Abstract
Fare hemen akciğer hastalıklarının çeşitli modellemek için kullanılan birincil bir hayvandır. Bu tür patolojiler altında yatan mekanizmaları incelemek için, fenotipik yöntemler patolojik değişiklikler ölçmek ki ihtiyaç vardır. Bundan başka, fare modelleri ile translasyon uygunluğu sağlamak için, bu ölçümlerin kolaylıkla hem insanlarda hem farelerde yapılabilir testler olmalıdır. Ne yazık ki, bu literatürde akciğer fonksiyonunun birkaç fenotipik ölçümleri insanlara doğrudan uygulama var. Tek istisna rutin insanlarda yapılan bir ölçüm olan karbon monoksit için difüzyon kapasitesi. Bu yazıda, hızlı ve basit farelerde bu difüzyon kapasitesini ölçmek için bir araç açıklar. Prosedür 1 dk gazı analizi zaman izlediği bir anestezi fare izleyici gazları ile kısa akciğer enflasyon, içerir. Bu amfizem, fibroz, akut akciğer yaralanması ve influenza da dahil olmak üzere pek çok akciğer hastalıkları, tespit etmek için bu yöntem yeteneğini test ettikmantar enfeksiyonları akciğer, yanı sıra genç yavrular izleme akciğer olgunlaşmasının. Sonuçlar önemli tüm akciğer patolojileri düşüşler yanı sıra, akciğer olgunlaşması ile difüzyon kapasitesinde bir artış göstermektedir. Akciğer difüzyon kapasitesi Bu ölçüm, böylece mevcut patolojik akciğer modellerinin çoğu ile fenotipik yapısal değişiklikleri tespit yeteneği ile geniş bir uygulama olan solunum fonksiyon testi sağlar.
Introduction
Fare hemen akciğer hastalıklarının çeşitli modellemek için kullanılan birincil bir hayvandır. Bu tür patolojiler altında yatan mekanizmaları incelemek için, fenotipik yöntemler bunu patolojik değişiklikler ölçmek ki ihtiyaç vardır. Havalandırma mekaniği ölçülür birçok fare çalışma olmasına rağmen, bu ölçümlerin genelde normal insanlarda yapılan akciğer fonksiyonunun standart değerlendirmelere ilgisiz. Bu insan hastalığı için fare modellerinde sonuçların çeviri kolaylaştırabilir fareler ve insan deneklerde eşdeğer ölçümleri gerçekleştirmek için yeteneği beri, talihsiz bir durumdur.
Insan deneklerde en yaygın ve en kolay yapılan ölçümlerin bir karbon monoksit (DLCO) 1,2 difüzyon kapasitesi olduğunu, ancak bu ölçüm sadece nadiren fare modellerinde yapılmıştır. Prosedürler genellikle hantal veya req olabilir çünkü 3-7 bildirilmiştir bu çalışmalarda, kısmen, hiçbir izlem çalışmaları olmuşturkarmaşık bir ekipmana uire. Başka bir yaklaşım bilinçli farelerde CO difüzyon ölçümü mümkün olmanın avantajına sahip bir sabit devlet sisteminde, bir CO, yeniden soluk yöntemi kullanmaktır. Ancak bu yöntem çok hantal ve sonuçları farenin havalandırma düzeyi yanı sıra O 2 ve CO 2 konsantrasyonları 8,9 ile değişebilir. Bu zorluklar onun çeşitli avantajlara rağmen, farelerde akciğer patolojileri tespit etmek difüzyon kapasitesi rutin kullanımını engellemiştir gibi görünüyor.
Farelerde difüzyon kapasitesi ölçümü ile ilgili sorunları aşmak için, basit araçlarla ayrıntıları farelerde ölçmek için son 10 bildirilmiştir. prosedür hızlı bir şekilde tüm ilham gaza eşit bir hacim örnekleyerek kirlenmemiş alveol gaz örnekleme zor sorunu ortadan kaldırır. Bir çok tekrarlanabilir ölçüm Bu prosedür sonuçları, pa bir dizi duyarlı karbon monoksit (DFCO), difüzyon faktörü olarak adlandırılanAkciğer fenotipinde thologic değişir. (CO 9 / CO c) / (Ne 9 / Ne c), c ve 9 indisler enjekte kalibrasyon gazların yoğunlaşması ve 9 sn nefes tutma süresinden sonra kaldırıldı gazlara bakın - DFCO böylece 1 olarak hesaplanır sırasıyla. DFCO 1 tüm CO tam alımını yansıtan ve 0 CO hiçbir alımını yansıtan, 0 ve 1 arasında değişen bir boyutsuz değişken vardır.
Bu sunumda bu difüzyon kapasitesi ölçümü yapmak için nasıl göstermek ve neredeyse tüm amfizem, fibrozis, akut akciğer hasarı, ve viral ve mantar enfeksiyonları dahil olmak üzere mevcut fare akciğer hastalığı modellerinin değişiklikleri belgelemek için nasıl kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Tüm hayvan protokolleri Johns Hopkins Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.
1. Hayvan hazırlanması
- Aşağıdaki adımda 2.3 belirtildiği gibi ketamin ve xylazin ile anestezi yoluyla, DFCO ölçümü için 6 C57BL / 6 fareler kontrol hazırlayın.
- Kontroller için olanla aynı yöntem kullanılarak, Tablo 1 'de gösterilen farklı akciğer patolojisi olan diğer tüm fareler hazırlayın. Bu modellerin her biri kurmak için gerekli belirli detaylar ilgili referanslar bulunmaktadır. Kontrol fareleri ve diğer patolojik kohortlarda bu çağın tüm 6-12 haftadır.
Karbon monoksit için Difüzyon Faktörü 2. ölçümü (DFCO)
- Azot, oksijen, neon, ve karbon monoksit için zirveleri ölçmek için makine ile birlikte verilen gaz kromatografisi modülünü kurmak. Bu uygulama için sadece neon ve CO veri.
NOT: Bu cihaz bir moleküler s kullanırBir 12.00 mikron film 320.00 mikron kimliği ve 10 metre uzunluğunda taşıyıcı gaz olarak helyum ile ieve sütunu. kromatografi kolonu 0.8 ml bir hacme sahiptir, fakat örnek ile bağlantı boruları yeterli temizleme sağlamak için 2 ml kullanıldı. - Her deney gününde başlangıcında, küçük farelerden gelen numuneler ölçümleri yapmadan önce, yaklaşık olarak% 0.5 Ne,% 0.5 CO ihtiva eden bir gaz karışımı, torbadan doğrudan 2 ml lik bir numuneyi almak ve hava denge ve kalibre etmek için bu örneği kullanmak Gaz kromatografisi.
- Ketamin (90 mg / kg) ve ksilazin (15 mg / kg) ile fareler anestezi ve refleks hareketinin olmaması ile anestezi teyit etmektedir. Kuruluğunu önlemek için gözleri veteriner merhem sürün. (Çok genç farelerde erişkinlerde 18 G veya 20 G) bir taslaktır iğne kanül ile fareler Tracheostomize.
NOT: DFCO anestezi sonrası en az 10 dakika tamamlandı ve herhangi bir mekanik havalandırma veya diğer prosedürler öncesinde olduğu. - 6 haftalıkken daha büyük farelerde, bir 3 ml'lik bir enjektör t kullanımıo gaz karışımı çantasından gaz 0,8 ml çekilme. Trakeal kanül için şırınga bağlayın ve hızlı bir şekilde akciğer şişirmek. Bir metronom kullanarak, 9 sn saymak, ve sonra hızlı bir şekilde 0.8 ml (üfledi hava) çekilme.
- Bu geri 0.8 mi oda havası ile 2 ml kadar nefes vermeyle oluşan seyreltin, en az 15 saniye boyunca dinlenmeye bırakın. Sonra analiz için gaz kromatografisinde içine bütün örnek enjekte.
- Bu ilk DFCO örneği analiz birlikte, gaz karışımı, torba, ikinci bir 0.8 ml fare akciğer şişirmek ve ilk örneğe benzer bu örnek işlem. İki DFCO ölçümleri ortalama.
Not: 0.8 ml hacmi çok küçük farelerin akciğerlerinde ölçümler yapmak için çok büyük olduğu için 2 haftalık olarak genç farelerde ölçümleri için, 0.4 ml bir hacim kullanılır. Bu 6 hafta daha yaşlı fareler için 0.8 ml hacmi kullanmak daha iyidir, ve 0.4 ml hacim bazı fareler için gerekli ise, bu çalışılan kohort tüm fareler için sürekli kullanılması gerektiğini söyledi. - DFCO hesaplayın(CO 9 / CO c) / (Ne 9 / Ne c), c ve 9 indisler enjekte kalibrasyon gazları konsantrasyonları sırasıyla, 9 saniye nefes tutma süresinden sonra kaldırıldı gazlara bakın - 1 olarak.
- Analiz ve tek yönlü ANOVA ile farklılıkları karşılaştırmak ve tüm kohort farelerde çoklu karşılaştırmalar için Tukey düzeltme ile anlamlılık düzeyini değerlendirmek. P <0.05 anlamlı olarak değerini düşünün.
NOT: Burada kullanılan farelerin tamamı burada rapor değil akciğer ventilasyonu, mekanik, akciğer lavaj veya histoloji birkaç sonraki ölçümleri içeren deneysel çalışmaların bir parçası idi. Yöntem, kontrol fareleri, yukarıda yapıldığı gibi her deneysel modellerde aynı olduğu için buna ek olarak, çeşitli patolojik modellerden sadece sonuçlar sunulmaktadır. Bu modellerde daha fazla bilgi ek tabloda yer almaktadır. - Derin anesthe tarafından hayvanları Euthanizetic aşırı doz servikal dislokasyon veya başları kesilerek izledi. Gerekli yerlerde, daha fazla biyolojik veya histolojik işleme ve analiz için ölü farelerin akciğer hücreleri ve / veya dokuları kaldırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1, var Aspergillus ve influenza enfeksiyonu hem önemli düşüşler, hem de fibrotik amfizematöz önemli düşüş vardı ve akut grupları A, B, C, D, E ve F yetişkin farelerden DFCO ölçümlerini göstermektedir Akciğer hasarı modelleri. Şekil 2 2-6 hafta fareler yaş olarak zamanla DFCO'da G Grubu gelişimsel değişiklikleri gösterir. Bu sefer boyunca akciğer gelişimi ile hafif fakat anlamlı bir artış vardı. küçük bir enflasyon hacmi kullanılarak etkisi de 6 haftalık bir zaman noktasında oldukça belirgin oldu. Orada kadın biraz daha yüksek bir DFCO olması için bir eğilim oldu, ama bu 5 haftalık bir zaman noktasında sadece anlamlıdır.
| Grup | Patoloji veya Durum | Yorumlar |
| Bir | C57BL / 6 kontroller (8-10 hafta), n = 6 | Sağlıklı fareler </ Td> |
| B | C57BL / 6 fareleri, intranazal grip A virüsü (PR8) olarak 25 TCID50 verilen, n = 10 | Grip modeli, 6 ve 8 gün incelenmiştir Enfeksiyondan |
| C | C57BL / 6 fareleri, 5.4 U pankreatik elastaz intratrakeal verilen n = 6 | Amfizem modeli 10,13 21 gün elastaz meydan okudu sonra |
| D | C57BL / 6 fareleri 0.05 birim bleomisin intratrakeal verilen n = 6 | Fibrozis modeli 14 bleomisin mücadeleden sonra 14 gün okudu |
| E | CFTR boş kontroller ve bu Aspergillus (suş AF293) aerosol inhalasyon ile enfekte, n = 6 | Mantar enfeksiyon modeli 11,17 mantar enfeksiyon sonrası 12 gün incelenmiştir |
| F | 3 ug / g BW LPS (E. coli), belirli bir C57BL / 6 fareleri, intratrakeal, n = 6 | Akut Akciğer Hasarı (ALI) modeli 15 okuduLPS ataktan sonra 1 ve 4 ile ilgili |
| G | Her yaşta C57BL yaşı 2-6 hafta / 6 erkek fare, s = 5 | Akciğer kalkınma modeli |
Tablo 1: DFCO ölçüldü farklı fare modellerinin İlanı.
Şekil 1:. Kontrol C57BL / 6 farelerine (Grup A) DFCO'da ölçülmesi ve 5 değişik patolojik modellerin her PR8 influenza 21 gün intratrakeal elastaz sonra (Grup B), sonra, sonuçlar 6 ve 8 gün sonra gösterilmiştir (Grup C) 14 gün intratrakeal bleomisin (Grup D), sonra, 12 gün LPS damlatma (Grup F), daha sonra CFTR olmayan farelerde (Grup D), 1 ve 4 gün içinde Aspergillus enfeksiyondan sonra kullanımıdır. * P <kontrolü vs 0.01 gösterir, # 6 arasında P <0.01 gösterir8 gün grip fareler 1 ve 4 gün LPS fareler, ve + P <kontrolü vs 0.05 gösterir.
Şekil 2: 6 haftalıkken 2 ila erkek C57BL / 6 farelerinde DFCO'da ölçümü (grup G) ölçümleri 0.4 ml'lik bir şişme hacmindeki tüm farelerde yapılan ve 6 haftalık fareler ikinci bir ölçüm idi. 0.8 ml ile yapılan. 0.4 ml hacim ile, 4, 5, ve 6 hafta sonra (p <0.05), 2 hafta ve erkek arasındaki DFCO'da önemli artışlar vardı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada, biz fare akciğer gaz alışverişi yeteneğini ölçmek için yeni bir metrik tanımladı. Bu metrik difüzyon kapasitesi, yani, akciğer birincil işlevi ölçen bir genel klinik ölçüm, gaz alışverişi yeteneği benzerdir. difüzyon kapasitesi kolayca ve hızlı bir şekilde fareler ve insanlar hem de yapılabilir ancak akciğer fonksiyonel bir ölçüdür. Farelerde akciğer hastalığı tespiti için önemli bir hedef kontrol ve deney kohort arasında akciğer fonksiyon değişiklikleri ölçmek için. Bu amaca ulaşmak için, tanımlanmış ve akciğer gelişiminde fonksiyonel değişiklikler dahil olmak üzere, farelerde akciğer hastalığının en yaygın modellerinin en fenotipik değişiklikler, quanitfying arasında kapasitesini göstermek için DFCO kullanmışlardır.
Anatomik ve ekipmanlar ölü uzayda karışmamış ilham gazın etkisi IGN olduğu farelerde DFCO ölçümü kolaylaştırır yaklaşımı doğasında Bir varsayımORed. Ancak, daha önce 10 tarif, 0.8 ml enflasyon hacminin kullanımı tüm ölçümlerde küçük ama tutarlı bir hata tanıttı. Bu hatanın büyüklüğü enflasyonu ile ölü boşluk hacimleri göreceli boyutları bir fonksiyonudur. Bu yaklaşımda, bu hata stopcocks veya T-konnektörleri ölü boşluk ortadan kaldırarak minimize edilir, ve video gösterildiği gibi, sadece şırınga mühür ve gaz transferini kolaylaştırmak için bir parmak kullanır. Bu prosedür ölçümleri arasında yüksek tekrarlanabilirlik sonuçlanır. genç farelerde gerekli küçük şişme hacmindeki etkisi ilk 0.4 mi test hemen her fare 0.8 mi testi ile takip edilen, Şekil 2 'de gösterildiği 6 haftalık farelerde açıkça belirtilmiştir. Listesi DFCO değeri, diğer gruplar, C57BL / 6 fareleri için aralığında olduğu mi 0.8, ancak ile 0.4 ml ölçüm sürekli küçüktür. Bu aslında doğrudan tezahürü olduğunu daha küçük hacimli, recovered 9 sn örnek sadece kontrol gazı konsantrasyonları oluşur ölü boşluk havası, daha büyük bir kısmını sahiptir. Bu durum, yakından Ne konsantrasyonundaki değişikliği getirir CO konsantrasyonunda daha küçük kesirli değişiklik olarak kendini gösterir. CO / Ne bir artış oranı ile hesaplanan DFCO (1 - Bu oran) Böylece küçük.
Şekil 1 'de gösterilen akciğer patolojileri birçok modellerinde, DFCO'da gözlenen önemli düşüş vardı. DFCO bu farklı modellerde azalır Ancak, neden birkaç farklı nedeni vardır. Bleomisin tek dozunun neden olduğu fibrozis, enflamasyon ve kapasite 16 difüzyon bir azalmaya yol açar difüzyon bariyerinin bir koyulaştırıcı vardır. Amfizem olarak, yüzey alanının bir kayıp ile doğrudan yayılması için yüzey alanı ve tahrip duvarlarda olan kılcal kan hacmi hem de azaltmak için hareket yoktur. Elastas ile doz-yanıt ilişkileriE burada sunulmuştur, ancak yayınlanmamış veriler amfizem hasar seviyesi ile DFCO'da arasında iyi bir korelasyon göstermektedir. Influenza enfeksiyonu ile difüzyon bariyerinin bir kalınlaşma ve akciğer konsolide havalandırılmamış bölgelerin bir artış hem de bir sonucu olarak olası difüzyon kapasitesi vardır azalır. Burada kullanılan, PR8 grip modelinde, bu (8. günde DFCO'da de önemli bir azalma yansıtılan) zamanla kötüleşir ve fareler genellikle CFTR olmayan farelerde, günde 10 etrafında ölür, daha küçük bir DFCO başlangıçta oldu C57BL6 kontrolleri ile yapısal farklılıklar olabilir bu yüzden, ama bu fareler, karışık genetik arka plan 17 yapılır. Ancak, Aspergillus enfeksiyonu DFCO'da daha önemli önemli azalmaya neden, ve mantar enfeksiyonu bu düşüşün nedenleri grip ile benzer muhtemeldir. Neden akut inflamasyon LPS sonuçları anlamlı di ödemli kalınlaşma olasılıkla DFCO, azalmışffusion bariyer ve sıvı ile dolu akciğer unventilated bölgeleri. Kullanılan LPS'nin dozu ile DFCO'da azalma günde 4 veya 5 de büyük ve daha sonra 10. günde kontrol geri kazanır (veriler gösterilmemiştir).
Genç farelerde akciğer büyüme ile DFCO'da değişikliklerin analizi için, 0.4 ml enflasyon hacmi açıkça tekrarlanabilir ölçümler izin ve akciğer ulaştı yetişkin vade olarak kapasite (Şekil 2) difüzyon yavaş bir artış göstermeyi başardı. Hesaplanan DFCO azalan küçük bir 0.4 mi şişirme hacmi kullanılarak etkisi bekleniyordu, ancak daha büyük 0.8 ml hacim küçük farelerde kullanılamaz buradadır. Ama geliştirme veya patoloji ile değişiklik bile hala 0.4 ml hacmi ile tekrarlanabilir tespit olmalıdır.
Sonuç olarak, bu görüntü ve ekteki el yazması insanlarda ölçülebilir görünüme benzer farelerde işlevsel bir ölçüm elde etmek için nasıl kullanılacağını gösterir. metrik a yansıtırakciğerin bility en sık çalışılan patolojiler nedeniyle akciğer yapısal değişikliklerin çeşitli gaz alışverişi için. Karbon monoksit (DFCO) Bu difüzyon faktörü yüksek tekrarlanabilir ve genç ya da yaşlı farelerde en deneysel patolojiler ile fonksiyonel ve yapısal değişiklikleri tespit etmek kadar hassastır. akciğer hastalığı değerlendirmek için insanlarda yapılan benzer ölçümler doğrudan benzer olması, onu fare akciğer patolojileri phenytype çok alakalı metrik elde etmek için basit bir yol yapar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ilgi ve hiçbir şey yok çatışmalar ifşa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gas Chromatograph | Inficon | Micro GC Model 3000A | Agilent makes a comparable model |
| 18 G Luer stub needle | Becton Dickenson | Several other possible vendors | |
| 3 ml plastic syringe | Becton Dickenson | Several other possible vendors | |
| Polypropylene gas sample bags | SKC | 1 or 2 L capacity works well | Other gas tight bags will work well |
| Gas tank, 0.3% Ne, 0.3% CO, balance air; (size ME) | Airgas, Inc | Z04 NI785ME3012 | This is the standard mixture used for DLCO in humans |
| 25 TCID50/mouse of influenza virus A/PR8 diluted in phosphate buffered saline. | |||
| Porcine pancreatic elastase | Elastin Products, Owensville, MO | 5.4 U | |
| Bleomycin | APP Pharmaceuticals, Schaumburg, IL | 0.25 U | |
| Escherichia coli LPS | Sigma L2880 | 3 μg/g body weight; O55:B5 | |
| Aspergillus fumigatus (isolate Af293) conidia were collected from mature colonies grown on potato dextrose agar. |
References
- Ogilvie, C. M., Forster, R. E., Blakemore, W. S., Morton, J. W. A standardized breath holding technique for the clinical measurement of the diffusing capacity of the lung for carbon monoxide. J Clin Invest. 36 (1 Pt 1), 1-17 (1957).
- Miller, A., Warshaw, R., Nezamis, J. Diffusing capacity and forced vital capacity in 5,003 asbestos-exposed workers: Relationships to interstitial fibrosis (ILO profusion score) and pleural thickening. Am J Ind Med. 56 (12), 1383-1393 (2013).
- Enelow, R. I., et al. Structural and functional consequences of alveolar cell recognition by CD8(+) T lymphocytes in experimental lung disease. J Clin Invest. 102 (9), 1653-1661 (1998).
- Hartsfield, C. L., Lipke, D., Lai, Y. L., Cohen, D. A., Gillespie, M. N. Pulmonary mechanical and immunologic dysfunction in a murine model of AIDS. Am J Physiol. 272 (4 Pt 1), 699-706 (1997).
- Wegner, C. D., et al. Intercellular adhesion molecule-1 contributes to pulmonary oxygen toxicity in mice: role of leukocytes revised. Lung. 170 (5), 267-279 (1992).
- Reinhard, C., et al. Inbred strain variation in lung function. Mamm Genome. 13 (8), 429-437 (2002).
- Sabo, J. P., Kimmel, E. C., Diamond, L. Effects of the Clara cell toxin, 4-ipomeanol, on pulmonary function in rats. J Appl Physiol. 54 (2), 337-344 (1983).
- Depledge, M. H. Respiration and lung function in the mouse, Mus musculus (with a note on mass exponents and respiratory variables). Respir Physiol. 60 (1), 83-94 (1985).
- Depledge, M. H., Collis, C. H., Barrett, A. A technique for measuring carbon monoxide uptake in mice. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 7 (4), 485-489 (1981).
- Fallica, J., Das, S., Horton, M. R., Mitzner, W. Application of Carbon Monoxide Diffusing Capacity in the Mouse Lung. J Appl Physiol. 110 (5), 1455-1459 (2011).
- Chaudhary, N., Datta, K., Askin, F. B., Staab, J. F., Marr, K. A. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator regulates epithelial cell response to Aspergillus and resultant pulmonary inflammation. Am J Respir Crit Care Med. 185 (3), 301-310 (2012).
- Foster, W. M., Walters, D. M., Longphre, M., Macri, K., Miller, L. M. Methodology for the measurement of mucociliary function in the mouse by scintigraphy. J Appl Physiol. 90 (3), 1111-1117 (2001).
- Yildirim, A. O., et al. Palifermin induces alveolar maintenance programs in emphysematous mice. Am J Respir Crit Care Med. 181 (7), 705-717 (2010).
- Collins, S. L., Chan-Li, Y., Hallowell, R. W., Powell, J. D., Horton, M. R. Pulmonary vaccination as a novel treatment for lung fibrosis. PLoS One. 7 (2), e31299 (2012).
- Alessio, F. R., et al. CD4+CD25+Foxp3+ Tregs resolve experimental lung injury in mice and are present in humans with acute lung injury. J Clin Invest. 119 (10), 2898-2913 (2009).
- Martinez, F. J., et al. The clinical course of patients with idiopathic pulmonary fibrosis. Ann Intern Med. 142 (12 Pt 1), 963-967 (2005).
- Zhou, L., et al. Correction of lethal intestinal defect in a mouse model of cystic fibrosis by human CFTR. Science. 266 (5191), 1705-1708 (1994).
