Abstract
Musen är nu den primära djuret som används för att modellera en mängd olika lungsjukdomar. För att studera de mekanismer som ligger bakom sådana sjukdomar är fenotypiska metoder behövs som kan kvantifiera de patologiska förändringar. Dessutom, för att ge translationell relevans för de musmodeller, bör sådana mätningar vara tester som lätt kan göras i både människor och möss. Tyvärr, i den nuvarande litteraturen några fenotypiska mätningar av lungfunktion har direkt på människor. Ett undantag är den diffunderande för kolmonoxid, vilket är ett mått som rutinmässigt görs i människor. I denna rapport beskriver vi ett sätt att snabbt och enkelt mäta detta spridande kapaciteten hos möss. Förfarandet innebär kort lung inflationen med spårgaser i en sövd mus, följt av en 1 min gasanalys tid. Vi har testat förmågan hos denna metod för att påvisa flera lung patologier, inklusive emfysem, fibros, akut lungskada, och influensa ochsvamplunginfektioner, samt övervakning lungmognad hos unga valpar. Resultaten visar en signifikant minskning av alla lung patologier, liksom en ökning av spridningskapaciteten med lungmognad. Denna mätning av lungdiffusekapacitet ger därmed ett lungfunktionstest som har bred tillämpning med sin förmåga att upptäcka fenotypiska strukturella förändringar med de flesta av de befintliga patologiska lungmodeller.
Introduction
Musen är nu den primära djuret som används för att modellera en mängd olika lungsjukdomar. För att studera de mekanismer som underliggande fastighets sådana patologier är fenotypiska metoder behövs som kan kvantifiera det de patologiska förändringar. Även om det finns många mus studier där ventilations mekanik mäts, dessa mätningar är i allmänhet inget samband med de vanliga bedömningarna av lungfunktionen som normalt görs i människor. Detta är olyckligt, eftersom förmågan att utföra motsvarande mätningar i möss och humana individer kan underlätta översättningen av resultaten i musmodeller för mänskliga sjukdomar.
En av de vanligaste och lätt gjort mätningar i mänskliga individer är diffuse för kolmonoxid (DLCO) 1,2, men denna mätning har sällan gjorts i musmodeller. I de studier där det har rapporterats 3-7, har det inte funnits några uppföljande studier, delvis på grund av att förfarandena är ofta besvärligt eller kan require komplicerad utrustning. Ett annat tillvägagångssätt är att använda en CO återandningsmetod i ett stabilt tillstånd system, som har fördelen av att kunna mäta CO diffusion i medvetna möss. Denna metod är emellertid mycket besvärligt, och resultaten kan variera med nivån på musens ventilation samt O 2 och CO 2 koncentrationer 8,9. Dessa svårigheter verkar ha utesluts rutinanvändning av diffuse förmåga att upptäcka lung patologier i möss, trots dess flera fördelar.
För att kringgå problemen med mätning av diffuse kapaciteten hos möss, att uppgifter om ett enkelt sätt mäta det i möss har nyligen rapporterat 10. Förfarandet eliminerar det svåra problemet med provtagning förorenat alveolär gas genom att snabbt sampla en volym som motsvarar hela inspirerade gasen. Denna procedur resulterar i en mycket reproducerbar mätning, kallas diffusion faktorn för kolmonoxid (DFCO), som är känslig för en mängd pathologic förändringar i lungan fenotypen. Den DFCO beräknas således som 1 - (CO 9 / CO c) / (Ne 9 / Ne c), där c och 9 index avser koncentrationer av kalibreringsgaserna som injicerats och gaserna bort efter en 9 sek andetag hålltid, respektive. DFCO är ett dimensionsvariabel, som varierar mellan 0 och 1, med 1 reflekterande komplett upptag av alla CO och 0 vilket betyder att inga upptag av CO.
I denna presentation visar vi hur du gör detta spridande kapacitetsmätning, och hur det kan användas för att dokumentera förändringar i nästan alla av de befintliga sjukdomsmodeller mus lung, inklusive emfysem, fibros, akut lungskada, och virala och svampinfektioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Alla djurprotokoll godkändes av Johns Hopkins University Djurvård och användning kommittén.
1. Animal Förberedelse
- Förbered 6 C57BL / 6 kontrollmöss för DFCO mätning, genom anesthetizing dem med ketamin och xylazin som beskrivs i steg 2.3 nedan.
- Förbered alla andra möss med olika lung patologier som visas i tabell 1 genom att använda samma procedur som för kontrollerna. Specifika detaljer som behövs för att fastställa var och en av dessa modeller finns i de relevanta referenser. Kontroll möss och de i andra patologiska kohorter är alla 6-12 veckors ålder.
2. Mätning av Diffusion Factor för Kolmonoxid (DFCO)
- Ställ in gaskromatograf modulen som medföljer maskinen för att mäta toppar för kväve, syre, neon, och kolmonoxid. För denna ansökan används endast neon och CO data.
OBS: Detta instrument använder en molekylär sieve kolonn med helium som bärgas, med en 12.00 pm film, 320.00 um-ID och 10 m längd. Den kromatograf kolonn har en volym på 0,8 ml, men vi använde 2 ml för att säkerställa tillräcklig clearing av den anslutande slangar med provet. - Vid början av varje experimentell dag, före att göra mätningar av proverna från mössen, ta ett 2 ml prov direkt från en gasblandning påse innehållande ca 0,5% Ne, 0,5% CO, och balansera luft och använda detta prov för att kalibrera gaskromatografen.
- Bedöva möss med ketamin (90 mg / kg) och xylazin (15 mg / kg), och bekräfta anestesi genom frånvaron av reflexrörelse. Applicera veterinär salva på ögonen för att förhindra torrhet. Tracheostomize mössen med en axel nålkanyl (18 G hos vuxna eller 20 G i mycket unga möss).
OBS! DFCO är klar på mindre än 10 minuter efter bedövning och före någon mekanisk ventilation eller andra förfaranden. - Hos möss som är större än 6 veckor, använd en 3 ml spruta to återkalla 0,8 ml gas från gasblandningen påsen. Anslut sprutan till trakealkanylen och snabbt blåsa upp lungan. Med hjälp av en metronom, räkna 9 sek, och sedan snabbt dra tillbaka 0,8 ml (utandningsluft).
- Späd detta indragna 0,8 ml utandningsluft till 2 ml med rumsluften, låt den vila i minst 15 sekunder. Sedan injicera hela provet in i gaskromatografen för analys.
- Medan analysera denna första DFCO prov, blåsa upp muslunga med en andra 0,8 ml från gasblandningen påsen, och sedan bearbeta detta prov identiskt med det första provet. Medelvärdet de två DFCO mätningarna.
NOTERA: För mätningar i möss så unga som två veckors ålder, använder en volym av 0,4 ml, eftersom 0,8 ml är en alltför stor kvantitet för att göra mätningar i lungor hos mycket unga möss. Det är bättre att använda 0,8 ml volym för möss äldre än 6 veckor, och att om det behövs för 0,4 ml volym för vissa möss, bör det användas konsekvent för alla möss i kohorten som studeras. - Beräkna DFCOsom 1 - (CO 9 / CO c) / (Ne 9 / Ne c), där c och 9 index avser koncentrationer av kalibreringsgaserna som injicerats och gaserna bort efter en 9 sek andetag hålltid, respektive.
- Analysera och jämföra skillnader med en envägs ANOVA och bedöma betydelsen nivån med Tukeys korrektion för multipla jämförelser i alla kohort mössen. Tänk p <0,05 som betydande värde.
OBS: Alla de möss som användes här var en del av experimentella studier med flera efterföljande mätningar av lungventilation, mekanik, lungsköljning eller histologi, som inte redovisas här. Eftersom metoden är densamma i alla experimentella modeller som gjordes ovan i kontrollmössen är bara resultaten från de olika patologiska modellerna presenteras. Ytterligare information om dessa modeller presenteras i kompletterande tabellen. - Euthanize djuren genom djupa anesthetic överdos följt av halsdislokation eller halshuggning. Där behövs, ta bort lungceller och / eller vävnader från de döda mössen för vidare biologiska eller histologisk bearbetning och analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar DFCO mätningarna från de vuxna möss i grupperna A, B, C, D, E, och F. Det fanns signifikanta minskningar med både Aspergillus och influensainfektioner samt betydande minskningar i fibrotiska, emphysematous och akut lungskada modeller. Figur 2 visar Grupp G utvecklings förändringar i DFCO över tiden som mössen ålder från 2-6 veckor. Det fanns en liten men signifikant ökning med lungutveckling under denna tidsförlopp. Effekten av att använda en mindre inflationsvolym var också ganska uppenbart vid 6 veckors tidpunkt. Det fanns en tendens till honorna att ha en något högre DFCO, men detta var bara signifikant vid 5 veckors tidpunkt.
| Grupp | Patologi eller skick | Kommentarer |
| EN | C57BL / 6 kontroller (8-10 veckor), n = 6 | Friska möss </ Td> |
| B | C57BL / 6 möss gett 25 TCID50 av influensa A-virus (PR8) intranasalt, n = 10 | Influensa modellen studerade sex och åtta dagar efter infektion |
| C | C57BL / 6 möss gett 5,4 U pankreaselastas intratrakealt, n = 6 | Emfysem modell 10,13 studerade 21 dagar efter elastas utmaning |
| D | C57BL / 6 möss gett 0,05 U bleomycin intratrakealt, n = 6 | Fibros modell 14 studerade 14 dagar efter bleomycin utmaning |
| E | CFTR null kontroller och som smittats med aerosol inandning av Aspergillus fumigatus (stam AF293), n = 6 | Svampinfektion modell 11,17 studerade 12 dagar efter svampinfektion |
| F | C57BL / 6 möss givna 3 | ig / g BW LPS (Escherichia coli) intratrakealt, n = 6 | Akut lungskada (ALI) modell 15 studeradedag 1 och 4 efter LPS förolämpning |
| G | C57BL / 6 hanmöss vid 2-6 veckors ålder, n = 5 vid varje ålder | Lung utvecklingsmodell |
Tabell 1: Lista över de olika musmodeller där DFCO mättes.
Figur 1:. Mätning av DFCO i kontroll C57BL / 6-möss (grupp A) och i varje av de fem olika patologiska modeller som visas är resultat sex och åtta dagar efter PR8 influensa (grupp B), 21 dagar efter intratrakeal elastas (grupp C), 14 dagar efter intratrakeal bleomycin (grupp D), 12 dagar efter Aspergillus-infektion i CFTR null möss (grupp E) och en och fyra dagar efter LPS instillation (grupp F). * Indikerar P <0,01 jämfört med kontroll, indikerar # P <0,01 mellan 6 och8 dagars influensa möss och de 1 och 4 dagars LPS möss och på + indikerar P <0,05 jämfört med kontroll.
Figur 2: Mätning av DFCO i manliga C57BL / 6-möss från 2 till 6 veckors ålder (grupp G) Mätningarna gjordes i alla möss med en inflationsvolym av 0,4 ml, och i 6 veckor gamla möss en andra mätning var. görs med 0,8 ml. Med 0,4 ml volym fanns signifikanta ökningar av DFCO mellan 2 veckors manliga och de på 4, 5, och 6 veckor (p <0,05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I föreliggande arbete, definierade vi en ny metrisk att kvantifiera gasen utbyter förmåga muslungan. Denna metriska är analogt med diffuse kapacitet, en gemensam klinisk mätning som mäter den primära funktionen av lungan, det vill säga dess förmåga att utbyta gas. Den diffunderande kapaciteten är den enda lunga funktionell mätning som kan enkelt och snabbt göras i både möss och människor. För detektering av lungsjukdom i möss, är ett viktigt mål att kvantifiera förändringar i lungfunktion mellan kontroll och experimentella kohorter. För att uppnå detta mål har vi definierat och utnyttjat DFCO att visa sin förmåga i quanitfying fenotypiska förändringar i de flesta av de vanligaste modellerna av lungsjukdom hos möss, inklusive funktionella förändringar med lungutveckling.
Ett antagande inneboende i synsätt som förenklar DFCO mätningen i möss är att effekten av oblandad inspirerad gas i anatomiska och utrustning dödutrymmet är ignORed. Emellertid, såsom tidigare beskrivits 10, användningen av 0,8 ml inflationsvolym introducerar en liten men konsekvent fel i alla mätningar. Storleken av detta fel är en funktion av de relativa storlekarna av inflation och döda rymdvolymer. I föreliggande strategi, är detta fel minimeras genom att eliminera den döda utrymmet i kranar eller T-kontakter, och som visas i videon, använder helt enkelt en fingertopp för att försegla sprutan och underlätta gas överföring. Detta förfarande resulterar i en hög repeterbarhet mellan mätningarna. Effekten av den mindre inflations volym som krävs i den unga möss klargörs i de 6 veckor gamla möss som visas i figur 2, där den initiala 0,4 ml prov följdes omedelbart med en 0,8 ml test i varje mus. Med 0,8 ml av DFCO värdet i var inom intervallet för C57BL / 6 möss i de andra grupperna, men mätningen med 0,4 ml är genomgående mindre. Detta är en direkt manifestation av det faktum att med den mindre volym, den recovered 9 sek prov har en större andel av det döda utrymmet luften, som just består av gaskoncentrationer kontroll. Detta faktum visar sig som en mindre relativa ändringen i CO-koncentration, som för den närmare förändringen i Ne koncentration. Med en ökad förhållandet CO / Ne, den beräknade DFCO (1 - detta förhållande) är alltså mindre.
I många modeller av lungpatologi som visas i figur 1, fanns det signifikanta minskningar observerade i DFCO. Emellertid finns det flera olika skäl till varför DFCO minskar i dessa olika modeller. I fibros orsakad av engångsdos av bleomycin, det finns inflammation och en förtjockning av diffusionsbarriären som leder till en minskning av diffuse kapaciteten 16. I emfysem, det är en förlust av yta verkar direkt för att minska både yta för diffusion och blodvolymen i kapillärerna som hade varit i de förstörda väggarna. Inga dos-respons relationer med elastase presenteras här, men opublicerade data visar en bra korrelation av DFCO med nivån av emfysematös skador. Med infektion influensa, är det reduceras diffusekapacitet sannolikt som en följd av både en förtjockning av diffusionsbarriären och en ökning i koncernens oventilerade regioner lunga. I modellen PR8 influensan som används här, förvärrar detta över tiden (vilket återspeglas i ytterligare signifikant minskning DFCO på dag 8), och mössen dör vanligtvis på runt dag 10. I CFTR null möss, fanns en mindre DFCO vid baslinjen , men dessa möss är gjorda på en blandad genetisk bakgrund 17, så det kan finnas strukturella skillnader med C57BL6 kontrollerna. Dock orsakade Aspergillus infektion en mer omfattande betydande minskning av DFCO, och skälen till denna nedgång med svampinfektion sannolikt liknar dem med influensa. De LPS resulterar i akut inflammation som orsakar en signifikant minskad DFCO, sannolikt från ödematös förtjockning av diffusion barriär och oventilerade regioner av lunga fyllda med vätska. Med dosen av LPS användes, är minskningen i DFCO störst vid dag 4 eller 5 och återvinner tillbaka till kontroll vid dag 10 då (data ej visade).
För analys av förändringar i DFCO med lungtillväxt i unga möss, de 0,4 ml inflationsvolym klart tillåtet reproducerbara mätningar, och kunde visa en långsam ökning av diffuse egenskap lungan nått vuxen mognad (Figur 2). Effekten av att använda en mindre 0,4 ml inflationsvolym i fallande den beräknade DFCO är också vad som förväntades, men den större 0,8 ml volym kan inte användas i de mindre möss. Men förändringar med utveckling eller patologi bör fortfarande vara reproducerbart detekteras även med 0,4 ml volym.
Sammanfattningsvis visar denna video och medföljande manuskript hur man får en funktionell mätning i möss som liknar vad som kan mätas i människor. Det metriska återspeglar enheten av lungan för att utbyta gas med en mängd olika lungstrukturförändringar som orsakas av de vanligast studerade patologier. Denna diffusion faktor för kolmonoxid (DFCO) är mycket reproducerbar och känslig nog för att upptäcka funktionella och strukturella förändringar med mest experimentellt inducerade sjukdomar hos unga eller gamla möss. Det faktum att det är direkt analog med liknande mätningar som gjorts på människor för att bedöma lungsjukdom, gör det ett enkelt sätt att få en mycket relevant metrisk att phenytype mus lung patologier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter, och inget att lämna ut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gas Chromatograph | Inficon | Micro GC Model 3000A | Agilent makes a comparable model |
| 18 G Luer stub needle | Becton Dickenson | Several other possible vendors | |
| 3 ml plastic syringe | Becton Dickenson | Several other possible vendors | |
| Polypropylene gas sample bags | SKC | 1 or 2 L capacity works well | Other gas tight bags will work well |
| Gas tank, 0.3% Ne, 0.3% CO, balance air; (size ME) | Airgas, Inc | Z04 NI785ME3012 | This is the standard mixture used for DLCO in humans |
| 25 TCID50/mouse of influenza virus A/PR8 diluted in phosphate buffered saline. | |||
| Porcine pancreatic elastase | Elastin Products, Owensville, MO | 5.4 U | |
| Bleomycin | APP Pharmaceuticals, Schaumburg, IL | 0.25 U | |
| Escherichia coli LPS | Sigma L2880 | 3 μg/g body weight; O55:B5 | |
| Aspergillus fumigatus (isolate Af293) conidia were collected from mature colonies grown on potato dextrose agar. |
References
- Ogilvie, C. M., Forster, R. E., Blakemore, W. S., Morton, J. W. A standardized breath holding technique for the clinical measurement of the diffusing capacity of the lung for carbon monoxide. J Clin Invest. 36 (1 Pt 1), 1-17 (1957).
- Miller, A., Warshaw, R., Nezamis, J. Diffusing capacity and forced vital capacity in 5,003 asbestos-exposed workers: Relationships to interstitial fibrosis (ILO profusion score) and pleural thickening. Am J Ind Med. 56 (12), 1383-1393 (2013).
- Enelow, R. I., et al. Structural and functional consequences of alveolar cell recognition by CD8(+) T lymphocytes in experimental lung disease. J Clin Invest. 102 (9), 1653-1661 (1998).
- Hartsfield, C. L., Lipke, D., Lai, Y. L., Cohen, D. A., Gillespie, M. N. Pulmonary mechanical and immunologic dysfunction in a murine model of AIDS. Am J Physiol. 272 (4 Pt 1), 699-706 (1997).
- Wegner, C. D., et al. Intercellular adhesion molecule-1 contributes to pulmonary oxygen toxicity in mice: role of leukocytes revised. Lung. 170 (5), 267-279 (1992).
- Reinhard, C., et al. Inbred strain variation in lung function. Mamm Genome. 13 (8), 429-437 (2002).
- Sabo, J. P., Kimmel, E. C., Diamond, L. Effects of the Clara cell toxin, 4-ipomeanol, on pulmonary function in rats. J Appl Physiol. 54 (2), 337-344 (1983).
- Depledge, M. H. Respiration and lung function in the mouse, Mus musculus (with a note on mass exponents and respiratory variables). Respir Physiol. 60 (1), 83-94 (1985).
- Depledge, M. H., Collis, C. H., Barrett, A. A technique for measuring carbon monoxide uptake in mice. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 7 (4), 485-489 (1981).
- Fallica, J., Das, S., Horton, M. R., Mitzner, W. Application of Carbon Monoxide Diffusing Capacity in the Mouse Lung. J Appl Physiol. 110 (5), 1455-1459 (2011).
- Chaudhary, N., Datta, K., Askin, F. B., Staab, J. F., Marr, K. A. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator regulates epithelial cell response to Aspergillus and resultant pulmonary inflammation. Am J Respir Crit Care Med. 185 (3), 301-310 (2012).
- Foster, W. M., Walters, D. M., Longphre, M., Macri, K., Miller, L. M. Methodology for the measurement of mucociliary function in the mouse by scintigraphy. J Appl Physiol. 90 (3), 1111-1117 (2001).
- Yildirim, A. O., et al. Palifermin induces alveolar maintenance programs in emphysematous mice. Am J Respir Crit Care Med. 181 (7), 705-717 (2010).
- Collins, S. L., Chan-Li, Y., Hallowell, R. W., Powell, J. D., Horton, M. R. Pulmonary vaccination as a novel treatment for lung fibrosis. PLoS One. 7 (2), e31299 (2012).
- Alessio, F. R., et al. CD4+CD25+Foxp3+ Tregs resolve experimental lung injury in mice and are present in humans with acute lung injury. J Clin Invest. 119 (10), 2898-2913 (2009).
- Martinez, F. J., et al. The clinical course of patients with idiopathic pulmonary fibrosis. Ann Intern Med. 142 (12 Pt 1), 963-967 (2005).
- Zhou, L., et al. Correction of lethal intestinal defect in a mouse model of cystic fibrosis by human CFTR. Science. 266 (5191), 1705-1708 (1994).
