Introduction
Les macrophages sont des cellules hétérogènes et plastiques qui sont capables d'acquérir des phénotypes fonctionnels distincts. In vivo, ces cellules répondent à une grande variété de micro signalssuch l'environnement comme les produits microbiens, des cytokines, etc. 1. In vitro, le phénotype pro-inflammatoire (M1) de macrophages peut être induite par le lipopolysaccharide (LPS) et le phénotype anti-inflammatoire (M2) par des cytokines telles que l'interleukine-4 (IL-4). En outre, les macrophages peuvent passer d'un M1 à M2 phénotype activé, et inversement, sur des signaux spécifiques 2.
En fonction du phénotype, les macrophages ont différentes fonctions. M1 macrophages sont des cellules qui produisent des cytokines pro-inflammatoires, telles que le facteur de nécrose tumorale α (TNF-α), afin de tuer des micro-organismes ou des cellules tumorales 3. En revanche, les macrophages M2 empêcher ces réponse inflammatoire comme dans la cicatrisation des plaies et de la fibrose en produisant des anti-inflammatorfacteurs y tels que TGF-β 3,4.
Des cellules mononucléaires de sang périphérique humain provenant de donneurs sains ont été isolées par gradient de densité Ficoll centrifugation comme décrit précédemment en utilisant 5 une technique adaptée de Boyum 6. Macrophages en culture peuvent être différenciées en M1 ou M2 phénotype après 6 jours de culture primaire 7.
Analyse de l'expression des protéines ou des changements de protéines entre les deux sous-types de macrophages en vertu de divers stimuli contrôlés, tels que la pathogénicité d'accueil ou les toxines microbiennes, sera utile pour déchiffrer la fonctionnalité du pro- et anti-inflammatoires des macrophages.
Protéomique sont des outils uniques pour la surveillance directe de protéines qui sont spécifiquement en amont ou en réglementés dans les macrophages humains cultivés en vertu de divers stimuli. Les colorants fluorescents ont résolu certaines des limitations de l'électrophorèse sur gel 2D, tels que la faible sensibilité et l'analyse d'image 8 < / Sup>. Les colorants qui réagissent avec les résidus de cysteine ont augmenté la sensibilité de détection par rapport à ceux faisant réagir avec des résidus de lysine 9. Dans une étude précédente, nous avons démontré l'utilité de l'étiquetage DIGE de saturation pour l'analyse des échantillons rares 10 par rapport à la coloration à l'argent classique 2D électrophorèse 11. Cette technologie est utile pour analyser rapidement des modifications de protéines entre les deux sous-types de macrophages ou entre macrophages traités et non traités de la même sous-type.
Les avantages de cette technique sont protéomique avoir accès à l'information de la taille de la protéine et des modifications post-traductionnelles en analysant le gel 2D 12. Il doit être pris en compte que ce pas est une technique à haut débit, ce qui limite le nombre d'échantillons pouvant être analysés. Le développement de tests à haut débit basés sur la spectrométrie de masse tel que revu récemment 13 peut améliorer cette situation.
_content "> Ici, nous présentons comment effectuer l'analyse 2D DIGE de l'extraction de la protéine des macrophages en culture dans les processus de l'électrophorèse, isoélectrofocalisation, et SDS-PAGE ainsi que des informations sur l'utilité des logiciels 2D adéquate.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Le protocole suit les lignes directrices de notre comité des institutions d'éthique de la recherche humaine. Buffy coat partir de donneurs humains sains ont été obtenus à partir de la transfusion sanguine Centre régional (Lille, France). Les échantillons obtenus à partir des couches leucocytaires sont déclarés comme une collection Inserm (n ° DC2010-1209).
1. Matériel et de la culture des médias Préparation
- Diluer 10x tampon phosphate salin (PBS) dans de l'eau distillée stérile pour obtenir 1x PBS.
- Faire un milieu RPMI 1640 supplémenté avec de la gentamicine (40 ug / ml) et de L-glutamine (2 mM), avec ou sans 10% de sérum humain.
2. Les cultures primaires de macrophages dérivés de monocytes (MDM)
- Diluer couche leucocytaire (25 ml) avec du PBS 1x. Disposer soigneusement sur un / tube et centrifuger de Leucosep Ficoll à 1600 g pendant 20 minutes, à la température ambiante.
- Recueillir des monocytes à l'interface dans un nouveau tube. Laver 3 fois avec 10 ml de PBS 1X contenant 0,1% d'acide éthylènediamine tétraacide acétique (EDTA) par centrifugations successives à 1.000 xg, 370 xg et 160 xg pendant 10 min chacun, puis une fois dans 1 x PBS seul à 160 xg pendant 10 min.
- Remettre en suspension le culot de cellules dans 5 ml de milieu RPMI-1640 sans sérum et ensemencer les cellules dans des boîtes de 35 mm à une densité de 1 x 10 6 cellules par boîte.
- Après sédimentation pendant 90 minutes dans l'incubateur, jeter le surnageant contenant les cellules non adhérentes. Laver les cellules adhérentes, comprenant des monocytes, 3 fois avec 1 ml de PBS; puis ajouter 1 ml de milieu frais contenant 10% (v / v) de sérum humain à des cellules libres sériques précédemment.
- Après 6 jours de culture, les macrophages différenciés pour donner alternatifs (M2), ajouter recombinant humain de l'IL-4 (15 ng / ml) et maintenir pendant 6 jours. Ensuite, traiter les macrophages différenciés avec un lipopolysaccharide (100 ng / ml) au jour 12 pendant 4 heures pour obtenir les macrophages M1.
3. Extraction de M1 et M2 des macrophages protéines pour électrophorèse 2D
- Laver macrophtrois fois à l'âge mM de Tris, pH 7,4, et la ferraille dans un tampon contenant 30 mM Tris pH 8, 4% 25 3 - [(3-cholamidopropyl) diméthylammonio] -1-propanesulfonate (CHAPS), thiourée 2 M et 7 M d'urée.
- Lyse des cellules en utilisant un mélangeur approprié pour tubes de 1,5 ml à centrifuger pendant 5 min dans la glace et conserver à -20 ° C.
- Déterminer la concentration de protéine en utilisant un réactif de Bradford commercial. Stocker des aliquotes de 100 ul des protéines à -20 ° C jusqu'à utilisation.
4. isoélectrofocalisation
REMARQUE: Effectuer toutes les procédures d'étiquetage dans l'obscurité.
- Réduire 5 pg de chaque échantillon (macrophages M1 et M2) ajusté à 9 ul avec du tampon de lyse avec du Tris 2 mM (2-carboxyéthyl) phosphine (TCEP) pendant 1 heure à 37 ° C.
- Ajouter cyanine 3 (Cy3) extrait de M1 et M2 extrait de colorant réactif sulfhydryle à une concentration de 0,8 nM de protéine / ug. Ajouter cyanine 5 (Cy5) pour M1 et M2 extrait à une concentration de 0,8 nM / pg de protéine et incuberpendant 30 min à 37 ° C.
- Arrêter la réaction avec l'addition d'un volume égal de tampon d'échantillon contenant 7 M d'urée, thiourée 2 M, 4% de CHAPS, 130 mM de dithiothréitol (DTT) et 2% pharmalytes.
- Mix Cy3 marqué échantillons M1 M2 avec des échantillons Cy5 dans une main et marqué au Cy3 échantillons M2 avec des échantillons M1 Cy5 dans une autre main.
- Réhydrater un gradient de pH immobilisé (IPG) bande (240 mm, pH 3-10 gradient linéaire) avec 450 ul d'échantillons mixtes marqués dans un tampon contenant 7 M d'urée, 2 M thiourée et 4% de CHAPS sur une focalisation isoélectrique (IEF) système de pile pendant 24 heures sans appliquer de courant.
- Effectuer concentrer à 300 volts (V) pendant 3 heures, puis à un gradient de 1000 V pendant 6 heures, à un gradient de 8000 V pendant 3 heures et enfin à 8000 V pendant 3 heures.
5. Deuxième Dimension
REMARQUE: Effectuer toutes les procédures d'électrophorèse dans l'obscurité.
- Incuber les bandes IPG dans un tampon d'équilibration contiennenttion de 0,1 mM de Tris-HCl (pH 8), 6 M d'urée, 2% (p / v) de dodécylsulfate de sodium (SDS) et 30% (v / v) de glycerol pendant 10 min.
- Transférer les bandes IPG équilibrée pendant la seconde dimension (électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS (PAGE)) sur 12,5% de gels de PAGE et d'assurer l'étanchéité avec l'agarose bas point de fusion.
- Effectuer l'électrophorèse à 20 ° C en utilisant un système Ettan-Daltsix à une tension constante de 70 V pendant la nuit, suivie par 300 V jusqu'à ce que le front de bleu de bromophénol atteigne le fond du gel.
6. Acquisition d'image et en bioinformatique analyse
- Des gels d'analyse exprimés entre les deux plaques de verre à faible fluorescence avec un scanner Imager DIGE aux longueurs d'onde d'excitation / émission de 532/580 nm pour Cy3 et Cy5 633/670 nm pour pour donner des images avec une taille de pixel de 100 um.
- Effectuer l'analyse d'image avec un logiciel commercial comme détaillé précédemment 12.
- Calculer et normaliser des volumes au comptant dans chaque image. Attribuer un volume de place normalisée comme un accessoireortion de la valeur totale de chaque spot détecté dans le gel.
- Analyser les différences de volumes au comptant de protéines pour chaque type de macrophages en comparant la valeur du volume de place normalisée entre les deux groupes (M1 et M2). Considérez la différence entre les volumes au comptant à être importante si le changement est 1,5 fois (p <0,05, à sens unique analyse ANOVA).
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Representative Results
Pour effectuer l'analyse protéomique différentielle appropriée, le traitement des échantillons à analyser doivent être vérifiées.
Dans l'exemple présenté, la qualité de macrophages de culture de cellules est requis pour les aspects morphologiques et moléculaires comme précédemment publiée 5. La différenciation des monocytes en macrophages et l'homogénéité de la culture a été suivie par microscopie de phase. La figure 1 a montré un exemple de cultures primaires de macrophages M1 et M2. Comme le montre, nous avons vérifié l'homogénéité de M1 (figure 1A, B) et M2 sous-types de macrophages au jour 12 de la culture en phase microscopie à faible (Figure 1A, C) (figure 1C, D) et élevé (figure 1B, D ) grossissement. De toute évidence, on observe une morphologie distincte de macrophages M1 et M2 après 12 jours de culture primaire. Comme précédemment publiée, nous avons vérifié par RT-PCR la présence d'ARNm codant pour le TNF et l'IL1B dans les macrophages et pour MRC1 M1 et M2 CCL18 dans des macrophages 14 (non représentées).
Seuls les cultures combinant ces critères ont été utilisés pour l'analyse protéomique.
Nous avons déterminé les profils protéiques 2D des deux sous-types de macrophages, M1 (pro-inflammatoire) et M2 (anti-inflammatoire). Pour ce faire, nous avons extrait les protéines de M1 et M2 des macrophages en culture comme expliqué dans le protocole et les macrophages M1 et M2 ont été soit marqués avec des colorants de saturation Cy3 ou Cy5 pour analyser les protéines par électrophorèse 2D DIGE. La figure 2 présente des gels 2D représentatifs de M1 ( la figure 2A, B) et M2 (figure macrophages d'une qualité suffisante pour l'analyse bioinformatique 2C, D). La même tendance a été observée de protéines pour M1 ou M2 indépendamment des colorants de cyanine Cy3 utilisées (figure 2A, C) ou Cy5 (Figure 2B, D). Dans cet exemple, un grand linéaire pH gradient a été utilisé (3-10) et pour détailler les protéines avec un pl acide ou basique, gradient de pH étroit peut être utilisé.
Fait intéressant, l'analyse bioinformatique du gel 2D révélé 20 zones contenant des points qui peuvent être analysés et comparés en utilisant le logiciel 2D. La figure 3 est un exemple de gel 2D numérisés dans lesquels les 20 domaines de spots sont situés. Le logiciel 2D est en mesure de quantifier et de comparer le volume de chaque spot entre plusieurs gels 2D à partir de différents échantillons. Le logiciel permet de quantifier l'augmentation ou la diminution du volume de place, ce qui peut être visualisé par la couleur comme indiqué à la figure 3. Spots sont considérés comme ayant une expression différentielle importante si le facteur de variation des volumes au comptant normalisées comme indiqué au paragraphe 6 de l'article du protocole était supérieur à 1,5 avec une valeur p <0,05. La présence ou l'absence d'un spot de la protéine ou du polypeptide entre les deux groupes de macrophages peuvent être détectés par le logiciel.
Figure 1: Photographies de microscopie en contraste de phase de culture primaire de macrophages Exemple de morphologie de M1. (A, B) et M2 (C, D) des macrophages. Macrophages M1 ont été obtenus par traitement de lipopolysaccharide pendant 4 heures à jour 12. macrophages M2 ont été obtenus par l'IL-4 de commencer le traitement dès le premier jour jusqu'à 6 microscopie jour 12. contraste de phase permet d'identifier clairement les deux sous-types de macrophages. Photographies à faible (10X) (A, C) et haute (40X) (B, D) grossissement ont été effectuées au jour 12 de la culture. Barre d'échelle:. 50 um Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 2:. Représentant 2D DIGE gel de M1 et M2 des macrophages en culture Protéines (5 ug) ont été marquées avec Cy3 ou l'autre (A, B) ou Cy5 (C, D) à partir de M1 (A, B) et M2 (C, D) macrophages en culture pendant 12 jours. Le même modèle de gel 2D pour les macrophages M1 ou M2 a été obtenu indépendamment de la cyanine marqué utilisé. Les positions de poids moléculaire normes (MR) sont indiqués sur la gauche, et la PI est indiqué sur le bas du gel. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 3:. L'analyse bioinformatique d'un représentant gel 2D DIGE de protéines macrophages avec le logiciel ProGenesis SameSpots Vingt domaines ont été détectés pour effectuer l'analyse différentielle entre les macrophages M1 et M2. Le bas de la figure indique le code de couleur pour le facteur de variation des points de volume. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Le protocole décrit ici en détail une méthode pour analyser l'impact de divers stimuli des deux sous-types de macrophages, M1 (pro-inflammatoire) et M2 (anti-inflammatoire). Des cultures primaires de macrophages M1 et M2 ont été obtenus à partir de la différenciation de monocytes comme précédemment publié 7.
La procédure de l'électrophorèse sur gel 2D DIGE nécessite des matériaux et d'équipements spécialisés, tels que les cellules IEF pour plaques isoélectrofocalisation, faible fluorescence pour la SDS-PAGE afin de balayer deux fois le gel à excitation / longueur d'onde d'émission pour Cy3 et Cy5, un scanner pour la fluorescence et un logiciel 2D. Cette méthode nécessite un peu de pratique et de la dextérité.
Il existe plusieurs étapes critiques pour la réussite de l'électrophorèse sur gel 2D: 1) l'extraction des protéines est critique dans un environnement sans contaminants tels que l'albumine ou de la kératine, et 2) effectuer le marquage et l'électrophorèse à l'obscurité. Évitez lautilisation de DTT pour la réduction de la protéine dans le tampon de lyse que la technique nécessite l'utilisation de TCEP pour réduire les liaisons peptidiques dans des protéines de sulfure avant le marquage avec des colorants réactifs cyanine.
Cette technique 2D DIGE sensible permet l'évaluation de l'expression différentielle des spots protéiques par des macrophages dans diverses conditions environnementales, en présence ou en l'absence de protéines en fonction du sous-type.
L'une des limites de cette technique 2D DIGE est la nécessité de marquer les protéines sur le résidu cystéine, qui est absente dans 14% de la protéine. L'autre limitation est le nombre relativement faible des échantillons qui peuvent être analysés à la même type par rapport à la technologie à haut débit comme la spectrométrie de masse quantitative, si 2D DIGE est moins coûteux.
Stimuli microbiens, tels que le LPS ainsi que des cytokines Th1, activent les macrophages dans un état inflammatoire M1, tandis que les cytokines Th2, telles que IL-4, polarize cellules à un phénotype M2 avec immuno, la réparation, et les fonctions anti-inflammatoires 3. Phénotypage M1 et M2 des macrophages en culture avec ou sans pathogénicité hôte par des approches de protéomique fourniront une image plus détaillée du rôle fonctionnel complexe de sous-types différents. L'électrophorèse 2D DIGE peut être utile pour l'identification des polypeptides / protéines ou des modifications post-traductionnelles de ces protéines différentiellement modifiés dans un sous-type ou entre les deux sous-types de macrophages dans le cadre des stimuli ou un environnement spécifique.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 31870-074 | |
| PBX 10 X | Invitrogen | 14200-083 | |
| L-glutamine-200 mM-100X | Invitrogen | 25030-024 | |
| gentamycin 10 mg/ml | Invitrogen | 15710-049 | |
| human serum | Invitrogen | 34005100 | |
| Ficoll d = 1,077 | ATGC | L6115 | |
| Leucosep | Dutscher | 16760 | |
| 6-wells plate PRIMARIA | Becton Dickinson | 353846 | |
| IL-4 | Promocell | B-61410 | |
| lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L-2654 | |
| Giemsa | Fluka | 48900 | |
| EDTA MM372,2 | Research Organics | 3.00E+01 | |
| Filter 0.22 µm | Millipore | SCGPTORE | |
| 100 ml cylinder | Corning | 430182 | |
| TCEP | Interchim | UP242214 | |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000006 | |
| Cy3+Cy5-reactive dye | GE Healthcare | 25-8009-83 | |
| IPG strip 3-10 24cm | GE Healthcare | 17-6002-44 | |
| Protean IEF cell | Bio-Rad | 165-4000 | |
| Low-melting agarose | Invitrogen | 15517-014 | |
| Ettan-Daltsix system | GE Healthcare | 80-6485-08 | |
| Ettan DIGE Imager scanner | GE Healthcare | ||
| Progenesis Samespot | Non linear dynamics | ||
| 50 ml tubes | any supplier | n/a | |
| 15 ml tubes | any supplier | n/a | |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C5070 | |
| Urée | Merk | 108484-500 | |
| Thiourée | Sigma-Aldrich | T7875 | |
| DTT | Bio-Rad | 1610611 | |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Pharmalytes 3-10 | GE Healthcare | 17-0456-01 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3773 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 | |
| Acrylamide 40% | Bio-Rad | 161-0148 | |
| 2D clean Up | GE Healthcare | 80-6454-51 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Diméthylformamide | Sigma-Aldrich | 22705-6 | |
| electrode wicks | Bio-Rad | 165-4071 |
References
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