Abstract
Lipotransferは体全体の軟部組織欠損の治療のために外科医の装備一式に不可欠なツールです。脂肪はそれは、容易に入手容易に得られる、安価で、かつ本質的に生体適合性であるように、理想的な軟部組織充填剤である。1しかし、その急成長の人気にもかかわらず、脂肪グラフト化は10からどこでも及ぶ公開さ保持率で、予測できない結果と可変移植片の生存によって妨げられる-80％。1-3
脂肪移植に関する研究を促進するために、我々は、従って、注入された脂肪の体積保持のリアルタイム分析を可能にする動物モデルを開発した。簡単に言えば、小さなカットCD-1ヌードマウスの頭皮で行われ、処理脂肪吸引物200-400μlの頭蓋骨上に配置される。頭皮が原因のエイズ頭蓋冠が提供する優れた背景のコントラストのためにネイティブ皮下脂肪のその不在の受信者サイトとして選ばれた、とされている分析プロセス。マイクロコンピュータ断層撮影（マイクロCT）は、ベースライン時にグラフトし、その後隔週をスキャンするために使用される。 CT画像が再構成され、画像化ソフトウェアは、グラフト量を定量するために使用される。
伝統的に、この技術は、ex vivoでの物理的な測定によってグラフト重量および体積の単一の評価を提供するために、試験動物を安楽死必要としている脂肪移植体積を評価した。生化学的および組織学的な比較は、同様に、安楽死させるための研究の動物を必要とした。これは、イメージング技術を可視化し、客観試験動物を犠牲にすることなく、初期の移植後の複数の時点でのボリュームを定量化するという利点を提供する。技術は、より大きな移植片リスク皮膚および脂肪壊死として注入することができる移植片の大きさによって制限される。この方法は、脂肪移植の生存率および体積保持を評価するすべての研究のための有用性を有する。これは、特にprovidiによく適しています脂肪移植片の視覚的な表現をngのと時間をかけて音量の変化を次のよう。
Protocol
注：脂肪取得するための実験的なプロトコルと患者同意書を見直し、スタンフォード大学施設内倫理委員会（プロトコル＃2188）によって承認された。すべての動物の手順は、プロトコル番号9999の下で実験動物管理上のスタンフォードの紛争処理パネル（APLAC）により承認された。全ての実験は、動物の安全性と人道的なケアのガイドラインを厳守して実施した。
1.脂肪収穫
- コールマン手順17-19を使用して、選択科目脂肪吸引を受けた健康女性患者の腹部、脇腹、および/ または大腿部領域からヒト脂肪組織を得る。
- 移植のための脂肪吸引物を処理するために、脂肪は30分間沈降させることで始める。
- 脂肪吸引は通常、下部に上部の油、途中で脂肪、血液と、3層に落ち着く。トップ油層と下部血液層を吸引し、廃棄する。
- さらに残りのtumescを削除するにはENT流体又は細胞残屑、350×gで4℃で5分間の脂肪を遠心分離し、下部の水層を吸引する。
- 20％の配信エラーを考慮して、移植のために必要とされる脂肪の量を計算し、および50mlのコニカル（複数可）への脂肪の所望の体積を転送する。グラフトのために必要な脂肪のマイクロリットルを得るために、研究ではマウスの数によって400を掛けます。
- この時点で、もし実行するセルがLipotransfer 20,21、氷上でグラフト化脂肪の代わりにボリュームをアシスト。その後ズクら22によって記載されている標準的な技術を使用して残りの脂肪から脂肪由来間質細胞（ASCは）を収穫。
2.脂肪グラフト
- 女性、実験的研究のためのホモ接合CD-1ヌードマウスを得る。生後12週 - 8との間にマウスを選択してください。
- 約10分間、2 L /分で2.5％イソフルラン/酸素混合物を用いてノックダウンボックスに麻酔、場所マウスを誘導した。 ISOFをお勧めしますのでご注意くださいlurane用量は、マウス系統に応じて変化する。
- マウスの呼吸速度が鈍化している場合には、つま先のピンチで十分な鎮静を確認する。マウスの両眼に獣医潤滑眼軟膏を適用します。
- マウスはつま先のピンチに反応して尻込みしていない場合、これは麻酔の十分な平面性を確認する。 1-2 L /分で、2.5％イソフルラン/酸素混合物を提供するノーズコーンにマウスの鼻を置きます。マウスはつま先のピンチから退避した場合、5分後にノックダウンボックスと再テストに戻ります。
- マウスの下で無菌のフィールドを設定して、70％のエタノール溶液に続いて2.5％ポビドンヨードで頭皮を殺菌。さらに2回繰り返します。
- マウスの上に手術用ドレープを置き、滅菌野を維持するように注意してください。滅菌器具、手袋、PPEは、常に使用されるべきである。
- 移植すべき脂肪ボリュームは以前に氷上に置いた場合は、脂肪が最初の配信の前にRTに調整することができます。
- 1ミリリットルと1ミリリットルルアーロックシリンジをバックロード脂肪の。
- 注射器の最後に14 G、長さ8cm脂肪グラフトカニューレを接続します。
- 脂肪の200〜400μLまでシリンジプランジャーを押すことにより内閣総理システムは、注射器に残ります。シリンジプランジャーを押しながらカニューレが完全に遠位カニューレの穴を出た脂肪を観察することにより、脂肪で満たされていることを確認します。
- 細かい鉗子を使用して、頭蓋骨の尾-最も側面を覆う正中線で背部皮膚を持ち上げる。細かいハサミを用いて皮膚にカット1.5ミリメートルを行います。
- 後でグラフトが実行された後に一緒にエッジ傷をもたらすために使用されるカットの真ん中を通る単一6-0ナイロン縫合糸を配置します。縫合糸を接続しないでください。
- 皮膚切開を通してカニューレを挿入し、覆っている皮膚への結合組織の添付ファイルを解放するために頭蓋骨の上に扇形のパターンで前後にカニューレを渡すことで、頭蓋骨の上皮下ポケットを作成します。
- ポケットが作成されたら、cと位置付け直接頭蓋骨の上にマウスの正中線でannula先端がちょうど目の間に引かれたラインの背後にあるべきポケットの吻側 - ほとんどの側面に位置するまで。 （ 図1A）
- ゆっくりと戻ってカニューレを引きながら、プランジャーを前進、逆行性脂肪を注入する。鉗子を使用して、一緒に創傷の縁を持って、ポケットから漏れる任意の脂肪を維持するためにそれらを持ち上げる。
- 以前に最初の結び目が皮膚に軽くあることを確認しながら、配置された縫合糸を結ぶ。さらに3つの正方形の結び目をし、3ミリメートルの尾を持つ縫合糸を切る。 （ 図1B）
- 可視化とポケットが過充填しないとポケットを覆う皮膚は緊張しないとされているマニュアル触診で確認してください。ポケットは過充填されている場合は、縫合糸をカットし、ポケットの中からすべての脂肪を取り除く。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）pH7.4でポケットを洗い流し、脂肪の少ない量を再注入する。
- からマウスを外しますそれだけで清潔なケージにその背面や側面にnesthesiaと場所。定期的な呼吸、正常な動き、出血がないこと、および痛みや苦痛の徴候のために動物を監視します。動物が苦痛にある場合は最大48時間、ブプレノルフィン0.1 mg / kgを皮下ごとに6時間を管理します。
- 動物はそれから離れる前に、胸骨の横臥位を維持するために十分に目覚めていることを確認してください。それは完全に回復するまで他の動物とのケージに動物を置かないでください。
- 4時間後、動物が食べると、移動を飲み、そして普通に呼吸することが可能であることを確認しないと、手術部位からの出血ないがあること。動物飼育施設に戻す。
3.マイクロCT
- 次にスキャン術後3日目ベースラインボリュームのマウス、および術後週2,4,6および8でスキャンを繰り返す。
- 各時点でマウスを画像化する際にSで前に概説したように、前および術後の鎮静および動物ケアガイドラインに従っTEPS 2.2から2.4と2.17から2.19。
- 100μm以下、より良いの復興ボクセルサイズとマイクロCTスキャナでスキャンを実行します。
- 80のkVpのピークX線キロボルトと450μAのアノード電流では、各マウスに9分のスキャン中に約5 centiGyの配給用量を投与。これらの値は、スキャンプロトコルに依存して変動しますのでご注意ください。
- 最初のスキャンを実行する前に、空気、水、および骨強度を区別するイメージングファントムをマイクロCTを較正する。
- 2上にマウスと下部に2と腹の位置にスキャナに4匹のマウスを置きます。走査床は容易にノーズコーンとしてマウス本体および10mlのシリンジを保持するために60ミリリットル注射器を用いて構成することができる。23
- 毎分1〜2 Lで2.5％イソフルラン/酸素混合物で麻酔下でマウスを維持します。
- スカウト画像で確認して、第一頸椎の鼻から、と頭蓋骨の上からSKUのベースにマウスの全体の頭蓋骨、LL、画像化されます。
4.マイクロCT解析
- ピクセル強度のしきい値を使用してボクセルを選択することによって、関心領域（ROIの）の作成を可能にするマイクロCTイメージング解析ソフトウェアを使用して再構成画像を開きます。ソフトウェアは、3Dの作成が選択されたボクセルの補間により表面、およびボリューム分析を可能にする。
- 2次元（2D）冠状、アキシャル、サジタルビューに再構成されたCT画像をロードすることによって開始します。 （ 図2A）
- ガイドとして軸方向のスライスを使用して、脂肪移植片の一番左の側面に対応している矢状スライスに移動します。脂肪移植片に対応するすべてのボクセルをキャプチャするピクセル強度の上限と下限のしきい値を選択したが、それは、周囲の組織および骨を除外します。 （ 図2B）
- 以前に定義されたピクセル強度のしきい値を使用して脂肪移植片に対応して、サジタルビューでROIを定義します。 R移植片の一番右の側面に到達するまでナビゲートし、この手順をすべての第五の矢状スライスをEPEAT。 （ 図2C）
- シングル、組み合わせた3D ROIにすべての2D ROIのから選択されたボクセルを補間する。 （ 図2D）
- ソフトウェアによって計算レコードのROIボリューム。
- 最終的な脂肪グラフト量を可視化するための3D等値面をレンダリングします。 （ 図2E）
- その後の分析では、ピクセル強度の最大値と最小しきい値ベースライン分析のために用いたものと同じに保つようにしてください。
5.ファット·ハーベスト
- マウスは8週24,25時点がスキャンされた後、以前の手順2.2から2.4と2.17から2.19に上記のように、マウスを麻酔。
- APLACのガイドラインに続いて、彼らの脊柱を分離することにより、マウスを安楽死させる。
- 術野にマウスを置きます。腱はさみを使って、慎重にポケットを開き、Tを解剖彼は脂肪移植片から皮膚や結合組織の添付ファイルの上にある。
- この時点で、移植片の抽出を助けるために覆う背部皮膚のパッチを切除するのに役立ち得る。 （ 図3A）
- 軽くピンセットで移植片に牽引力を維持し、ハサミでリリースする必要が緊張の連続する点を可視化するために左右に移植片を回す。
- 移植で撮影した結合組織を最小限に抑えるために切除する際に、可能な限り移植片の近くに滞在。 （ 図3B）
- 移植片を切除した後、少なくとも0.01グラムに正確である風袋を量っ規模で質量を測定。
- 測定された質量値を使用して脂肪移植片の体積と変換率などの人間の脂肪の平均密度（0.9グラム/ ml）を計算します。
- マイクロCTを使用して得られたものと脂肪移植の計算されたボリュームを比較してください。
- 必要に応じて脂肪移植片は、組織学またはさらなる分析のために処理することができる。
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Representative Results
脂肪移植片が徐々に週8スキャンの完了時に8週（ 図4A）24 62.2％の平均生存率をもたらし、研究の過程で体積が減少し、各脂肪移植は、単一部品で抽出した。 Wilcoxan順位和検定のいずれかのマイクロCTによって得られた、または物理的な質量から計算脂肪移植片の体積の測定値の差を比較した。有意差は、これら2つの方法（両側p -値= 0.9362）との間に認められなかった。 （ 図4B）
スキャンあたり5 centiGyと5スキャンの時点では、各マウスは、研究の過程にわたって25 centiGyの合計以下で受信していない。これと一致して、マウスのいずれも、皮膚の放射線火傷のいずれかのグロス証拠を示さなかった。
図1（A） 、（B）完成脂肪移植の際にヌードマウス、単一のナイロン縫合糸は、創傷をもたらすために使用される一緒にエッジ。ポケットがいっぱいあるが緊張しないとされています。
矢状ビュー上で移植片の一番左の側面に移動するためのガイドとして軸方向のビューを使用して、 図2（A）は、最初の軸に表示されて再構成された画像、冠状、とサジタルビュー。（B）。すべてのボクセルは、このように、脂肪組織を表す脂肪移植体積の画定を可能にする閾値範囲内で選択されるように（C）ピクセル強度のしきい値を設定するROIの移植の最も左側の側面から始まるサジタルビューで定義され、継続今までに移植片の他端に移動するyの第五のスライス（D）2D ROIの単一の3D ROIに補間から選択されたすべてのボクセル（E）は、三次元表面は、総脂肪移植ボリュームを可視化するためにキュービックスプライン補間を使用して作成された。
摘出皮膚の背側パッチと植の前に図3（A）脂肪移植、。（B）植後の脂肪移植。
図4（A）マイクロCT容量分析は8週間にわたり脂肪移植体積の漸進的な損失を示した。（B）最終脂肪移植ボリューム、マイクロCTによって測定されるように、外植脂肪移植片の質量から計算した容量と密接に対応してS。ヒト脂肪（0.9グラム/ ml）の平均密度は、変換率とした。
実際に測定されたFATボリューム24対1表計算マイクロCTボリューム
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Discussion
この時点までは、ほとんどの研究者は脂肪移植片の長期生存を定量化するために、非イメージングモダリティに依存してきたが、これらの方法は、単一の測定試験動物及び収率の犠牲を必要とする。3,10-12我々の研究で表すマウスモデルにおける脂肪移植片生存の目的、リアルタイム定量を可能にする改良された分析方法。
このプロセスにおける重要な、これは、インタクトな免疫系を有するマウスを使用する場合に生じる移植片拒絶を防止するように十分に免疫不全マウスは、研究のために使用されることを保証される。脂肪完全性を維持することは、グラフトの収穫、加工、および配置の段階で非常に重要です。伝統的に受け入れられる基準に準拠して、移植のための脂肪を吸引補助脂肪吸引（SAL）によって得られるべきである。配置中に、脂肪のない高速な0.5ミリリットル/秒より安定した流速で注入する必要があります。 14ゲージのカニューレはiのグラフト化のために好ましいナマウスが、より大きな直径のカニューレは脂肪への損傷なしに使用することができる。彼らは増加によるせん断応力による破壊に脂肪を原因と小さなカニューレと針が-特に狭くより16ゲージ-されている配置中にはお勧め。我々は、上記の沈殿、遠心分離および/または濾過のいずれかの組み合わせを処理するための我々の好ましい技術を説明しているがあれ油及び血液の層が十分に移植前に脂肪から分離されるように使用することができる。
脂肪移植片が原因脂肪グラフトの矛盾した性質のために、結果のばらつきを最小限に抑えるために、サイズが少なくとも200μLである必要があります。サイズが400μlの最大大きい移植片を使用することができるが、このボリューム上に、障害血管供給、および過剰な皮膚の張力は、脂肪および皮膚の壊死をもたらし得る。最終的に、最大の脂肪移植片のサイズは、表面積とポケットの体積によって決定される。 、経口安全に送達することができる移植片の体積を増加させるためにcketは、より大規模な切開によって拡張することができます。しかしながら、これは、移植片と周囲の組織との間のコントラストはあまり明確にするであろう、頭蓋骨の上部の境界を越えて脂肪を配置することができる。したがって、後続のボクセルの選択はより難しくなる。
初期の皮膚切開が十分に小さい場合、縫合糸は、脂肪が自給ままポケットから漏出は見られない限り、必要とされなくてもよい。縫合糸が配置されている場合は、注意がそうでなければ皮膚の損傷が発生することが、あまりにもきつく最初の結び目を作るしないように注意する必要があります。それが炎症反応を制限し、感染を保有しにくいように、ナイロンのような非吸収性モノフィラメント縫合糸は、好ましい。切開の再上皮化を24時間48術後内で発生し、縫合糸は、この時点で除去することができる。吸収性と編組縫合糸を使用すべきではありません。皮膚は常に必要以上の力で処理する必要があり、そして外科医は皮膚を粉砕しないように注意する必要があります創傷の縁を押しながら。
研究者「画像解析ソフトによっては、ピクセル強度と組織の密度間の正確な関係は異なる場合があります。調べでは、最も正確に周囲の組織から脂肪移植を区別し、最大と最小の範囲を得るために、画素強度のしきい値を選択する必要があります。同一の最大値と最小閾値は、すべてのボリュームの間に使用されるべきで一貫性を維持するために分析する。
ピクセル強度閾値が設定された後、グラフトボリュームを選択するための複数の方法がある。我々は我々の手で最高のサジタルビューでブラシツールで絵を見つけたが、ROIを作成するための他のボクセルの選択方法は、このような軸方向のビューにスプラインツールまたは絵で描くとして使用することができます。一人は、すべてのボリュームが、測定誤差を低減するためになど、一貫できるだけ分析実行する場合が好ましい。
非この方法は、グラフトの進化のリアルタイム可視化の侵襲的な性質は、従来技術に勝る重要な利点を提供する。しかし、この技術は、残留移植片の生存および健康を特定する能力が制限される。また、移植片の相対的な血管再生を実証することができない。外観及びグラフト密度の変化は、脂肪壊死、感染症、嚢胞形成、または液化ほのめかすことができるが、それは単独で、マイクロCTから正確な結論を引き出すことは困難である。
私たちは、この技術が今後の研究では、より良い脂肪移植片生存および損失の原因因子を理解するために実施することができるための基盤として役立つことを願っています。このテーマの変形は、細胞、成長因子、サイトカイン、遺伝子、および細胞表面マーカーは、脂肪移植体積の最終的な保存を果たし幹役割を解明することができる。対照的な仮説をテストする場合は、この改良されたツールで、我々はtransfo脂肪転送をより良く理解することを楽しみにしてより予測可能なものに軟部組織欠損を治療するための気まぐれな技術RMS。
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Acknowledgments
この研究は、ACSフランクリンH·マーティン学部研究フェローシップ、HageyによってサポートされていましたMTLDCWに小児再生医療のためのHagey研究所、オーク財団によってサポートされ、国立衛生研究所、助成NIHR21DE019274、NIHR01DE019434、NIHR01DE021683、およびNIHU01HL099776た小児再生医療のための研究所、スタンフォード大学小児保健研究所学部奨学生賞。マイクロCTは、in vivoイメージングにおけるイノベーションのためのスタンフォードセンターで行われた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SAL lipoaspirate | |||
| Centrifuge | Beckman Coulter, Inc., Pasadena, CA | ||
| 50 ml conical tubes | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| CD-1 nude mice (Crl:CD1-Foxn1nu) | Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA | ||
| Isoflurane | Henry Schein, Dublin, OH | ||
| 2.5% Betadine | Purdue Pharma, L.P., Stamford, CT | ||
| 70% Ethanol solution | Gold Shield, Hayward, CA | ||
| 1cc luer-lock syringe | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| 14 gauge cannula | Shippert Medical, Centennial, CO | ||
| Forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | ||
| Tenotomy scissors | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | ||
| 6-0 nylon suture | Ethicon, Blue Ash, OH | ||
| Phosphate buffered saline | Gibco, Carlsbad, CA | ||
| micro-CT scanner | Siemens Healthcare, Pleasanton, CA | ||
| Phantom | TriFoil Imaging, Northridge, CA | ||
| Imaging analysis software | IRW, Siemens Healthcare, Pleasanton, CA | ||
| Scale | Mettler-Toledo International, Inc., Columbus, OH |
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