Abstract
マウスは、現在の肺疾患の種々のモデル化に使用される主要な動物である。このような病状の根底にあるメカニズムを研究するために、表現型の方法は、病理学的変化を定量化することが必要とされている。さらに、マウスモデルへの並進の関連性を提供するために、そのような測定を容易にヒトおよびマウスの両方で行うことができるテストであるべきである。残念ながら、現在の文献に肺機能のいくつかの表現型の測定は、ヒトへの直接のアプリケーションがあります。唯一の例外は、日常的にヒトにおいて行われた測定である一酸化炭素拡散能である。今回の報告では、迅速かつ簡単にマウスではこの拡散能を測定するための手段を説明する。手順は、1分ガス分析時間が続く、麻酔したマウスにおけるトレーサガスと短い肺膨張を伴う。私たちは、肺気腫、線維症、急性肺損傷、およびインフルエンザを含むいくつかの肺の病変を検出するためのこの方法の能力をテストし、真菌の肺感染症、ならびに若い仔における肺成熟をモニタする。結果は、すべての重要な肺病変の減少、ならびに肺成熟と拡散容量の増加を示す。肺拡散能のこの測定は、このように既存の病的な肺モデルのほとんどと表現型の構造変化を検出する能力を有する広い用途を有する肺機能試験を提供する。
Introduction
マウスは、現在の肺疾患の種々のモデル化に使用される主要な動物である。そのような病状をunderlyメカニズムを研究するために、表現型の方法は、それを病理学的変化を定量化することが必要とされている。換気力学が測定されている多くのマウス試験がありますが、これらの測定値は一般的に、通常、ヒトで行われ、肺機能の標準的評価とは無関係である。マウスおよびヒト対象において同等の測定を実行する能力は、ヒト疾患のマウスモデルの結果の翻訳を容易にすることができるので、これは残念なことである。
ヒト被験体における最も一般的かつ容易に行われる測定の一つは、一酸化炭素（DLCO）-1,2-ための拡散能であるが、この測定は、まれにしかマウスモデルで行われていない。手順は、しばしば扱いにくいまたはreqができるので、それは3-7報告されているこれらの研究では、部分的には、何のフォローアップ研究が行われていない複雑な装置uire。別のアプローチは、意識のあるマウスにおけるCOの拡散を測定することができるという利点を有する定常状態のシステムにおいて、CO再呼吸法を使用することである。しかし、この方法は非常に煩雑であり、結果は、マウスの換気のレベル並びにO 2およびCO 2濃度8.9で変化することができる。これらの困難は、そのいくつかの利点にもかかわらず、マウスでは肺の病理を検出する能力を拡散する日常的な使用を妨げているように見える。
マウスにおいて、拡散能力の測定に伴う問題を回避するために、マウスでそれを測定するための簡単な手段の詳細については、最近10に報告されている。手続きはすぐにガスを触発全体に等しい体積をサンプリングすることによって汚染されていない肺胞ガスをサンプリングする困難な問題を排除します。非常に再現性のある測定では、この手順の結果は、パのホストに敏感である一酸化炭素（DFCO）用の拡散係数と呼ばれる肺の表現型のthologic変化。 （CO 9 / CO c）に /（Neが9 / Neとc）は、cおよび9添字注入校正ガスおよび9秒の息止め時間後に除去したガスの濃度を表す、 - DFCOこうして1のように計算されるそれぞれ。 DFCO 1はCOのない取り込みを反映していない完全なすべてのCOの摂取、及び0を反映して、0と1の間で変化する無次元の変数である。
この発表では、この拡散能測定を行う方法を示し、そしてどのようにそれが気腫、線維症、急性肺損傷、およびウイルスおよび真菌感染を含むほぼすべての既存のマウス肺疾患モデルの変更を文書化するために使用することができる。
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Protocol
注：すべての動物のプロトコルはジョンズ·ホプキンス大学動物実験委員会によって承認された。
1.動物の準備
- 以下のステップ2.3に概説されているようケタミンとキシラジンでそれらを麻酔により、DFCO測定に6 C57BL / 6対照マウスを準備します。
- 対照と同様の手順を使用して、表1に示す異なる肺病変を有する他のすべてのマウスを準備する。これらのモデルのそれぞれを確立するために必要な具体的な詳細は、関連文献に見出される。対照マウスと他の病理学的コホートのものは、年齢のすべての6-12週間です。
一酸化炭素に対する拡散係数の2.測定（DFCO）
- 窒素、酸素、ネオン、及び一酸化炭素のピークを測定する機械で供給されたガスクロマトグラフモジュールを設定する。このアプリケーションでは唯一のネオンとCOデータを使用する。
注：この装置は、分子のSを使用しています12.00ミクロンフィルム、320.00ミクロンID及び長さ10mで、キャリアガスとしてヘリウムを用いてカラムをIEVE。クロマトグラフカラムは、0.8ミリリットルの容量を持っていますが、我々は、サンプルとの接続配管の適切なクリアを確実にするために2ミリリットルを使用していました。 - 各実験日の開始時に、マウスからのサンプルの測定を行う前に、約0.5％のNeと、0.5％のCOを含むガス混合物バッグから直接の2mlサンプルを取り、空気バランスをとる、および較正するために、このサンプルを使用ガスクロマトグラフ。
- ケタミン（90ミリグラム/ kg）およびキシラジン（15ミリグラム/ kg）でマウスを麻酔し、反射運動の欠如によって麻酔を確認する。乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を適用します。 （非常に若いマウスでは成人で18 Gまたは20 G）スタブ針カニューレをマウスにTracheostomize。
注：DFCOは麻酔後に10分未満で完了し、すべての機械的な換気または他の手順の前にされている。 - 6週齢よりも大きいマウスでは3 mlシリンジtを使うO混合ガスバッグからのガス0.8mlの撤回。気管カニューレにシリンジを接続し、すぐに肺を膨らませる。メトロノームを使用して、9秒をカウントしてから、すぐに0.8ミリリットル（呼気）を撤回。
- この撤回0.8ミリリットルが室内空気との2ミリリットルに空気を吐き出さ希釈し、それは少なくとも15秒間休むことができます。その後、分析のためにガスクロマトグラフに全サンプルを注入する。
- この第DFCO試料を分析しながら、ガス混合バッグから第0.8ミリリットルでマウス肺を膨張し、最初のサンプルと同じでこのサンプルを処理する。 2 DFCO測定を平均化する。
注：0.8 mlの体積が非常に若いマウスの肺で測定を行うには大きすぎるので、2週齢の幼いマウスにおいて測定のために、0.4 mlの容量を使用する。これは、6週間以上経過したマウスの0.8容を使用することをお勧めし、0.4mlの容量がいくつかのマウスのために必要とされる場合、それは研究されてコホート内のすべてのマウスについて一貫して使用されるべきである。 - DFCOを計算（9 CO / CO c）は/（Neが9 / Neとc）は、cおよび9添字注入校正ガスの濃度は、それぞれ、9秒の息止め時間後に除去したガスを参照する- 1である。
- 分析し、一方向ANOVAとの差を比較し、すべてのコホートマウスにおける多重比較のためのテューキーの補正との有意水準を評価する。 P <0.05として重要な価値を考えてみましょう。
注：ここで使用したマウスのすべてがここで報告されていない肺換気、力学、肺洗浄液、または組織学のいくつかのその後の測定を伴う実験研究の一部であった。この方法は、対照マウスに上記行ったように、すべての実験モデルにおいて同様であるのでさらに、種々の病理学的モデルからの結果のみを提示する。これらのモデルの詳細については、補足表に示されている。 - 深いanestheにより動物を安楽死させるチック過剰摂取は、頸椎脱臼または断頭が続く。必要な場合には、さらに生物学的または組織学的処理および分析のために死亡したマウスからの肺細胞および/または組織を取り除く。
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Representative Results
図1は、アスペルギルス属およびインフルエンザ感染症の両方に有意な減少、ならびに線維症の有意な減少、気腫、急性があったグループA、B、C、D、Eにおける成体マウスからDFCO測定値を示しており、F.肺損傷モデル。 図2に、2-6週間のマウスの年齢などの経時DFCOでグループG発達的変化を示している。この時間経過にわたって肺の発達と、わずかではあるが有意な増加があった。小さな膨張量を使用することの効果は、6週間の時点で非常に明らかであった。そこにわずかに高いDFCOを持っている女性の傾向があったが、これは5週の時点でのみ有意であった。
| グループ | 病状または状態 | 注釈 |
| A | C57BL / 6コントロール（8-10週間）において、n = 6 | 健康なマウス</ TD> |
| B | C57BL / 6マウスを、鼻腔内インフルエンザウイルス（PR8）の25 TCID50を与えられ、nは10 | インフルエンザモデル、6,8日後に感染を研究 |
| ℃ | のC57Bl / 6マウスに、5.4 U膵臓エラスターゼ気管内に与えられ、nは6 | 肺気腫モデル10,13は 21日エラスターゼチャレンジ後に研究 |
| D | C57BL / 6マウスに0.05 Uブレオマイシン気管内に与えられ、nは6 | 線維症モデル14は、ブレオマイシンチャレンジ後の14日に研究 |
| E | CFTRヌルコントロールとアスペルギルス·フミガタス （ひずみAF293）のエアロゾル吸入に感染したもの、N = 6 | 真菌感染モデル11,17は、真菌感染後12日目に研究 |
| F | を3μg/ gでのBWのLPS（ 大腸菌 ）与えられたC57BL / 6マウスの気管内にはn = 6 | 研究された急性肺損傷（ALI）モデル15LPSの侮辱後の1日目と4日 |
| G | 各年齢でC57BL生後2〜6週で/ 6雄マウス、N = 5 | 肺の開発モデル |
表1：DFCOが測定された別のマウスモデルのリスト。
図1：コントロールC57BL / 6マウス（グループA）および5つの異なる病理学的モデルのそれぞれにおけるDFCO測定示さ21日気管エラスターゼ後、6,8日PR8インフルエンザ（グループB）の後の結果である（グループC）、14日気管内ブレオマイシン（グループD）の後、12日後のLPS点滴注入（グループF）の後のCFTR欠損マウス（グループE）、及び1と4日でアスペルギルス感染後に。 * P <コントロール対 0.01を示し、＃6との間でP <0.01を示し、8日間のインフルエンザマウスおよび1及び4日LPSマウス、および+は、P <0.05 対対照を示す。
図2：生後6週2〜からの雄性C57BL / 6マウスにおけるDFCOの測定（グループG）測定は0.4ミリリットルの膨張体積を有するすべてのマウスで行われた、と6週齢のマウスに第二の測定だった。 0.8ミリリットルで作られた。 0.4ミリリットルの体積で、4、5、及び6週（P <0.05）での2週間の雄及びそれらの間のDFCOの有意な増加があった。
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Discussion
本研究では、マウス肺の能力を交換するガスを定量化するための新しいメトリックを定義した。このメトリックは、拡散能、すなわち、肺の主要な機能を測定する一般的な臨床測定、ガスを交換する能力に類似している。拡散容量は、簡単かつ迅速に、マウスおよびヒトの両方で行うことができる唯一の肺の機能的測定である。マウスにおける肺疾患の検出のために、主要な目的は、対照群と実験コホート間の肺機能の変化を定量化することである。この目標を達成するために、我々は定義され、肺の発達と機能的変化を含むマウスにおける肺疾患の最も一般的なモデルのほとんどにおいて表現型の変化を、quanitfyingする能力を実証するDFCOを利用している。
マウスではDFCO測定を簡素化アプローチに固有の一つの仮定は、解剖学的および機器のデッドスペースに混合されていないインスピレーションガスの影響がIGNであるということです論理和。しかし、以前に10を説明し、0.8ミリリットルインフレボリュームの使用はすべての測定で、小さいながらも一貫性のあるエラーを紹介します。この誤差の大きさは、膨張及びデッドスペースボリュームの相対的な大きさの関数である。単に注射器を密封し、ガス移送を容易にするために、指先を使用して、本発明の方法では、このエラーは、ストップコックまたはTコネクタ内のデッドスペースを排除することによって最小化され、ビデオのように。この手順は、測定間の再現性が得られる。若齢マウスで必要小さな膨張量の効果は、最初の0.4ミリリットル試験は直ちに各マウスで0.8ミリリットルの試験を行った。図2に示した6週齢のマウスにおいて明らかにされている。 0.8ミリリットルでDFCO値は、他の群のC57BL / 6マウスでの範囲であったが、0.4ミリリットルの測定が一貫して小さい。これは事実の直接の現れであることを小さな体積で、recoveredは9秒のサンプルだけ制御ガス濃度から成るデッドスペースの空気のより多くの部分を有している。このことは、近いNeの濃度の変化を持ってくるCO濃度の小さい分数変化として現れる。 CO /ネオンの割合が増加すると、計算されたDFCO（1 - この比率が）したがって、小さくなっている。
図1に示す肺の病理学の多くのモデルでは、DFCOで観察された有意な減少があった。 DFCOがこれらの異なるモデルで減少する理由しかし、いくつかの異なる理由があります。ブレオマイシンの単回投与によって引き起こされる線維症、炎症および容量16拡散の減少をもたらす拡散障壁の肥厚がある。肺気腫では、表面積の損失は、直接拡散表面積及び破壊の壁にあった毛細血管中の血液量の両方を減少させる働きがある。 elastasとの用量 - 応答関係ないeは、ここに提示されますが、未発表データは、気腫性損傷のレベルにDFCOの良好な相関を示している。インフルエンザ感染と、拡散障壁の肥厚および肺の連結換気されていない領域の増加の両方の結果として可能性拡散能力がある減少する。ここで使用PR8インフルエンザモデルでは、これは（8日目でのDFCOのさらなる有意な減少に反映されるように）時間をかけて悪化し、マウスは、一般的にCFTR欠損マウスでは10日目付近で死ぬ、小さいDFCOはベースラインであったC57BL6·コントロールとの構造的な違いがあるかもしれませんので、しかし、これらのマウスは、混合遺伝的背景17日に行われます。しかし、アスペルギルス感染はDFCOにおけるより実質的な有意な減少を引き起こし、および真菌感染症この減少の理由は、おそらくインフルエンザと同様である。大幅にディの浮腫性肥厚からそう、DFCO減の原因となる急性炎症におけるLPS結果ffusion障壁と流体を充填肺の換気されていない地域。使用されるLPSの投与量で、DFCOの低下は4日目または5で最大であり、その後10日目による制御に戻る回復する（データは示さず）。
若いマウスでは肺の成長とDFCOの変化の分析のために、0.4ミリリットルインフレボリュームは明らかに再現可能な測定を可能にした、と肺に達した大人の成熟度などの容量（ 図2）の拡散が遅いな増加を示すことができた。計算されたDFCO減少に小さい0.4ミリリットルの膨張容積を使用する効果は期待されたものもあるが、より大きな0.8ミリリットル容積が小さいマウスで使用することができない。しかし、開発または病理学的な変化は、依然としてさえ0.4ミリリットル容量で再現可能に検出可能であるべきである。
結論として、このビデオ及び添付の原稿は、ヒトにおいて測定することができるものと類似しているマウスにおいて機能的測定値を取得する方法を示している。メトリックは、Aを反映している最も一般的に研究の病状によって引き起こされる肺の構造変化の様々なガスを交換する肺のビリティ。一酸化炭素（DFCO）のためにこの拡散係数は、再現性の高い、と若いまたは古いマウスでは最も実験的に誘発する病状との機能と構造変化を検出するのに十分な感度である。それは肺疾患を評価するために、ヒトで行わ同様の測定に直接類似しているという事実は、それをマウス肺の病理をphenytypeするために非常に関連するメトリックを取得するための簡単な方法となる。
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Disclosures
利害の対立はなく、開示することは何もない。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gas Chromatograph | Inficon | Micro GC Model 3000A | Agilent makes a comparable model |
| 18 G Luer stub needle | Becton Dickenson | Several other possible vendors | |
| 3 ml plastic syringe | Becton Dickenson | Several other possible vendors | |
| Polypropylene gas sample bags | SKC | 1 or 2 L capacity works well | Other gas tight bags will work well |
| Gas tank, 0.3% Ne, 0.3% CO, balance air; (size ME) | Airgas, Inc | Z04 NI785ME3012 | This is the standard mixture used for DLCO in humans |
| 25 TCID50/mouse of influenza virus A/PR8 diluted in phosphate buffered saline. | |||
| Porcine pancreatic elastase | Elastin Products, Owensville, MO | 5.4 U | |
| Bleomycin | APP Pharmaceuticals, Schaumburg, IL | 0.25 U | |
| Escherichia coli LPS | Sigma L2880 | 3 μg/g body weight; O55:B5 | |
| Aspergillus fumigatus (isolate Af293) conidia were collected from mature colonies grown on potato dextrose agar. |
References
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