikker bruker saks med en åpen spiss bredde som vil passe inn i respektive rør. Gi nok tid til å tillate esophageal slimhinne fragmenter for å sedimentere til bunnen av røret.
- Sakte dekanter HBSS, være forsiktig med å uforvarende forkaste vev. Erstatte med fersk HBSS følgende ved forsiktig risting. Alternativt fjerne HBSS med en 1 ml pipette.
- Vask vev på denne måten totalt 8 ganger med forsiktig risting i mellom vaskinger tillater tid for esophageal fragmenter for å sedimentere mellom hver vask.
MERK: Human vev vil kreve mer hakking at nyfødte mus vev.
- Mekanisk fordøye ved hakking vevet med saks og flere vasker med HBSS. Enzymatisk digest ved inkubering av vevet med 300 U / ml kollagenase XI og 0,1 mg / ml i 25 minutter dispase (murine vev) eller i opp til 6 timer (humant vev). Sikre at instrumenter som brukes for hakking har blitt autoklaveres og steriliseres.
- Inkuber murine vev med 300 U / ml kollagenase XI og 0,1 mg / ml dispase i 25 min på en gynge shaker innstilt på lav hastighet ved romtemperatur.
- Inkuber humant vev med 300 U / ml XI kollagenase og 0,1 mg / ml dispase i opp til 6 timer, på en gynge shaker innstilt på lav hastighet ved romtemperatur.
MERK: Tilgjengeligheten av menneskelig esophagus er variabel. Menneskelig esophageal slimhinner inkuberes med enzymer for opptil 6 timers resultater i vellykket generasjon av primærkulturer.
- Inkuber humant vev med 300 U / ml XI kollagenase og 0,1 mg / ml dispase i opp til 6 timer, på en gynge shaker innstilt på lav hastighet ved romtemperatur.
- Etter enzymatisk fordøyelse, kjøttdeig vev videre med saks og sentrifuger ved 200 xg i 10 min.
- Kast supernatanten. Overfør pelleten, som består av en blandet cellesuspensjon til et 5 ml rør og vaskes 5 ganger i Dulbeccos modifiserte Eagle Medium (DMEM) supplert med 2% sorbitol for å eliminere ikke-levedyktige celler og rester.
- Seed celler i 6-brønners plater og kultur i DMEM med 10% føtalt bovint serum (FBS), 10 mg / ml insulin, 10 ug / ml transferrin, 10 ug / ml gentamicin, og 2 ng / ml epidermal vekstfaktor (EGF) . Vakuum filter (0,22 mikrometer) alle komponenter unntatt EGF som kan legges etter filtrering. Fordel celler oppnådd fra humane reseksjon prøver mellom flere 6-brønns plater, avhengig av størrelsen reseksjon.
- Når brønnene er 80% sammenflytende, passage heftende celler til T25 krukker ossing 0,05% trypsin / etylendiamintetraeddiksyre (EDTA). Nøytraliser med media og spinn ved 400 x g.
- For en 6 godt passasje til en T25-kolbe, passage celler ved et 1: 1 forhold. Konfluent T25 kolber kan bli passert på en 1: 2 eller 1: 3-forhold. Til passasje fra en T25 kolbe til en T75 kolbe, bruk en 1: 1-forhold. Endre media hver 2-3 dag uavhengig av fartøyet.
- Dyrke celler ved 37 ºC i en fuktet 5% CO 2 inkubator og kultur i myofibroblast media beskrevet ovenfor.
MERK: Epitelceller ikke overleve under disse kultur eller passasjeforhold. Celler som brukes for å karakterisere, og i studiene beskrevet nedenfor er mellom passasjene 5 og 15. - Cryo-bevare celler i flytende N 2 ved tilsetning av 10% dimetylsulfoksyd til myofibroblast media.
3. karakter mus og menneske Esophageal stromalceller
- Undersøke morfologien av celler med et invertert mikroskop. Observere spindel-formetMorfologien av adherente celler (figur 1).
- Karakter dyrkede celler ved evaluering av følgende cytoskeletal markører: α-SMA, vimentin, desmin, og cytokeratin. Stromale celler med en myofibroblast lignende fenotype uttrykke cytoskeletal myofibroblast markører α-SMA og vimentin (figur 2).
- For ytterligere å skille dyrkede stromalceller fra muskelceller, immunfarging for desmin. Å utføre farging på dyrkede celler, plate 1,5 x 10 4 celler i fire-brønns kammer lysbilder og vokse i myofibroblast media i 24 timer. Stromale celler med en myofibroblast lignende fenotype vil ha svak eller fraværende desmin uttrykk. Stromale celler mangler ekspresjon av det epiteliale markør pan-cytokeratin (data ikke vist).
MERK: Vurdering av kulturer omfatter evaluering av cytoskeletal markører ved immunocytokjemi og celleoverflatemarkører ved flowcytometri. Immunocytokjemi blir brukt som den primære metode for karakterisering som expression profilen til cytoskeletal proteiner er unik for fibroblast, myofibroblast eller muskelcelle. Strømningscytometri etablerer renhet kultur ved å evaluere celleoverflate-ekspresjon av epitelial, endotel, og hematopoetiske celler markører. CD90 er nyttig som en tilleggsmetode for å identifisere menneskelige stromalceller som det uttrykkes på både menneskelige fibroblaster og myofibroblasts. CD90 er ikke nyttig i karakterisering av murine stromalceller som det også uttrykt av murine T-celler.
- For ytterligere å skille dyrkede stromalceller fra muskelceller, immunfarging for desmin. Å utføre farging på dyrkede celler, plate 1,5 x 10 4 celler i fire-brønns kammer lysbilder og vokse i myofibroblast media i 24 timer. Stromale celler med en myofibroblast lignende fenotype vil ha svak eller fraværende desmin uttrykk. Stromale celler mangler ekspresjon av det epiteliale markør pan-cytokeratin (data ikke vist).
- Etter at cellene når 60% konfluens, skyll lysbilder med fosfat-bufret saltvann (PBS) og løse med metanol. Inkuber cellene i metanol i 10 minutter ved -20 ° C, og deretter lagres i PBS ved 4 ° C inntil bruk.
- Følg standard immunofarging protokollen.
- Kort beskrevet, forut for påføring av det primære antistoff, blokkerer de fikserte celler med 5% goatserum i PBS. Fortynne primære og sekundære antistoffer i 5% geit serum i tillegg.
- For påvisning av α-SMA og vimentin, brukerFølgende antistoffer og konsentrasjoner: Mouse mAB til α-SMA på 1: 250 fortynning og Rabbit PAB til vimentin på 1: 500 fortynning.
- Inkuber med primært antistoff ved værelsestemperatur over natten ved 4 ° C, skylles tre ganger med PBS og tilsett sekundære antistoffer rhodamin-konjugert geit anti mus ved en fortynning på 1: 200 og Cy2 konjugert geit-anti kanin ved en fortynning på 1: 1000 i 1 time ved romtemperatur.
- Counterstain atomkjerner med 4 ', 6-diamidino-2Phenylindole (DAPI) ved en konsentrasjon på 1 pg / ml i 1 min, og vask deretter med PBS. Analyser lysbilder med en invertert mikroskop.
- Etablere renhet på kulturer ved undersøkelse av murine og humane celler esophageal for hematopoietisk (CD45) og endotel (CD31) celleoverflatemarkører ved flowcytometri (figur 3). Karakterisere humane celler ytterligere ved ekspresjon av det stromale celleoverflatemarkør CD90.
MERK: CD90 kan ikke brukes til å identifisere murine stromalceller som muse T cells også uttrykker CD90.- Løsne dyrkede mus esophageal stromale celler fra kulturflasker ved behandling med ikke-enzymatisk celledissosiasjon løsning ved 37 ° C i 10 minutter, vasket med FACS-buffer to ganger, telles og farget med FITC-CD45 og APC-CD31 med relevante isotype kontroll, ifølge til standard farvningsprosedyrer.
- Samle celler ved hjelp FACS Calibur og analysere data med FlowJo programvare. Før farging celler, optimalisere antistoffer og titrere konsentrasjoner ved hjelp av isotype kontroll, normal musemilt, og benmargceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Esophageal stromale celler isolert ved hjelp av mekanisk og enzymatisk fordøyelse blir først belagt og dyrket i 6-brønners plater. Undersøkelse av celler med et invertert mikroskop innen timer etter plating demonstrerer en blandet cellesuspensjon løst vedheftende til platebunnen (figur 1A). I løpet av de neste 24 timer, er spindelformede celler fast tilhenger til plate nederst observert skyting fra den blandede cellesuspensjon (figur 1B) .Disse spirende celler dekke hele området av en brønn innen 5 dager og kan passaged hell, beholder morfologi i minst 15 passasjer. Spindel-formede adherente celler er observert ved lav tetthet (figur 1C), og når nær-sammenflytende (figur 1D).
Farging av primærkulturer av esophageal stromale celler dyrket i kammer lysbilder demonstrerer rikelig uttrykk for myofibroblast cytoskeletal markører α-SMA og vimentin (Figure 2), svak uttrykk for desmin, og fraværende cytokeratin.
Primærkulturer av esophageal myofibroblasts kan bli ytterligere undersøkt for celle renhet ved undersøkelse av blodkreft og endotelceller markører celleoverflaten. Forover og side scatter er etablert for primær murine esophageal stromalceller fulgt av gating og analyse av levende celler for celleoverflateproteiner (figur 3A). Primære murine esophageal stromalceller mangler uttrykk for blodkreft CD45 (Figur 3B) og endotelceller CD31 (Figur 3C) celleoverflatemarkører.
Figur 1:. Primære kulturer av murine esophageal stromalceller på ulike passasjer Undersøkelse av murine stromalceller med en invertert mikroskop bare timer etter isolering og plating demonstrerer en klynge av blandet cells løst adherente celler til bunnplaten (A). Etter 24-48 timer i kultur, spindelformede celler spire fra nå tilhenger klynge (B). Spindel-formet morfologi av heftende celler vedvarer ved lave (C) og høy (D) tetthet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. (Tall brukt med tillatelse fra Shaker et al. 6).
Figur 2: Murine esophageal stromale celler dyrket i primærkultur uttrykke myofibroblast markører α-SMA og vimentin Primære murine esophageal stromale celler ble dyrket på kammer lysbilder og immunostained for α-SMA og vimentin ved moderat (AC) og lav tetthet (DF).. Esophageal stromalceller rikelig uttrykke α-SMA (A, D) og vimentin (B, E). Murine esophageal stromalceller co-express disse myofibroblast markører (C, F). (Tall brukt med tillatelse fra Shaker et al. 6). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Primære kulturer av murine esophageal myofibroblasts cellene mangler blodkreft og endotelceller markører celleoverflate Den prikkplott av murine esophageal stromalceller demonstrerer FSC og SSC kjennetegn ved denne populasjonen av celler.. Totalt 32,4% av hendelser ble gated (A), ble ekspresjon av hematopoetiske (CD45) og endotel (CD31) celleoverflatemarkører evaluert ved en enkelt immunostain i henhold til standard fargeprotokoller. Ikke-spesifikk farging, ble bestemt for hvert antistoff ved hjelp av isotype kontroll. Primære kulturer av muse-esophageal stromale celler uttrykker ikke CD45 (B) eller CD31 (C). FSC: forward scatter; SSC: side scatter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Teknikkene for primær kultur generasjon er generelt like når du bruker mus eller menneskelig vev med Kjøtt og fordøyelse ganger tilpasset vev størrelse. Vår erfaring med murine vev tyder på at ved hjelp av de ovenfor beskrevne metoder konsekvent fører til vellykket etablering av primære kulturer. Kritiske trinnene i protokollen omfatter sterilisering av kirurgisk utstyr og ved å følge standard sterile teknikker for vevskultur. Alderen på mus er også et kritisk punkt. 8-12 dager gamle nyfødte konsekvent gi vellykkede primærkulturer. Stromale celler isolert fra yngre nyfødte ikke har blitt ikke blitt generert. Forsøk på å etablere myofibroblast lignende stromalceller fra eldre mus er pågående. Andre har rapportert vellykket generasjon av esophageal fibroblaster fra fire til åtte uker gamle mus 8.
I motsetning til etablering av colonic myofibroblasts, er forurensning et sjeldent problem i establishment av kulturer av murine myofibroblasts når antibiotika er inkludert i dyrkningsmediet. Fordi kulturer blir etablert fra nyfødte mus, er en begrensende faktor liten vev størrelse og stripping av muscularis propria er ikke lett gjennomførbart. På den annen side, i den menneskelige spiserøret, er muscularis propria lett kan skilles, og separeres fra muscularis mucosa. Den enzymatiske fordøyelsen og kultur forholdene er ikke bidrar til vekst av immun eller epitelceller i kulturer etablert fra mus eller menneskelige spiserøret. Humane reseksjon prøver forblir utsatt for bakteriell forurensning til tross for bruk av antibiotika i kulturmediet, kanskje på grunn av den større kvantifisere av vev som gjennomgår behandling. Etter standard vevskulturteknikker og strengt sterilisering kirurgiske instrumenter reduserer risikoen for kontaminering.
Fordelen med primærkultur er at disse cellene er relativt umanipulerte og kanskje bedre reflektere the in vivo miljø i forhold til immortaliserte cellelinjer 9.
Den beskrevne teknikk er rett-frem, og er innenfor hjelp av de fleste laboratorier. Ulempen med primære kulturer versus cellelinjer er at celler utenfor passasjen 15 er utsatt for genetisk mutasjon og eventuell begynnende alderdom. I tillegg primære kulturer erholdt fra mus eller mennesker har iboende variabilitet ikke observert i cellelinjer. Alternative metoder for esophageal fibroblast isolasjon har blitt beskrevet 10. Karakterisering av disse celler i kultur har imidlertid vært begrenset til vimentin ekspresjon eller har demonstrert celler som uttrykker vimentin, og er bare svakt α-SMA-positive 10.
Når denne teknikken har blitt mestret, kan primærkulturer etableres fra reseksjon eksemplarer av sykelig menneskelige spiserøret. Disse metoder gir søkere evnen til å isolere og kultur stromale celler fra forskjellige kliniske ennd eksperimentelle forhold, slik at sammenligninger mellom grupper. Dyrkede myofibroblast lignende stromale celler kan også være potensielt tilpasses for bruk i organotypiske eller ko-kulturmodeller med andre celler slik som eosinofiler 3 eller i organotypic kultur 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dette arbeidet støttes av NIH / NCI K08CA153036-01A1 (AS), AGA-General Mills Bell Institute of Health og Nutrition Research Scholar Award i Gut fysiologi og helse (AS) og en Wright Foundation Pilot Award (AS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue culture reagents | |||
| HBSS | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Dispase | GIBCO, Invitrogen | 17105-041 | |
| Collagenase XI | Sigma-Aldrich | C9407 | |
| DMEM | GIBCO, Invitrogen | 11965-092 | |
| Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F42442 | |
| Transferrin | Roche | 10-652-202-001 | |
| trypsin/EDTA | Corning | 25-052-Cl | |
| Epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Reagents for immunostaining | |||
| Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Mouse mAB to α-SMA | abcam | ab7817 | |
| Rabbit pAB to vimentin | abcam | ab45939 | |
| Cy2 conjugated Goat anti Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 111-225-144 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | |
| CD31 conjugated to eFluor 450 | eBioscience | 48-0319-41 | |
| CD90 conjugated to APC | eBioscience | 17-0909-41 | |
| Annexin V and 7AAD | BD Pharmigen | 559763 | |
| Mouse Fc block for CD16/CD32 | BD Pharmigen | 2136662 | |
| Equipment | |||
| 5 ml tube | Eppendorf | 30108310 | |
| Inverted microscope | Motic | AE31 | |
| Biosafety cabinet and incubators | Nuaire | http://www.nuaire.com/products/ | |
| 4-well chamber slides | Thermo Scientific | 177437 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Olympus Vacuum-Driven Filter System | Genesee Scientific | 25-227 | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse TE300 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| T25 Flasks | TRP | 90026 | |
| T75 Flasks | Corning | 43064 | |
| Dissection scissors | |||
| Dissection forceps | |||
| Single tipped Q-Tips | Kendall | 540500 | |
| Software | |||
| Metamorph software (Molecular Devices) | Molecular Devices | ||
| FACSCAlibur | BD Bioscience | ||
| FACSVerse | BD Bioscience | ||
References
- Stappenbeck, T. S., Miyoshi, H. The role of stromal stem cells in tissue regeneration and wound repair. Science. 324 (5935), 1666-1669 (2009).
- Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. Mesenchymal cells of the intestinal lamina propria. Annu Rev Physiol. 73, 213-237 (2011).
- Rieder, F., et al. T-Helper 2 Cytokines, Transforming Growth Factor beta1, and Eosinophil Products Induce Fibrogenesis and Alter Muscle Motility in Patients With Eosinophilic Esophagitis. Gastroenterology. 146 (5), 1266-1277 (2014).
- Powell, D. W., et al. Paracrine cells important in health and disease. The American Journal of Physiology. 277 (1 Pt. 1), C1-9 (1999).
- Powell, D. W., et al. Intestinal subepithelial myofibroblasts. The American Journal of Physiology. 277 (2 Pt. 1), C183-201 (1999).
- Shaker, A., et al. Stromal cells participate in the murine esophageal mucosal injury response. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (7), 662-672 (2013).
- Shaker, A., et al. Epimorphin deletion protects mice from inflammation-induced colon carcinogenesis and alters stem cell niche myofibroblast secretion. The Journal of Clinical Investigation. 120 (6), 2081-2093 (2010).
- Kalabis, J., et al. Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture. Nature Protocols. 7 (2), 235-246 (2012).
- Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).
- Rieder, F., et al. Gastroesophageal reflux disease-associated esophagitis induces endogenous cytokine production leading to motor abnormalities. Gastroenterology. 132 (1), 154-165 (2007).
