Abstract
El ratón es ahora el animal principal utilizada para modelar una variedad de enfermedades pulmonares. Para estudiar los mecanismos que subyacen a este tipo de patologías, se necesitan métodos fenotípicos que pueden cuantificar los cambios patológicos. Además, para proporcionar relevancia de traslación a los modelos de ratón, tales medidas deben ser las pruebas de que se puede hacer fácilmente en los seres humanos y ratones. Desafortunadamente, en el presente literatura pocas mediciones fenotípicas de la función pulmonar tienen aplicación directa a los seres humanos. Una excepción es la capacidad de difusión del monóxido de carbono, que es una medida que se realiza de forma rutinaria en los seres humanos. En el presente informe se describe un medio para medir de forma rápida y sencilla esta capacidad de difusión en ratones. El procedimiento consiste en breve la inflación pulmonar con gases trazadores en un ratón anestesiado, seguido de una 1 min tiempo de análisis de gas. Hemos probado la capacidad de este método para detectar varias patologías pulmonares, incluyendo el enfisema, fibrosis, lesión pulmonar aguda, y la influenza yinfecciones pulmonares por hongos, así como el seguimiento de maduración pulmonar en los cachorros. Los resultados muestran una disminución significativa en todas las patologías pulmonares, así como un aumento en la capacidad de difusión con la maduración pulmonar. Esta medición de la capacidad de difusión del pulmón por lo tanto proporciona una prueba de la función pulmonar que tiene una amplia aplicación con su capacidad para detectar cambios estructurales fenotípicas con la mayoría de los modelos patológicos pulmonares existentes.
Introduction
El ratón es ahora el animal principal utilizada para modelar una variedad de enfermedades pulmonares. Para el estudio de los mecanismos que subyacen en estas patologías, se necesitan métodos fenotípicos que pueden cuantificar el que los cambios patológicos. Aunque hay muchos estudios en ratones donde se miden la mecánica de ventilación, estas mediciones son generalmente no relacionada con las evaluaciones estándar de la función pulmonar hace normalmente en seres humanos. Esto es lamentable, ya que la capacidad de realizar mediciones equivalentes en ratones y seres humanos puede facilitar la traducción de los resultados en modelos de ratón de la enfermedad humana.
Una de las medidas más comunes y fácilmente realizados en sujetos humanos es la capacidad de difusión del monóxido de carbono (DLCO) 1,2, pero esta medida ha rara vez sólo ha hecho en modelos de ratón. En los estudios donde se ha reportado 3-7, no ha habido estudios de seguimiento, en parte debido a que los procedimientos son a menudo difíciles de aplicar o pueden reqUIRE equipos complejos. Otro enfoque consiste en utilizar un método de CO respiración del aire exhalado en un sistema en estado estacionario, que tiene la ventaja de ser capaz de medir la difusión de CO en ratones conscientes. Sin embargo, este método es muy engorroso, y los resultados pueden variar con el nivel de ventilación del ratón, así como O 2 y CO 2 concentraciones de 8,9. Estas dificultades parecen haber impedido el uso rutinario de la capacidad de difusión para detectar patologías pulmonares en ratones, a pesar de sus muchas ventajas.
Para evitar los problemas con la capacidad de difusión en ratones, los detalles de un simple medio para medirlo en ratones han sido recientemente reportado 10. El procedimiento elimina el difícil problema de muestreo de gas alveolar no contaminado por muestreo rápidamente un volumen igual a todo el gas inspirado. Este procedimiento resulta en una medida muy reproducible, denominado el factor de difusión para el monóxido de carbono (DFCO), que es sensible a una serie de pathologic cambios en el fenotipo de pulmón. El DFCO se calcula como 1 - (CO 9 / CO c) / (Ne 9 / Ne c), donde el C y 9 subíndices se refieren a concentraciones de los gases de calibración inyectado y los gases eliminados después de un tiempo de 9 segundos apnea, respectivamente. DFCO es una variable sin dimensiones, que varía entre 0 y 1, donde 1 refleja la absorción completa de todos CO, y 0 refleja ausencia de captación de CO.
En esta presentación se muestra cómo hacer que esta medida la capacidad de difusión, y la forma en que se puede utilizar para documentar los cambios en casi todos los modelos de enfermedad de pulmón de ratón existentes, incluyendo el enfisema, fibrosis, lesión pulmonar aguda y las infecciones víricas y fúngicas.
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Protocol
NOTA: Todos los animales protocolos fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad Johns Hopkins y Uso.
1. Preparación de los animales
- Preparar los ratones C57BL / 6 6 de control para la medición DFCO, anestesiando con ketamina y xilazina como se indica en el paso 2.3.
- Preparar todos los otros ratones con las diferentes patologías pulmonares que se muestran en la Tabla 1 utilizando el mismo procedimiento que para los controles. Los detalles específicos necesarios para establecer cada uno de estos modelos se encuentran en las referencias pertinentes. Los ratones de control y los de las otras cohortes patológicos son todos de 6-12 semanas de edad.
2. Medición del Factor de Difusión de monóxido de carbono (DFCO)
- Configure el módulo cromatógrafo de gas suministrado con la máquina para medir picos de nitrógeno, oxígeno, neón, y monóxido de carbono. Para este uso de la aplicación sólo los datos de neón y CO.
NOTA: Este instrumento utiliza un s molecularescolumna IEVE con helio como gas portador, con un 12,00 micras película, 320.00 ID my 10 m de longitud. El cromatógrafo de columna tiene un volumen de 0,8 ml, pero se utilizó 2 ml para asegurar la compensación adecuada de los tubos de conexión con la muestra. - Al comienzo de cada día experimental, antes de realizar las mediciones de las muestras de los ratones, tomar una muestra de 2 ml directamente de una bolsa de mezcla de gas que contiene aproximadamente 0,5% Ne, 0,5% de CO, y equilibrar el aire, y utilizar esta muestra para calibrar el cromatógrafo de gases.
- Anestesiar a los ratones con ketamina (90 mg / kg) y xilazina (15 mg / kg), y confirmar la anestesia por la ausencia de movimiento reflejo. Aplique un ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad. Tracheostomize los ratones con una cánula de aguja talón (18 G en adultos o 20 G en ratones muy jóvenes).
NOTA: El DFCO se completa en menos de 10 min después de la anestesia y antes de cualquier ventilación mecánica u otros procedimientos. - En los ratones de más de 6 semanas de edad, utilizar una jeringa de 3 ml to retirar 0,8 ml de gas de la bolsa de mezcla de gas. Conectar la jeringa a la cánula traqueal e inflar rápidamente el pulmón. El uso de un metrónomo, cuente 9 s, y luego rápidamente retirar los 0,8 ml (aire exhalado).
- Diluir esta retirados 0,8 ml aire exhalado a 2 ml con aire ambiental, deje reposar durante al menos 15 segundos. Se inyecta toda la muestra en el cromatógrafo de gases para su análisis.
- Mientras que el análisis de esta primera muestra de DFCO, inflar el pulmón de ratón con una segunda 0,8 ml de la bolsa de mezcla de gas, y luego procesar esta muestra idéntica a la primera muestra. La media de los dos mediciones DFCO.
NOTA: Para las mediciones en ratones de tan sólo 2 semanas de edad, use un volumen de 0,4 ml, desde 0,8 ml es un volumen demasiado importante para hacer mediciones en los pulmones de los ratones muy jóvenes. Es mejor utilizar el volumen de 0,8 ml para los ratones de más edad de 6 semanas, y que si se necesita el volumen de 0,4 ml para algunos ratones, que debe ser usado consistentemente para todos los ratones en la cohorte se está estudiando. - Calcular DFCOcomo 1 - (CO 9 / CO c) / (Ne 9 / Ne c), donde C y 9 subíndices se refieren a las concentraciones de los gases de calibración inyectadas y los gases eliminados después de un 9 seg tiempo en apnea, respectivamente.
- Analizar y comparar las diferencias con un ANOVA de una vía y evaluar el nivel de significación con la corrección de Tukey para comparaciones múltiples en todos los ratones de cohortes. Considere p <0,05 valor como significativo.
NOTA: Todos los ratones utilizados aquí fueron parte de los estudios experimentales que involucran varias mediciones posteriores de ventilación pulmonar, la mecánica, lavado pulmonar, o la histología, que no se reportan aquí. Además, ya que el método es el mismo en todos los modelos experimentales como se hizo anteriormente en los ratones de control, sólo se presentan los resultados de los diversos modelos patológicos. Para más información sobre estos modelos se presenta en la tabla suplementaria. - La eutanasia a los animales por anesthe profundasobredosis tic seguido por dislocación cervical o decapitación. Cuando sea necesario, eliminar las células y / o tejidos pulmonares de los ratones muertos para más biológico o procesamiento histológico y análisis.
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Representative Results
La Figura 1 muestra las mediciones DFCO de los ratones adultos en los grupos A, B, C, D, E, y F. No hubo disminuciones significativas tanto con las infecciones por Aspergillus y la gripe, así como una disminución significativa en la fibrótica, enfisematosa, y aguda modelos de lesión pulmonar. La Figura 2 muestra los cambios en el desarrollo del Grupo G en DFCO lo largo del tiempo como la edad los ratones de 2-6 semanas. Hubo un aumento ligero pero significativo con el desarrollo del pulmón durante este curso de tiempo. El efecto de utilizar un volumen de inflado más pequeño también fue bastante evidente en el punto de tiempo de 6 semanas. Hubo una tendencia para que las hembras tienen un DFCO ligeramente superior, pero esto sólo fue significativa en el punto de tiempo de 5 semanas.
| Grupo | Patología o Condición | Comentarios |
| La | C57BL / 6 controles (8-10 semanas), n = 6 | Ratones sanos </ Td> |
| B | C57BL / 6 ratones recibieron 25 TCID50 de virus de influenza A (PR8) por vía intranasal, n = 10 | Modelo Gripe estudiado 6 y 8 días después de la infección |
| C | C57BL / 6 ratones que recibieron 5,4 U elastasa pancreática por vía intratraqueal, n = 6 | Modelo Enfisema 10,13 estudió 21 después del reto elastasa |
| D | C57BL / 6 ratones que recibieron 0,05 U bleomicina por vía intratraqueal, n = 6 | Modelo Fibrosis 14 estudió 14 días después del desafío bleomicina |
| E | CFTR nulos controles y los infectados con la inhalación de aerosoles de Aspergillus fumigatus (AF293 cepa), n = 6 | Modelo de infección por hongos 11,17 estudió 12 días después de la infección por hongos |
| F | C57BL / 6 ratones que recibieron 3 mg LPS / g de peso corporal (Escherichia coli) por vía intratraqueal, n = 6 | Modelo agudo de pulmón Lesiones (ALI) 15 estudiólos días 1 y 4 después del insulto LPS |
| G | C57BL / 6 ratones machos de 2 a 6 semanas de edad, n = 5 en cada edad | Modelo de desarrollo de pulmón |
Tabla 1: Listado de los diferentes modelos de ratón que se midió el DFCO.
Figura 1:. Medición de DFCO en el control de ratones C57BL / 6 ratones (Grupo A) y en cada uno de los 5 modelos patológicos diferentes Se muestran los resultados de 6 y 8 días después de la gripe PR8 (Grupo B), 21 días después de la elastasa intratraqueal (Grupo C), 14 días después de bleomicina intratraqueal (Grupo D), 12 días después de la infección por Aspergillus en los ratones nulos CFTR (Grupo E), y 1 y 4 días después de la instilación LPS (Grupo F). El * indica P <0,01 vs. control, el # indica P <0,01 entre el 6 y8 ratones influenza día y los ratones 1 y 4 días de LPS, y el + indica P <0,05 frente al control.
Figura 2: Medición de DFCO en el macho C57BL / 6 ratones de 2 a 6 semanas de edad (Grupo G) Las mediciones se realizaron en todos los ratones con un volumen de inflado de 0,4 ml, y en el 6 semanas de edad ratones una segunda medición se. hecho con 0,8 ml. Con el volumen de 0,4 ml, hubo aumentos significativos en DFCO entre el macho de 2 semanas y los de 4, 5 y 6 semanas (P <0,05).
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Discussion
En el presente trabajo, hemos definido una nueva métrica para cuantificar la capacidad de intercambio de gases del pulmón de ratón. Esta métrica es análoga a la capacidad de difusión, una medición clínica común que mide la función principal del pulmón, es decir, su capacidad de intercambio de gases. La capacidad de difusión es la única medida funcional de pulmón que se puede hacer fácil y rápidamente tanto en ratones y seres humanos. Para la detección de la enfermedad pulmonar en ratones, un objetivo importante es cuantificar los cambios en la función pulmonar entre el control y cohortes experimentales. Para lograr este objetivo, se han definido y utilizado la DFCO para demostrar su capacidad de quanitfying cambios fenotípicos en la mayoría de los modelos más comunes de la enfermedad de pulmón en ratones, incluyendo los cambios funcionales con el desarrollo pulmonar.
Una suposición inherente en el enfoque que simplifica la medición DFCO en ratones es que el efecto de gas inspirado sin mezclar en el espacio muerto anatómico y equipo es IGNORed. Sin embargo, como se ha descrito previamente 10, el uso del volumen de inflado 0,8 ml introduce un pequeño error, pero consistente en todas las mediciones. La magnitud de este error es una función de los tamaños relativos de la inflación y volúmenes de espacio muerto. En el presente enfoque, este error se minimiza mediante la eliminación de espacio muerto en llaves de paso o conectores en T, y como se muestra en el video, simplemente utiliza un dedo para sellar la jeringa y facilitar la transferencia de gas. Este procedimiento da como resultado una alta repetibilidad entre las mediciones. El efecto del volumen de inflación más pequeño requerido en los jóvenes ratones se aclara en las 6 semanas de edad ratones mostrados en la Figura 2, donde la prueba inicial de 0,4 ml fue seguido inmediatamente con un ensayo de 0,8 ml en cada ratón. Con 0,8 ml el valor DFCO en estaba en el intervalo de C57BL / 6 ratones en los otros grupos, pero la medición con 0,4 ml es consistentemente menor. Esta es una manifestación directa del hecho de que con el volumen más pequeño, el recovered 9 muestra sec tiene una mayor fracción del aire de espacio muerto, que sólo consiste en las concentraciones de gas de control. Este hecho se manifiesta como un cambio fraccional más pequeña en la concentración de CO, que lo acerca el cambio en la concentración Ne. Con una mayor proporción de CO / Ne, el DFCO calculado (1 - esta relación) es, pues, más pequeño.
En los muchos modelos de patología pulmonar se muestran en la Figura 1, hubo significativas disminuciones observadas en DFCO. Sin embargo, hay varias razones por las cuales la DFCO disminuye en estos diferentes modelos. En la fibrosis causada por la dosis única de la bleomicina, hay inflamación y un engrosamiento de la barrera de difusión que conduce a una reducción en la capacidad de difusión 16. En el enfisema, hay una pérdida de área superficial actúa directamente para disminuir tanto el área de superficie para la difusión y el volumen de sangre en los capilares que había estado en las paredes destruidas. No hay relaciones dosis-respuesta con los elastase se presentan aquí, pero los datos no publicados muestran una buena correlación de la DFCO con el nivel de daño enfisematosa. Con la infección de la gripe, se reduce la capacidad de difusión probablemente como resultado tanto de un engrosamiento de la barrera de difusión y un aumento en las regiones sin ventilación consolidados de pulmón. En el modelo de la gripe PR8 utilizado aquí, esto empeora con el tiempo (como se refleja en el ulterior disminución significativa en DFCO en el día 8), y los ratones mueren generalmente en torno a día 10. En los ratones nulos CFTR, hubo una DFCO más pequeña en la línea de base , pero estos ratones se hacen sobre una mezcla de antecedentes genéticos 17, por lo que puede haber diferencias estructurales con los controles C57BL6. Sin embargo, la infección por Aspergillus provocó una disminución significativa más sustancial en DFCO, y las razones de esta disminución con la infección por hongos son probablemente similares a los de la influenza. Los resultados de LPS en la inflamación aguda que causa una disminución significativa DFCO, probablemente de engrosamiento edematoso de la dibarrera ffusion y regiones sin ventilación de los pulmones llenos de líquido. Con la dosis de LPS utilizado, la disminución en DFCO es mayor en días 4 o 5 y luego se recupera de nuevo a control por parte de 10 días (datos no mostrados).
Para el análisis de los cambios en DFCO con el crecimiento pulmonar en los ratones jóvenes, el volumen de inflado de 0,4 ml permitió claramente mediciones reproducibles, y fue capaz de mostrar un lento aumento en la capacidad de difusión como el pulmón alcanzado la madurez adulta (Figura 2). El efecto de utilizar un volumen de inflado 0,4 ml más pequeño en la disminución de la DFCO calculado es también lo que se esperaba, pero la más grande 0,8 ml de volumen no se puede utilizar en los ratones más pequeños. Pero los cambios con el desarrollo o la patología aún debe ser reproducible detectable incluso con el volumen de 0,4 ml.
En conclusión, el vídeo y el manuscrito adjunto muestra cómo obtener una medición funcional en ratones que es similar a lo que puede ser medido en los seres humanos. La métrica refleja la unabilidad del pulmón para el intercambio de gas con una variedad de cambios estructurales pulmonares causadas por las patologías más comúnmente estudiadas. Este factor de difusión para el monóxido de carbono (DFCO) es altamente reproducible, y lo suficientemente sensible para detectar cambios funcionales y estructurales con patologías más inducidos experimentalmente en ratones jóvenes o viejos. El hecho de que es directamente análoga a las mediciones análogas efectuadas en los seres humanos para evaluar la enfermedad pulmonar, hace que sea una forma simple de obtener una métrica muy relevante para phenytype patologías de pulmón de ratón.
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Disclosures
No hay conflictos de interés, y nada que revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gas Chromatograph | Inficon | Micro GC Model 3000A | Agilent makes a comparable model |
| 18 G Luer stub needle | Becton Dickenson | Several other possible vendors | |
| 3 ml plastic syringe | Becton Dickenson | Several other possible vendors | |
| Polypropylene gas sample bags | SKC | 1 or 2 L capacity works well | Other gas tight bags will work well |
| Gas tank, 0.3% Ne, 0.3% CO, balance air; (size ME) | Airgas, Inc | Z04 NI785ME3012 | This is the standard mixture used for DLCO in humans |
| 25 TCID50/mouse of influenza virus A/PR8 diluted in phosphate buffered saline. | |||
| Porcine pancreatic elastase | Elastin Products, Owensville, MO | 5.4 U | |
| Bleomycin | APP Pharmaceuticals, Schaumburg, IL | 0.25 U | |
| Escherichia coli LPS | Sigma L2880 | 3 μg/g body weight; O55:B5 | |
| Aspergillus fumigatus (isolate Af293) conidia were collected from mature colonies grown on potato dextrose agar. |
References
- Ogilvie, C. M., Forster, R. E., Blakemore, W. S., Morton, J. W. A standardized breath holding technique for the clinical measurement of the diffusing capacity of the lung for carbon monoxide. J Clin Invest. 36 (1 Pt 1), 1-17 (1957).
- Miller, A., Warshaw, R., Nezamis, J. Diffusing capacity and forced vital capacity in 5,003 asbestos-exposed workers: Relationships to interstitial fibrosis (ILO profusion score) and pleural thickening. Am J Ind Med. 56 (12), 1383-1393 (2013).
- Enelow, R. I., et al. Structural and functional consequences of alveolar cell recognition by CD8(+) T lymphocytes in experimental lung disease. J Clin Invest. 102 (9), 1653-1661 (1998).
- Hartsfield, C. L., Lipke, D., Lai, Y. L., Cohen, D. A., Gillespie, M. N. Pulmonary mechanical and immunologic dysfunction in a murine model of AIDS. Am J Physiol. 272 (4 Pt 1), 699-706 (1997).
- Wegner, C. D., et al. Intercellular adhesion molecule-1 contributes to pulmonary oxygen toxicity in mice: role of leukocytes revised. Lung. 170 (5), 267-279 (1992).
- Reinhard, C., et al. Inbred strain variation in lung function. Mamm Genome. 13 (8), 429-437 (2002).
- Sabo, J. P., Kimmel, E. C., Diamond, L. Effects of the Clara cell toxin, 4-ipomeanol, on pulmonary function in rats. J Appl Physiol. 54 (2), 337-344 (1983).
- Depledge, M. H. Respiration and lung function in the mouse, Mus musculus (with a note on mass exponents and respiratory variables). Respir Physiol. 60 (1), 83-94 (1985).
- Depledge, M. H., Collis, C. H., Barrett, A. A technique for measuring carbon monoxide uptake in mice. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 7 (4), 485-489 (1981).
- Fallica, J., Das, S., Horton, M. R., Mitzner, W. Application of Carbon Monoxide Diffusing Capacity in the Mouse Lung. J Appl Physiol. 110 (5), 1455-1459 (2011).
- Chaudhary, N., Datta, K., Askin, F. B., Staab, J. F., Marr, K. A. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator regulates epithelial cell response to Aspergillus and resultant pulmonary inflammation. Am J Respir Crit Care Med. 185 (3), 301-310 (2012).
- Foster, W. M., Walters, D. M., Longphre, M., Macri, K., Miller, L. M. Methodology for the measurement of mucociliary function in the mouse by scintigraphy. J Appl Physiol. 90 (3), 1111-1117 (2001).
- Yildirim, A. O., et al. Palifermin induces alveolar maintenance programs in emphysematous mice. Am J Respir Crit Care Med. 181 (7), 705-717 (2010).
- Collins, S. L., Chan-Li, Y., Hallowell, R. W., Powell, J. D., Horton, M. R. Pulmonary vaccination as a novel treatment for lung fibrosis. PLoS One. 7 (2), e31299 (2012).
- Alessio, F. R., et al. CD4+CD25+Foxp3+ Tregs resolve experimental lung injury in mice and are present in humans with acute lung injury. J Clin Invest. 119 (10), 2898-2913 (2009).
- Martinez, F. J., et al. The clinical course of patients with idiopathic pulmonary fibrosis. Ann Intern Med. 142 (12 Pt 1), 963-967 (2005).
- Zhou, L., et al. Correction of lethal intestinal defect in a mouse model of cystic fibrosis by human CFTR. Science. 266 (5191), 1705-1708 (1994).
