Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Nevromuskulære krysset: Måling Synapse Størrelse, fragmentering og endringer i Synaptic Protein Tetthet Bruke Confocal Fluorescensmikroskopi

doi: 10.3791/52220 Published: December 26, 2014

Abstract

Nevromuskulære krysset (NMJ) er den store, kolinerge relé synapse gjennom hvilke pattedyr motor nevroner styre frivillig muskel sammentrekning. Strukturelle endringer på NMJ kan resultere i nevrotransmisjon svikt, noe som resulterer i svakhet, atrofi og død av muskel fiber. Mange studier har undersøkt hvordan genetiske modifikasjoner eller sykdom kan endre strukturen av musen NMJ. Dessverre kan det være vanskelig å direkte sammenligne resultatene fra disse studiene fordi de ofte ansatt ulike parametere og analytiske metoder. Tre protokollene er beskrevet her. Den første bruker maksimal intensitet projeksjons konfokale bilder for å måle området av acetylkolin reseptor (AChR) -rike postsynaptiske membran domener på gavlen og arealet av synaptisk vesikkel farging i den overliggende presynaptiske nerveterminalen. Den andre protokollen sammenligner de relative intensiteter av farging for synaptiske proteiner i den postsynaptiske membranen. Den tredje protocol bruker fluorescens Resonance Energy Transfer (FRET) for å oppdage endringer i pakking av postsynaptiske AChRs på gavl. Protokollene har blitt utviklet og forbedret i løpet av en rekke studier. Faktorer som påvirker kvaliteten og konsistensen av resultatene blir diskutert og normative data er gitt for NMJs hos friske unge voksne mus.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Nevromuskulære krysset (NMJ) er den kritiske relé synapse som formidler kommunikasjon mellom nervesystemet og muskulatur. Det er nødvendig for all frivillig bevegelse. Fluorescens mikroskopi har lenge vært brukt til å studere effekter av transgener på musen NMJ 1-3 eller å sammenligne effektene av alder, kosthold, mosjon og sykdom på gnager NMJs 4-11. Slike studier har lært oss mye om fysiologi og patofysiologi av NMJ, men de ulike parametrene rapportert (f.eks AChR område, gavl areal, omkrets lengde, fragmentering indekser) ofte gjør det vanskelig å sammenligne resultatene av disse studiene. Det er et økende forventning for pre-kliniske forskere å være i stand til å demonstrere reproduserbarhet, særlig i studier med gnagermodeller av sykdommen 12. Protokollen beskrevet her ble videreutviklet gjennom en rekke studier som undersøkte utviklings, fysiologiske og patofysiologiske changes til NMJ. Slike studier krever måling av arealet av synaptiske fordypninger på mus motor gavl og den relative densitet for pakking av synaptiske proteiner i postsynaptiske fordypninger 13-15.

Anvendeligheten av disse fremgangsmåter er illustrert ved nylige studier i en musemodell av anti-moskus myasthenia gravis. Daglige injeksjoner av IgG fra anti-Musk-positive myasthenia gravis pasienter i voksen mus fikk dem til å bli svak innen 2 uker 16. Konfokale maksimum-projeksjonsbilder av muskel seksjoner som ble dobbeltmerket for synaptophysin (i nerveterminaler og postsynaptisk) AChRs viste en progressiv nedgang i det område i AChR farging som den primære endring. Viktigere nedgangen var tilstrekkelig til å forklare sammenlign fall i amplitude av synaptiske potensialer, svikt i synaptisk transmisjon og muskelsvakhet 17,18. Kvalitativt lignende funn ble rapportert av andre forskningsgrupper10,19. De samme NMJ målemetoder har siden blitt brukt til å vurdere effekten av tre medikamenter for behandling av anti-Musk myasthenia gravis i denne musemodell 20,21.

Stillesittende aldring kan føre til tap av nevromuskulære forbindelser. Protokollen beskrevet her har avdekket en aldersrelatert nedgang i området av nerve terminal synaptophysin på motoriske endeplater som mus avanserer inn i alderdommen. De samme metoder viste at frivillig trening kan i stor grad forhindre reduksjonen i presynaptiske nerveterminalen område 22, i samsvar med tidligere arbeider av andre grupper 4. Tap av nevromuskulære forbindelser oppstår også i SOD1G93A musemodell for amyotrofisk lateral sklerose 9,23.

Studiene som er nevnt ovenfor viser at en rekke helsetilstander kan føre til reduksjoner i området av enten pre- eller post-synaptiske spesialiseringer på NMJ. Dette kan føre til svekket synaptic moroDette skjer eller kan innvarsle fullstendig tap av den nevromuskulære forbindelsen. Tre protokollene er beskrevet som tillater kvantifisering av området og tetthet av synaptiske spesialiseringer. Formålet med den første protokoll er å tilveiebringe en praktisk og reproduserbart mål på de områdene av pre- og post-synaptiske fordypninger og deres innretting i pattedyr NMJs, ved hjelp av fluorescens mikroskopi. Todimensjonale maksimal projeksjon konfokale bilder og bildeanalyse med NIH ImageJ brukes til å oppdage endringer i området av synaptophysin flekker (synaptiske vesikler), postsynaptiske AChRs og synaptisk overlapping området. Konfokale bildeparametre (gain og offset nivå) er optimalisert for hver NMJ slik som å maksimere den visuelle informasjonen som brukes til å skjelne det området av synaptiske spesialisering. Neuromuskulær svikt kan også være et resultat av endringer i tettheten av postsynaptiske AChR og / eller andre synaptiske proteiner. Den andre protokollen kan bli anvendt for å detektere endringer i den relative tettheten av postsynaptiske proteiner slikesom Musk, RapSyn, dystroglycan, fosforylert Src kinase og fosforylert AChR 18,21.

I myasthenia gravis, er en redusert tetthet av AChR innenfor den postsynaptiske membranen den umiddelbare årsaken til synaptiske svikt og muskelsvakhet. Den tredje protokollen beskriver en fluorescens Resonance Energy Transfer (FRET) metode for å vurdere endringer i nærhet av tilstøtende AChRs innenfor postsynaptiske membraner 14,15. Denne metoden registrerer energioverføring mellom nabo AChRs merket med fluorescerende-α-bungarotoxin (BGT). FRET skjer bare når de fluorescerende donor og akseptor probene er mindre enn 10 nm fra hverandre. Dette kan avsløre (submikroskopiske) endringer i tetthet av AChR pakking som kan ha direkte relatert til amplitude av synaptiske potensialer.

Disse tre protokoller, raffinerte det siste tiåret, gi utfyllende tiltak av NMJ integritet i en konsekvent og reproduserbar måte. Bruk av standardiserte protokoller ennd parametere bør legge til rette for sammenligning av effektene av gener og miljø intervensjoner ved pattedyr NMJ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

MERK: Design, oppførsel og rapportering av dyreforsøk bør ta hensyn til gjeldende retningslinjer 24. Slikt arbeid må godkjennes på forhånd av den lokale dyrevernmyndighet (i vårt tilfelle Animal etiske komité ved University of Sydney).

1. Avliving av dyr og Muscle Dissection

  1. Overfør mus fra holde rom til et annet rom hvor det avlives med en intraperitoneal injeksjon av pentobarbiton-oppløsning (30 mg / kg) ved hjelp av musen håndteringsmetoden beskrevet av Shimizu 25. Plassere musen tilbake i buret.
  2. Når pust av musen har stoppet for mer enn 1 min, teste foten-uttak refleks ved å klemme forsiktig foten, og hornhinnen refleks ved lett børsting hornhinnen. Bare når refleksresponser er fraværende kan musen være forberedt på disseksjon.
  3. Rådfør deg med en atlas av gnager anatomi som Chiasson 26 og / eller søke hjelp av en erfaringsutvekslingced anatomist før du prøver disseksjon av muskelen av interesse. I hvert fall fjerne hår fra overliggende huden ved hjelp av en liten barbermaskin før du åpner huden å utsette muskelen.
    MERK: disseksjon vil variere for hver anatomisk distinkt muskel.
  4. Med butte tang frigjøre muskel fra overliggende membraner og omkringliggende vev. Ta tak og kutte distal sene å skille muskel fra sin innsetting.
  5. Forsiktig erte og klipp muskelen fri fra omkringliggende vev rett tilbake til sin opprinnelse. I korthet plassere nylig dissekert muskel i 0,1 M fosfat-bufret saltvann (PBS) oppløsning eller Ringers oppløsning før ytterligere behandling.

2. Klar Muscle for Cryosectioning

MERK: Optimal strukturell konservering kan oppnås ved perfusjon hele dyr som tidligere beskrevet 27 eller nedsenking fiksering (for små muskler), som beskrevet i valgfritt trinn 2.1. Imidlertid4% paraformaldehyde fiksering kan svekke påfølgende farging med mange antistoff prober og med fluorescerende-BGT. Glutaraldehyd spesielt bør unngås. Hvis musklene er ikke å bli løst de må umiddelbart hurtigfrosset (fortsett til 2.3).

  1. Valgfritt nedsenking fiksering: Pin muskelen til voks i en petriskål ved hvile lengde. Dekk muskelen med 2% w / v paraformaldehyd (ferskt oppløst i PBS) i 2 timer ved RT. Vaske den med tre endringer av PBS over 30 min (3 x 10 min) og deretter erstatte PBS med 30% vekt / volum sukrose i PBS og inkuberes O / N ved 4 ° C.
  2. Lage former ('båter') på forhånd ved å brette 2 cm x 1,5 cm stykker av aluminiumfolie, som vist i figur 1. Legg et stykke nitrocellulosemembran i bunnen av båten. Forsiktig helle kryostat embedding matrise (Materialer tabell) i båten til en dybde på 2 mm, ta vare å unngå luftbobler. Plasser muskel i båten, samkjøre den med kulepenn linjer pånitrocellulose. Tilsett mer innstøping matrise for derved å fullstendig dekke muskel (figur 1).
  3. Pre-label polypropylen rør med et uutslettelig markør. Plassere en dråpe av vann i hvert rør og kjøle røret i flytende nitrogen.
    MERK: Den frosne vann dråpe opprettdamptrykket og hindrer uttørking under langvarig -80 ° C lagring
  4. Ved hjelp av en ansiktsskjerm, tykke hansker og en stor par butte tang, delvis senke en liten metallbeger (3 cm diameter, 8 cm dyp) inneholdende 2 cm dybde av isopentan i en beholder med flytende nitrogen i 30 sekunder. Fjern begeret og legg den på benken toppen. Ved hjelp av en mindre par sløv tang plassere formen inneholder muskel og innebygging matrisen inn i kjølt isopentan. Pass på å unngå flytende nitrogen blanding med isopentan.
  5. Tillate 2 min for blokken til å fryse helt før med butte pinsett til å løfte den frosne blokken ut og forsegle den i riktig pre-merkede og pre-kjølt rør (trinn 2.3).
  6. Lagre rør midlertidig i flytende nitrogen før overføring til -80 ° C. Logge alle prøvene i et regneark med fryse innholdet.

3. Cryosectioning og fluorescensbeising for en Face Bilder av NMJs

  1. Skrelle bort aluminium mold. Innenfor -20 ° C kryostat kammer feste den frosne blokk til kryostaten chucken, slik som å skjære 20 nm frysesnitt parallelt med lengdeaksen av muskelfibre (figur 1). Plukk opp avsnittene om poly-L-lysin eller gelatin belagt objektglass.
  2. MERK: utelate dette trinnet hvis vevet er fast før frysing. Etter tillater 30 min for seksjoner tørke på lysbildene, fikse dem ved å plassere en nedgang på 2% paraformaldehyde i PBS over hver seksjon i 15 min ved RT.
  3. Vask glir 3 x 10 min i PBS i en Coplin krukke, og deretter fordype lysbildene i PBS som inneholder 0,1 M glysin i 30 min for å blokkere rest aldehydgrupper.
  4. Vask lysbilder i 10 min i PBS, deretter dyppe i metanol (kjølt til -20 ºC) for 7 min. Dette permeabilization trinnet er en rutinemessig del av dobbel merking med fluorescerende-BGT og anti-synaptophysin men det kan påvirke farging for noen andre proteiner.
  5. Vask glir 2 x 10 min i PBS og deretter plassere hvert lysbilde i en stabil og jevnet fuktet kammer. Umiddelbart dekke hver seksjon med 20 ul blokkeringsløsning (0,2% Triton X-100, 2% bovint serumalbumin (BSA) i PBS) i 1 time ved RT. Delene må ikke få lov til å tørke ut på ethvert stadium av immunofarging prosessen.
  6. Utføre den primære inkubasjon: Tar ett lysbilde om gangen forsiktig fjerne overflødig blokkering løsning fra over hver seksjon og erstatte den med 20 pl kanin anti-synaptophysin (fortynnet 1: 200 i blokkering løsningen).
  7. Inkluderer en negativ-kontroll lysbilde som skal inkuberes med bare blokkering løsning. Denne "no-primær antistoff kontroll'Er viktig i hver farging løp.
  8. Ta vare på at det primære antistoffet er fortsatt på plass i løpet av hver del, lukke fuktet kammer og inkuber i 1-2 dager ved 4 ºC.
  9. Inspisere hver del for å bekrefte at det primære antistoffet er fortsatt på plass. Bruk en Pasteur pipette til forsiktig skylle hvert lysbilde med PBS og legg den i en Coplin krukke. Vask alle lysbildene 3 x 10 min i PBS.
  10. Gjennomføre videregående inkubasjon. Tar en lysbilde om gangen, fjern forsiktig overskudd PBS, lå den i fuktet kammer og dekker hver seksjon med 20 pl av en blanding inneholdende FITC-konjugert esel-anti-kanin-IgG og BGT konjugert til tetrametylrhodamin eller annen rød fluorofor (TRITC- / redBGT; 5 g / ml) fortynnet i blokkeringsløsning. Inkuber ved RT i 2 timer.
  11. Vask glir 3 x 10 min i PBS i Coplin krukker.
  12. Tar en lysbilde om gangen, fjern forsiktig overskudd PBS og montere med et dekkglass ved hjelp av et minimalt volum, glyserol-basert, fade-motstand monteringsmedium. Forsegle kantene av Dekk med klar neglelakk. La den tørke hardt.
  13. Lagre lysbildene i mørket ved 4 ºC i opptil en uke, eller ved -20 ºC i lengre lagringsperioder (opptil flere måneder).

4. Saklig Sampling og En Face Imaging of Motor gavler

  1. Blind lysbildene ved å merke hvert lysbilde med en tilfeldig kodenummer som forblir kjent bare til en annen forsker (ikke involvert i analysen). Som et resultat av operatøren forblir blind for behandlingsgruppene før kvantifisering av NMJ parametre er fullført for alle prøvene.
  2. Plasser lysbildet på mikroskopet scenen og vise den under bredt felt belysning med TRITC filtersettet (63X olje 1.3 NA objektiv). Flytt progressivt (felt for felt) fra venstre mot høyre og tilbake til en gavl vises i feltet (Figur 2A).
    MERK: Sampling kriterium: Hver AChR-farget struktur som er relativtflat og vender mot målet (dvs. strekker <15 m i z-dimensjonen) er ansett som en gavl og avbildes for analyse (halvmåner av AChR flekker representere tverrsnitt gjennom endeplater og er derfor ekskludert).
  3. Med det konfokale pinhole satt til 1,0 Airy enhet og lav laser makt optimalisere gevinsten og offset nivåer for TRITC / rød-BGT (532 nm laser) på gavlen som skal avbildes. Neste optimalisere FITC / synaptophysin fluorescens med 488 nm laser. Samle en z-stabel med gavlen med en 0,7 mikrometer intervall mellom hver optisk skive. Lagre bildene med et filnavn som inneholder datoen for bildebehandling økten, kodenavnet på lysbildet og antall gavlen.
    MERK: Skanning ved hjelp av 488 nm og 532 nm lasere (FITC og TRITC) bør samles sekvensielt (ikke samtidig) for å unngå forurensning av FITC kanal ved fluorescens fra den røde fluoroforen og vice versa (blø-through).
  4. Gjenta prøvetaking ennd avbildning av trinn 4,2-4,3 inntil 20 gavler er hentet fra raset / prøven.
  5. Bytt til neste kodet lysbilde og gjenta 04.02 til 04.04. Gjenta dette for hver av de kodede lysbilder.
  6. Samle noen bilder av Gavlplatene fra kontroll lysbilde (ingen primær antistoff kontroll) med konfokale innstillinger som ble funnet optimal for de eksperimentelle lysbilder (FITC fluorescens kanal skal vises mørkt).
  7. På slutten av det konfokale sesjon overføre bildefilene til en annen datamaskin og tilbake opp de originale filene på en ekstern harddisk eller server.

5. Måle Area of ​​Synaptiske Spesialiseringer i en Face Images

  1. Bruk NIH ImageJ freeware (http://imagej.nih.gov/ij/) for å forberede maksimal projeksjon (MIP) bilder fra hver z-stack. Lagre dem som tiff-filer (Figur 2A & B). Filnavn bør inkludere bildet økten dato, eksempelkode, gavl nummer og fluorescerende kanal (f.eks 060414_5723_7_FITC.tiff).
  2. Åpne z-projeksjon bilde i ImageJ. Velg acetylkolin reseptor bildekanalen (figur 3A) og velg: Bilde> Type> 8-bit for å konvertere 24-bits RGB farget bilde i tre 8-biters gråtone bilder på skjermen.
  3. Bruke ImageJ polygon verktøyet tegne en grov skisse rundt gavlen av interesse i redBGT farget (AChR) kanal, slik som å inkludere alle tilsynelatende farget regioner av bestemt person gavl, mens unntatt noen flekker som ikke stammer fra gavlen av interesse ( Figur 3C).
  4. Påfør et minimum intensitet terskel til bildet ved å velge: Bilde> Juster> Threshold (Figur 3E og tilknyttede ImageJ skjermbilder).
  5. Juster terskelnivå for derved å isolere de AChR-fargede partier under utelukkelse av omgivende bakgrunnssignal som sub-terskel (figur 3E). Åpne en ny vindow med den opprinnelige (kontinuerlig-tone) bilde umiddelbart ved siden av vinduet for sammenligning, for å lette avgjørelsen om terskelverdien. Spill terskelverdien for senere bruk i colocalization analyser.
  6. Beholde polygon omriss rundt gavlen velge: Analyze> Analyser Partikler. I pop-up meny spesifisere rekke størrelser som: 50 til infinity piksler (dette eliminerer små gjenstander som skyldes elektrisk støy i fotomultiplikatoren).
  7. Analyser Partikler kommandoen genererer et vindu med en liste over diskrete supra-terskelområder og deres fluorescens intensitetsverdier nummerert slik de vises i den binære bildet (Figur 3G og tilhørende ImageJ skjermbilde). Kopiere disse dataene inn i et merket regneark.
  8. Mål Total gavl området (området innenfor polygon) ved å velge: Analyser> Mål. Dette gir totalt gavl området. Kopier og lim inn data for AChR områder og intensiteter innet regneark og pass på å merke kolonner på riktig måte, vil rader brukes for individuelle gavler for bestemte lysbilder.
  9. Bytt til den anti-synaptophysin fluorescens kanal og gjentar trinn 05.01 til 05.05, men for FITC kanal (figur 3B, D og F). Målet er å justere terskelen slik at det skaper et binært bilde som, så nær som mulig, fyrstikker grensene for farging som oppfattes av øyet. Spill terskelverdien.
  10. Måle arealet av overlapping ved å bruke følgende fremgangsmåte: Åpne den opprinnelige filen som inneholder de to kanal bilder og dele den i to separate bilder ved å velge: Bilde> Stabler> Stable til bilder.
  11. Bruke colocalization plugin (lastet ned og installert fra ImageJ webside) Velg: pluggin> colocalization og innsatsterskelverdiene tidligere registrert for AChR og nervekanaler i den respektive kanal spør boksen. Dette vil gi en overlapping bilde i hvite piksler (Figur 3 H og tilknyttede ImageJ skjermbilder).
  12. Konvertere den nyopprettede overlapping bildet inn i en gråskala-formatet og bruke en terskel til maksimumsverdien. Den maksimale terskel vil bare velge de hvite bildeelementer, tilsvarende overlappingsområdet for de to foregående kanaler. Rekord i regnearket den resulterende området verdien av 'colocalization', som representerer området av overlapping i piksler.
  13. Forberede et regneark med data utvalgsgjennomsnitt, beregne og plotte standardavvik og standardfeil som histogrammer eller scatterplots 20,22. Legg merke til at verdien av n generelt representerer antallet mus pr prøvegruppe for statistiske formål.
  14. Plot endeplate AChR områder som scatterplots eller frekvens histogrammer for å fastslå om dataene er normalfordelt før statistisk testing (Figur 6).

6. Relativ FargingIntensiteter sammenlignet ved bruk Tverrgående Optiske Seksjoner

MERK: For denne protokollen prosessen alle muskelprøver sammen og bilde i en enkelt konfokal økt. I planleggingen av et eksperiment tillater opp til 30 min bildebehandling tid per muskelprøven.

  1. Kutt 15 um frysesnitt på tvers av lengdeaksen av muskelfibre og samle inn lysbilder som beskrevet i trinn 3.1.
  2. Utføre fluorescens farging som beskrevet i trinn 3.2 til 3.13.
  3. Kode de fargede lysbilder slik at bildebehandling og analyser foretatt med operatøren blind til behandlingsgruppe, som beskrevet i trinn 4.1.
  4. Ved hjelp av en 40X fluorescens objektiv (NA 0.75) kort kartlegge en seksjon fra hvert lysbilde for å en eneste forsterkning og offset nivå setting for AChR som vil være egnet for alle gavler på tvers av alle prøve lysbilder. Den lyseste gavl skal da være like under 256 grå på skalaen. Denne optimaliseringen bør skje separat for andre fluorescence-kanal (samlet suksessivt). Spill den faste styrken og avviket nivå innstillinger og ikke ødelegg dem gjennom hele bilde økten.
  5. Samle bilder av en standard fluorescens lysbilde (f.eks, ikke-blekende fluorescerende kuler), ved bruk av de samme parametere, ved begynnelsen og slutten av konfokal økt for å detektere eventuell variasjon i laserintensiteten.
  6. Bruk AChR kanal for å skanne raset gradvis å finne endeplater.
  7. Fokus for å finne den eneste optiske delen flyet i hvert mikroskop felt som inneholder flest antall AChR-farget endeplater.
  8. Skanne dette enkelt optisk delen to ganger og lagre gjennomsnitt bilde (Figur 4G).
  9. Å holde den samme fokalplan bryteren til den andre fluorescens kanalen (protein av interesse), og samle det bilde som i trinn 6.8. Arkivere bildefilen, inkludert i filnavnet: dato for bildebehandling sesjon, eksempelkode, bilde nummer og et symbol for å indikere den fluorescerende kanalen. F viser eksempler på gavlen distribusjon av AChR forhold til RapSyn, moskus eller -dystroglycan (-DG).
  10. Flytte scenen til neste felt som inneholder en eller flere gavler og gjenta steg 6,8-6,9. Gjenta dette til totalt 60 gavler er avbildet.
  11. På slutten av bilde session overføre alle filene til en annen datamaskin og sikkerhetskopiere dem.
  12. Åpne hver opprinnelige bildefilen og mens du ser på AChR kanal, velger du: Bilde> Stabler> Stable til bilder, å splitte kanalene.
  13. Velg: Bilde> type> 8bit å konvertere til 8-bit gråskala format på skjermen. Gjør dette for begge fluorescens kanaler.
  14. Velg: Bilde> Stabler> Bilder å stable. Åpne en ny bunke fra to tidligere atskilte 8-bits bilder. Man kan deretter bytte beleilig mellom de to fluorescens kanaler innenfor ett vindu.
  15. Bruk polygonverktøyet til å tegne en line tett rundt grensen av AChR farging (figur 4I).
  16. Velg: Analyser> Mål å måle gjennomsnittlig pikselintensiteten for AChR innenfor lukket område (merk viktigheten av å trekke linjen tett). Kopier denne verdien i en merket regneark.
  17. Beholde den samme polygon omrisset (å definere området som skal måles), bytte til den andre fluorescerende kanal (f.eks 4B, D, F) og velge: Analyser> tiltaket. Dette vil gi den gjennomsnittlige fargeintensitet for proteinet av interesse innenfor det området som defineres av synaptiske AChR farging.
  18. Velg et område fra synlig gavl flekker deretter velge: Analyser> Mål å måle gjennomsnittlig bakgrunn fluorescens intensitet. Gjenta dette for den andre fluorescens kanal / s og kopiere bakgrunnsverdiene i regnearket av fluorescens verdier.
  19. Subproselyttering gjennomsnittsbakgrunnsverdier fra endeplate verdier for å oppnå de korrigerte intensiteter for AChR og proteinet av interesse ved hver gavl.
  20. Fordel de korrigerte endeplate intensitetsverdier for proteinet av interesse ved den korrigerte BGT fluorescensintensitet for å gi fluorescensintensiteten forholdstall 14,21

7. Sammenligning av postsynaptiske membran AChR Tetthet Bruke FRET

MERK: Denne protokollen vurderer i hvilken grad AChRs er tett pakket (<10 nm avstand) i den postsynaptiske membran. Den nøyaktige donor og akseptor-fluoroforen kombinasjon er avgjørende for denne FRET-assay. Navn og detaljer om fluoroforene er gitt i Materials tabellen. Deres spektrale egenskaper i forhold til slite, er omtalt i våre tidligere papirer 14,15.

  1. Forberede faste tverrfrysesnitt som beskrevet i punkt 6.1. Alle utvalgsgrupper må behandles sammen og bilded i samme konfokal økt.
  2. Bland 2,5 g / ml røde BGT (FRET donor) med 10 g / ml langt rød-BGT (FRET akseptor) med blokkeringsløsning i et lite plastrør ved å pipettere opp og ned 12 ganger. Denne 1: 4 molar blanding maksimerer effektiviteten av FRET 14.
  3. Plassere hver side i et fuktet kammer, nøye dekke hver seksjon med en dråpe (12 ul) av den ovennevnte blandingen og inkuberes i 1,5 timer ved romtemperatur.
  4. Kontroll seksjoner: dekke små antall seksjoner med 2,5 g / ml rød-BGT (donor bare; merket C1 kontroller), og også noen sider med 10 g / ml langt-rød-BGT (akseptor bare; merket K2 kontroller). Inkuber disse kontrollene som i trinn 7.3.
  5. Vask glir 3 x 10 min i PBS og montere i glyserol-basert, fade-motstand monteringsmedium (se trinn 3.12).
  6. Utføre prøvetaking av gavlene som i trinn 6.7. Fluorescens fra donor og akseptor skal ligge nøyaktig ko-lokalisert på endeplatene på grunn av tilfeldig binding av fluorescent-BGT molekyler.
  7. Kontroll bilder: Bruke 40X objektiv og lav laser makt optimalisere redBGT gain og offset nivåinnstillinger for Gavlplatene fra en kontroll lysbilde C1. Optimalisere langt redBGT gain og offset nivåer for Gavlplatene fra kontroll lysbilde C2. Bekrefte fravær av fluorescens blø gjennom.
  8. Uten å endre laser makt, få eller offset-nivå innstillinger flytte til de eksperimentelle lysbilder og samle bilder (pre-photobleach) for begge fluorescens kanaler.
  9. Selektivt photobleach langt-rød-BGT over en del av en enkelt gavl ved å zoome inn skanneområdet deretter skanne 10 ganger med 633 nm laser på 100% effekt. Fluorescens i det skannede området bør bli utydelige.
  10. Tilbakestille laser makt og zoome og samle etter bleike bilder på både fluorescerende kanaler ved hjelp av konfokale innstillinger etablert på 7,7.
  11. Beregn FRET effektivitet (E) fra den prosentvise økningen i donor (rød-BGT) fluorescens følgende photobleach av akseptor (langt-rød-BGT) i henhold til den følgende formel *:
    Ligning 1
    * For alle situasjoner hvor fluorescensen til donor øker etter fotobleking av akseptor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Måling av Synaptic området ved NMJ

Enhver estimat av området er avhengig av tegningen av en grense for å definere omfanget av synaptiske fordypninger. Hos friske unge voksne muskler NMJ bildene skal vise veldefinerte grenser for både AChR og synaptophysin farging (figur 2A og B). Fluorescensintensitet for både AChR og synaptophysin stiger kraftig på grensen mellom peri-synaptiske og synaptisk del av motorens endeplate (figur 5A 'og B'). For slike bilder minimum terskel (like over extrasynaptic bakgrunn fluorescens) vil lett isolere AChR-rik eller synaptophysin-rikt område i gavlen (horisontal stiplede linjer i (Figur 5A 'og B')). I alderen mus og i noen sykdomstilstander gavl farging for AChR kan være mindre intens, kan AChR klase kanter vises uskarpt ogre kan være høyere nivåer av extrasynaptic autofluorescence (Figur 5D; 17,22). Fluorescensbeising med uklare grenser kan introdusere feil i beregninger av synaptiske området. I alle tilfeller tar man sikte på å velge en terskelverdi som gir et binært bilde tilsvarende i form og størrelse til AChR- eller synaptophysin rike områder som de vises til øyet i den opprinnelige, kontinuerlig tone-bilde. Gjennomføre analysen blind behandlingsgruppen skal redusere risikoen for subjektive skjevhet på terskeltrinn (trinn 4.1). Noen ganger er svake eller uskarpe bilder endeplate kan resultere fra sub-optimal behandling. Figur 2C og D viser et eksempel på en lav kvalitet gavl bilde fra en frisk 2-måneder gamle mus. Uklare kanter og svak synaptophysin flekker kan ha oppstått i dette tilfellet fra delvis tining og gjenfrysing av muskelen før cryosectioning. Enkelte deler av ung sunn (positiv kontroll) muskel skal seksjoneres ennd behandlet parallelt med eksperimentelle prøver å sikre at eventuelle verdifall tydelig i de NMJ bildene er ikke på grunn av problemer med farging. Bilder av gangen kompromittert av sub-optimal behandling bør utelukkes fra analysene.

For no ansikt z-stack bilder, 15-20 Gavlplatene er en rimelig utvalgsstørrelse for å estimere synaptiske områder. Et bredt mangfold i former og størrelser av NMJs finnes innenfor en gitt muskel. Scatterplots avsløre et betydelig utvalg i AChR rikt område blant Gavlplatene av tibialis anterior muskelen av ethvert individ mus (figur 6A). Likevel, den gjennomsnittlige AChR området (basert på 15-20 en face endeplate bilder) var lik blant syv prøve mus (~ 200 m 2, Figur 6A). Arealet av gavl synaptophysin flekker også variert betydelig mellom gavler fra en gitt muskel. Nok en gang, ved hjelp av en utvalgsstørrelse på 15-20 gavlene gjennomsnittlig areal av gavl synaptophysin var simiLar blant de syv mus studert (~ 170m 2, figur 6B). Frekvens histogrammer av sammenslåtte data avslørte omtrent normalfordelinger for området av gavl AChR og synaptophysin (figur 6A 'og B'). Men en normal fordeling av synaptiske områder kan ikke forutsettes i sykdomstilstander som for eksempel myasthenia gravis 16,20. Dette kan påvirke valget av den statistiske testen.

Tabell jeg lister områder av pre- og postsynaptiske spesialiseringer for NMJs for sunn 2 måneder gammel (ung voksen) kvinnelig C57Bl / 6J mus fra tidligere studier. Områdene både pre- og post-synaptiske spesialiseringer falt med stillesittende aldring 22. AChR området ble også kraftig redusert i mus injisert med IgG fra anti-Musk myasthenia gravis pasienter 17,21. Myastent mus behandlet med kolinesterasehemmer narkotika, pyridostigmin, vises en ytterligere betydelig reduksjon i gavl AChR område 20 </ Sup>.

Relativ intensitet av gavl fluorescens merking

Den relative intensitet av immunfluorescens merking kan avdekke endringer i tettheten av en synaptisk protein interesse med alderen, genotype og / eller sykdomstilstand. AChR fluorescens (rød-BGT eller langt-rød-BGT) blir først brukt til å definere plasseringen av NMJ. Lysstyrken i fluorescens i løpet av de 8-bits AChR-rikt område blir så brukt for å vurdere endringer i konsentrasjonen av proteinet av interesse i forhold til kontrolldyr. I tverrgående seksjoner gavlen AChRs vises vanligvis som en halvmåneform, men denne form er ofte uregelmessig (figur 4A, C, E, H). Lav intensitet bakgrunnsfluoresens avslører vanligvis om en oppdatering av AChR farging representerer en enkelt gavl, eller to separate gavlene ligger på tilstøtende muskelfibre. Mange synaptiske proteiner (som RapSyn, musk og SRC) ercolocalized med AChR på gavlen (Figur 4A - D). Immunfluorescens farging med fosfo-spesifikke antistoffer kan også anvendes for å sammenligne effekten av eksperimentelle intervensjoner på fosforylering status av bestemte postsynaptiske membranproteiner 21.

Påliteligheten og reproduserbarheten av fluorescensintensitet målingen i stor grad avhenger av integriteten av den frosne muskel og kvaliteten av immunfarging. Musklene skal dissekert og umiddelbart snap-frosset eller Paraformaldehyde-fast (bare minutter fra døden av dyr) for å unngå degenerative forandringer til NMJ. Immunfarging avhenger i stor grad av kvaliteten av de anvendte reagenser og optimalisering av farging protokoll for spesifikke antistoffer. For noen ny gruppe med primær antistoff pilot immunofarging eksperimenter er nødvendig. Nyklipt frysesnitt av friske unge muskler inkuberes med serie to-fold fortynninger av det primære antistoffet. Akjent pålitelig sekundære antistoff blir brukt og resultatene er sammenlignet. Hvis proteinet av interesse er kjent for å være begrenset til NMJ så det beste antistoffkonsentrasjon er den som gir det høyeste forhold av NMJ fluorescensstyrke i forhold til det som finnes i extrasynaptic deler av muskelen (bakgrunnsfluorescens). Extrasynaptic (formodentlig ikke-spesifikk) fluorescens intensitet bør normalt ikke overstige 15% av gavl fluorescens intensitet. Tilsvar 'ingen primær antistoff kontroll' seksjoner (ruges bare med sekundært antistoff) skal vises mørkt, noe som bekrefter at det sekundære antistoffet ikke binde ikke-spesifikt. Kvaliteten av forskjellige satser av (polyklonale) sekundære antistoffer kan variere betydelig, slik alternative sekundære antistoff partier bør sammenlignes før etablering av en standard protokoll. Den ideelle testen for spesifisiteten av immunfluorescens innebærer en direkte sammenligning av seksjoner fra villtype-mus og negative kontrollseksjoner fra mus tlue mangler protein-of-interesse (genet knockout). Følgende referanser beskriver kvantifisering av gavl fluorescensbeising for Musk, RapSyn, dystroglycan, src og AChR 13,14,18,21.

Små utvalgsstørrelser introdusere feil i beregninger av relativ fluorescens intensitet. Individuelle gavler variert betydelig i fluorescens intensitet. Antagelig denne variasjonen mellom gavlene innenfor en gitt muskel gjenspeiler mangfoldet av NMJ struktur og tilfeldige forskjeller i den optiske delen samplet. Imidlertid øker antallet av endeplater samplede resulterer i en mer stabil estimat av gjennomsnittlig fluorescensintensitet (figur 7). For å estimere den gjennomsnittlige gavl fluorescens intensitet 40-60 Gavlplatene fra hver muskelprøven skal i gjennomsnitt.

AChR-AChR FRET

Hver AChR er en pentamer med to bindingssteder for BGT (ligger en på hver alfa-subenhet). Binding avrød-BGT og langt-rød-BGT til disse to områdene ville vike en donor-akseptor separasjon av om 9nm 28-30. Dermed lav effektivitet FRET kan oppdages selv før AChRs montere inn klynger 14. Imidlertid omtrent doblet effektiviteten av FRET på murine gavler postnatalt, i samsvar med den mer effektiv inkorporering av AChRs inn i en tettpakket postsynaptiske membran gitter 14. Ved hjelp av rød-BGT og langt-rød-BGT som gnage donor og akseptor (henholdsvis), endeplatene av 1-2 måneder gamle mus ga gjennomsnittlig FRET effektivitet varierer 20-37% (tabell 2). FRET effektivitet på 20% eller mer er tenkt å representere tett pakking av AChRs 14. Gavl FRET effektivitet ble litt redusert etter denervering 14, og kraftig redusert etter mus ble injisert med IgG fra anti-Musk-positive myasthenia gravis pasienter 18. Dette er forhold som enkelt AChRs er mindre tett pakket inn i postsynaptic membran stillaset av den postsynaptiske Musk / RapSyn system 31.

Figur 1
Figur 1. Inkludering og frysing muskler for cryosectioning (1-5) Klar muggsopp ('båter') før den fryses ned en gruppe med muskler:. (1) Aluminiumsfolie er kuttet i rektangler (2,0 x 3,0 cm) og (2). Foldet som tiltalt for å skape en mold / båt (3). (4) rektangler av nitrocellulose immunoblotting papir er kuttet for å passe i formen og en kulepenn brukes til å herske linjer for å orientere muskelen. (5) Den nitrocellulose rektangelet er plassert i formen. (6-8) Inkludering og frysing muskler: (6) Kryostat innstøping matrise fluid forsiktig helles i formen (på toppen av nitrocellulose) til en dybde på 2 mm. (7) fin pinsett brukes til å senke muskel, sene ved sin inn i forsenkningen matrise, i flukt med nitrocellumister kjennelser, (8) Tilleggs embedding matrise er forsiktig helles i formen til å dekke muskelen, ta vare å unngå å skape bobler. Den innebygde muskelen blir deretter hurtigfrosset, forseglet i tuber og lagret ved -80 ° C som beskrevet i teksten. (9-12) fremstilling etter cryosectioning: (9) fin pinsett brukes til å skrelle bort aluminiumsformen og den frosne blokk blir deretter plassert i -20 ° C kryostat kammeret (10) Markeringene i nitrocellulose anvendes for å justere muskelen parallelt med flaten av chucken (11) for langsgående snitte (12). En dråpe væske cryo-innstøpningsmediet brukes til å feste blokken til den nedkjølte chucken. Blunt tenger brukes til å manipulere den frosne blokk muskel. For å oppnå tverrgående seksjoner, blir blokken i stedet montert slik at muskelen er vinkelrett på overflaten av chuck (ikke vist).

Figur 2
Figur 2. en Face bilder av NMJs fra tibialis anterior muskelen av to måneder gamle kvinnelige C57BL6J mus. Den friske muskler var snap frosset og seksjonene fast på lysbildet som beskrevet i trinn 3.2. Maksimal intensitet projeksjon bilder av z-stabler ble oppnådd som beskrevet i den første protokollen. (A) rød-BGT flekker avslører en enkelt motor gavl som består av to sett med AChR-rike primære postjunctional takrenner (no ansikt visning). (B) synaptophysin farging med FITC-konjugert sekundært antistoff avslører den presynaptiske nerveterminal, opptar de primære synaptiske takrenner. En del av den pre-terminale axon er også synlig i den øvre del av panelet. (C & D) Et eksempel på en dårlig kvalitet NMJ bilde fra en ung frisk mus. Farging er svak og grensene for de pre- og postsynaptiske spesialiseringer er uskarpe. Dette ble tilskrevet mangler i tHan behandling av vev og / eller utilstrekkelig tid tillates for det primære antistoff inkubering. Skala bar i panelet D representerer 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. trinn i behandlingen av en ansikt NMJ bilder (som skissert i protokoll 1). (A & B) Originale kontinuerlig tone MIP-bilder viser rød-BGT fluorescens avslørende AChR og grønt immunfluorescens for synaptophysin hhv. (C) AChR flekker etter konvertering til en 8-biters grå-skala bilde og bruk av polygonverktøyet å avgrense gavl (tynn gul linje). (D) gavl grenselinjen overført til den grønne synaptophysin bilde. (E) Application av en minimum intensitet terskel kommando for å opprette et binært bilde som isolerer suprathreshold rød-BGT (AChR) fluorescens. Sekvensen av ImageJ brukergrensesnitt skjermbilder vises til venstre for bildene. (F) Binary synaptophysin bilde etter påføring av en egen terskel. (G) Identifikasjon av diskrete suprathreshold AChR-rike domener innenfor gavlen ved anvendelse av Analyze partikler kommando til binær røde BGT bilde. Den tilsvarende ImageJ (venstre panel (G) viser inngangsdata som kreves. Den minste størrelsen på suprathreshold pixel områder kreves bør legges inn. (H) Identifisering av områder av overlapping av det binære synaptophysin og AChR bilder. Overlapping er representert med hvite piksler . ImageJ brukergrensesnitt screenshots (under panel H) viser trinnene for å komme frem til den binære overlapping bilde. De valgte minimums intensitet terskelverdier for hver fluorescens channel må angis innenfor "colocalization vinduet. Scale bar representerer 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Eksempler på tverrgående optiske seksjoner som brukes til å sammenligne relative fluorescerende intensitet (protokoll 2). Muskelen ble hurtigfrosset og seksjonene fast på lysbildet som beskrevet i trinn 3.2. (A & B) En enkel gavl dobbeltmerket med langt -Red-BGT (AChR, her vist i blå pseudocolor) og FITC- anti-RapSyn illustrerer samlokalisering av disse to samspill proteiner i den postsynaptiske membran (C & D) To gavlene på tilstøtende muskelfibre skjerm co-lokaliserte AC. HR og musk. (E & F) En gavl dobbeltmerket for AChR og -dystroglycan (-DG). Den -DG strekker rett rundt muskelfibrene omkretsen men er beriket på gavlen (skala bar i F, for paneler AF: 25 mikrometer) (G - I) Isolere en gavl for intensitetsmåling (G) En typisk mikroskop feltet.. inneholder tre langt-rød-BGT-farget Gavlplatene (skala bar i panelet G: 40 mikrometer (H) En forstørret bilde av eske gavl (I) Den samme gavl konvertert til en 8-biters gråtonebilde og avgrenset ved hjelp av polygon.. . verktøy av ImageJ (tynn gul linje) er gjennomsnittlig fluorescens intensitet målt innenfor denne grenselinje. (skala bar for H & I: 10 mikrometer) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

ontent "fo: keep-together.within-side =" always "> Figur 5
Figur 5. Påvirkning av bildekvalitet i vurderingen synaptisk område. (A & B) Høy kvalitet eget ansikt bilder av en sunn NMJ fra en 2 måneder gammel mus vises på den rød-BGT og anti-synaptophysin fluorescens kanaler. (A '& B ') Fluorescens intensitet profiler tilsvarer linjen trukket over gavlen for henholdsvis A og B. Den horisontale stiplede røde linjen viser minstekravet brukes til å lage binære bildet. (C & D) gavl fra en eldre mus. Gavl synaptophysin farging er generelt mindre intens. (C 'og D') belastningsprofiler viser et høyt nivå av extrasynaptic (baseline) fluorescens svingninger i synaptophysin (FITC) kanal (idenjord) som påvirker bestemmelsen av en passende terskel. Mye av dette er bredspektret vev autofluorescence. Skala barer representerer 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6. Variasjon av synaptiske områder blant NMJs innenfor en muskel og mellom mus. (A) Scatterplots viser total AChR rikt område av Gavlplatene fra tibialis anterior muskelen av syv naive to måneder gamle kvinnelige C57Bl / 6J mus innhentet av forfatter NT. Hvert symbol representerer en gavl. Hver søyle representerer gjennomsnitt ± SD for Gavlplatene samplet fra en mus. (B) Scatterplots viser synaptophysin rikt område for de samme gavler. (A ') (B ') Frekvensfordeling for synaptophysin rikt område av gavlene (sammenslåtte data). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7
Figur 7. Virkning av prøvestørrelse på estimater av gavl fluorescensintensitet. Tverr optiske deler ble benyttet for å måle fluorescensintensiteten (i vilkårlige enheter) 40 60 endeplater fra tibialis anterior muskelen hos en frisk 2-måneder gamle mus. Kumulative gjennomsnitt er plottet mot antall Gavlplatene inkludert i gjennomsnitt. (A) gavl rød-BGT fluorescens intensitet innhentet av forfatter AV. (B) Anti-synaptophysin immunfluorescens intensitet for de samme gavler som i panel A. (C) gavl langt-rød-BGT fluorescens intensitet hentet fra en annen muskelprøven etter forfatter NG. (D) Anti-RapSyn immunfluorescens intensitet fra de samme gavler som i panel C.

Studie Muskel antall mus AChR område Synaptophysin område Overlapping område
gjennomsnitt ± SD (μm2) gjennomsnitt ± SD (μm2) gjennomsnitt ± SD (μm2)
Morsch et al. (2012) 1 gastrocnemius 3 181 ± 7 163 ± 24
membran 3 130 ± 41 102 ± 21 76 ± 26
Morsch et al. (2013) 1 tibialis anterior 3 166 ± 26 117 ± 21 nd
Cheng et al. (2013) 2- tibialis anterior 4 226 ± 18 150 ± 44 110 ± 34
Tse (upublisert) 2 tibialis anterior 7 213 ± 27 157 ± 23 111 ± 11
1 avbildes på en Zeiss LSM 510 Meta mikroskop, men med fast gain og offset nivåer. Terskelverdier og synaptiske områder målinger brukes Metamorph software av MM.
2 avbildes på en Leica DM IRE2 mikroskop og analysert etter gjeldende protokollen av den indikerte førsteforfatter, blind for behandlingsgruppen.
nd ikke bestemt.

Tabell 1. Synaptiske områder for NMJs av 2 måneder gamle kvinnelige C57BL / 6J mus (friske kontroller)

Studie Muskel FRET effektivitet (%) * Range (%)
(Gjennomsnitt ± SEM)
Brockhausen et al. (2008) tibialis anterior 24 ± 1 na
Cole et al. 2010 tibialis anterior 26 ± 1 22 - 30
Morsch (upublisert) membran 37 ± 1 24-47
Ghazanfari (upublisert) tibialis anterior 30 ± 1 20 - 45
* FRET mellom rød-BGT og langt-rød-BGT (Förster radius for FRET pair = 51A (Life Technologies).
na data ikke tilgjengelig

Tabell 2. Effektivitet for AChR FRET fra unge voksne mus C57BL6J mus

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Protokollen beskrevet her har gjort oss i stand til å pålitelig måle og kvantifisere endringer i egenskapene til NMJ tvers av en rekke forhold, blant annet normal aldring og sykdomstilstander. Metodene som er beskrevet for en ansikt NMJ bilder vil tillate forskere å sammenligne området av pre- og postsynaptiske spesialiseringer og arealet av synaptiske overlapping / justering. For å sammenligne den relative intensiteten av pre- og postsynaptiske proteiner i andre protokoll, som bruker optiske tverrgående seksjoner, er foretrukket. Den tredje protokoll spesifikt tester for endringer i nærhet av pakking av AChRs i den postsynaptiske membranen.

Spesifisitetskontroller er avgjørende i immunfluorescens mikroskopi. Ved bruk av en hvilken som helst primær antistoff for indirekte immunfluorescens er det nødvendig å først sørge for at det binder spesifikt til målet protein i muskel seksjoner. Ulike typer vev behandling og fiksering kan forskjellig endre spesifisitetantistoffer. Det er viktig å bekrefte at immunfluorescens farging (for eksempel RapSyn) virkelig er konsentrert med AChR på motor gavl. Negative kontrolldelene må også inspiseres for å sikre at antistoffbinding er bestemt. For eksempel, ville den beste negativ kontroll for RapSyn immunfluorescens være seksjoner fra RapSyn - / - mus. Disse bør viser ingen gavl farging med anti-RapSyn. Ikke-spesifikk fluorescens kan også oppstå fra endogene fluorescerende kjemikalier i vev (autofluorescens), eller fra ikke-spesifikk binding av det fluorescerende sekundært antistoff konjugat. Slik fluorescens er ofte forverret av aldehyd fiksering. I tillegg kan TRITC-BGT farging av endeplater noen ganger bli detektert i FITC fluorescens-kanalen, og denne fluorescerende gjennomslag kan forveksles med spesifikk FITC immunofluorescens. For å beskytte mot de tre sistnevnte formene for ikke-spesifikk fluorescens, bør hver gruppe med lysbilder som er farget inkludere noen 'no-primær antistoff kontroll 'seksjoner (trinn 3.7 og 4.6). Bilder av endeplater av disse kontrollseksjoner skal sammenlignes med de fra de eksperimentelle lysbilder for å sikre at den indirekte immunfluorescens-fargingen av NMJs reflekterer virkelig binding av det primære antistoff.

Transverse konfokale seksjoner er spesielt nyttige for å vurdere forskjeller i den relative intensiteten til farging ved synapse. I tverr konfokale seksjoner er det lettere å bedømme nøyaktig samlokalisering av synaptiske proteiner. Den halvmåneformede gavl profil representerer bare et eksempel kutt gjennom den NMJ i spørsmålet. Imidlertid er bakgrunnen (extrasynaptic) fluorescens generelt lavere i forhold til eget ansikt z-projeksjon bilder. Dermed kan det være lettere å diskriminere "ekte" (spesifikk) farging og etablere faste konfokal gain og offset verdier ved hjelp av tverrgående optiske §§ 13-15,18. For eksempel, i en musemodell av myastenia gravis (der hvore gavl AChR farging er kraftig redusert) Gavlplatene ble klart avgrenset i tverrgående optiske seksjoner 18,21. Forskjeller i den gjennomsnittlige intensitet av fluorescens ved NMJ sannsynligvis reflekterer forandret tetthet av målproteinet i den synaptiske fordypning. En påminnelse er at i noen situasjoner, kan en strukturell endring i målproteinet eller okklusjon av antistoffbinding av nabo proteiner forklare endret fargeintensitet.

Utformingen av forsøkene krever noen behandling. I mange tilfeller forsøket ville ta sikte på å teste virkningen av et transgen, gen knockdown eller sykdomstilstand av størrelsen av NMJ. Den eksperimentelle prøvegruppen kan deretter bli sammenlignet med friske, unge (villtype) mus av samme kjønn og genetisk bakgrunn. Utgangsverdier for området av gavl synaptophysin, AChR og synaptisk overlapping av flere muskler er gitt i tabell 1. Prøve størrelse vil være avhengig av graden av animalsk-to-animalsk variasjon innenfor behandlingsgrupper og størrelsen effekt (forskjell i midler for den eksperimentelle versus kontrollgrupper pr standardavvik). Når analysen er begrenset til god bildekvalitet en rimelig grad av konsistens ble funnet i prøven betyr for endeplate områder blant sunne to måneder gamle kvinnelige C57BL6J mus (Figur 6A og B). Dermed var det mulig å påvise betydelige 30-40% reduksjon i synaptisk område i mus injisert med IgG fra anti-Musk-positive myasthenia gravis pasienter, sammenlignet med kontroller med en utvalgsstørrelse på tre mus 17,20,32. Eldre mus viste større dyr til dyr variasjon i endeplate parametre enn ung mus 22. Følgelig forsøk med eldre mus kanskje behov for større utvalgsstørrelser.

Hvis den primære bekymring er å måle størrelsen på en face gavl da gevinsten og offset innstillinger nivå skal være optimalisert for hver enkelt NMJ. Individual NMJs kan variere betydelig i lysstyrken AChR og synaptophysin flekker, spesielt når sykdomstilstander er undersøkt. Videre intensiteten av ekstra-synaptiske (ikke-spesifikk) fluorescens er ofte høyere og mer variabel i musklene i aldrende dyr, sammenlignet med de av friske unge dyr (Figur 5C og D). Den 1-256 grå-skala skal kunne utnyttes fullt ut for derved å maksimere den tonale informasjon som vil bli holdt tilbake i det endelige bildet. Dette vil innebære å justere forsterkningen og offset nivåer for hver NMJ hvor en z-stabel som skal samles inn. Figur 5D viser et eksempel på et bilde hvor NMJ tonal informasjon kan være avgjørende for å definere grensene for området av pre- og post- synaptiske spesialiseringer.

Målinger av synaptiske områder kan anvendes på forskjellige muskelpreparater og eksperimenter. De fleste av våre målinger av synaptiske områder har ansatt langsgående frysesnitt fra snap frosne muskler. Frysing muskelen før fiksering opprett antigenisiteten av et bredt spekter av proteiner. Når kompatibel med antigenet, paraformaldehyd fiksering og sukrose infiltrasjon før cryosectioning (trinn 2.1) kan gi bedre bevaring av NMJ struktur. Optimal strukturell konservering kan oppnås ved kardial perfusjon med paraformaldehyd. Gjenstander av frysing og seksjonering kan være helt unngås ved merking gavlene på overflaten av de intakte muskler og bilde NMJs på fascicles ertet fra den faste muskler 21. Uavhengig av forberedelser, prosedyrer for prøvetaking, bildebehandling og området kvantifisering forbli uendret (protokoll trinn 4-5). Konsekvent anvendelse av blindprøver, bildebehandling og analyseprotokoller (ved hjelp av forskjellige operatører, forskjellige prøver av mus og forskjellige tider), kan resultere i ganske reproduserbare gjennomsnittlige verdier (sammenlign Cheng et al., Og Tse resultatene i tabell 1).

"> Endeplater er blitt beskrevet som å bli" fragmentert "i en rekke sykdomstilstander. For eksempel, i aldrende mus muskler, sporadisk degenerasjon av en muskelfiber (etterfulgt av dens regenerering) resulterte i remodellering av pretzel-lignende endeplate AChR plakk danner flere mindre AChR klynger 6. Hos mus injisert med IgG fra anti-Musk myasthenia gravis pasienter, fragmentering av gavlen var ganske annerledes. gavlen AChR pretzel i stor grad spredt, etterlater en konstellasjon av små (<4 m 2) AChR 'microaggregates '20,21. Disse to eksemplene aktualiserer behovet for å sammenligne størrelsesfordelingen for AChR klynger på gavlene av kontroll versus forsøksdyr 21.

Andre metoder er rapportert for vurdering synaptisk område eller flekker intensitet på NMJ. Motoriske endeplater kan noen ganger brettes slik at de to-dimensjonale z-projeksjon bilder som brukes her kan undervurdere synaptic områder. Tredimensjonale konfokale rekonstruksjoner kan gi mer treffsikre tiltak hvis absolutt synaptiske området må defineres 33. En viktig fordel med z-projeksjon protokollen beskrevet her, er imidlertid dens relative enkelhet, noe som har tillatt store antall endeplater som skal måles fra flere behandlingsgrupper og pålitelig identifikasjon av mulige forandringer. Protokollen for å sammenligne endeplate fargingsintensitet kan tilpasses for å studere forandringer i nivåene av mange forskjellige synaptiske proteiner. Metoden er begrenset, men ved det krav at alle prøvene er behandlet for immunfluorescens deretter avbildes i samme konfokal økt. En fersk studie av Yampolsky et al. 5 beskrev en metode for å måle gavl AChR tetthet som kan bidra til å overvinne denne begrensningen. I denne studien ble de samme områdene Gavlplatene avbildet på flere ulike laser strøminnstillinger. Helningen av forholdet mellom lasereffekt og rhodamine-BGT fluorescensintensitet ble brukt for å bedømme relative endringer i AChR tetthet på endeplatene i forskjellige 5 mus. Denne fremgangsmåte kan være nyttig for å sammenligne intensiteten AChR i prøver avbildes på forskjellige tidspunkter i løpet av et langvarig undersøkelse.

AChR-AChR FRET gir konkret og utfyllende informasjon om organiseringen av endeplate AChRs. Elektronmikros autoradiography bruker 125. I-α-BGT har vist AChRs å bli pakket tett med en plan tetthet på 10 4 m -2 umiddelbart under hver presynaptisk side av senderen utgivelsen, mens tilstøtende membran infoldings inneholde mye lavere tettheter av AChR 34. AChR-AChR FRET gjør det relativt enkelt å oppdage (sub-mikroskopiske) endringer i AChR pakking. En reduksjon i FRET effektivitet reflekterer en sub-mikroskopisk omfordeling av AChRs i den postsynaptiske membranen som ikke kan oppdages av en endring i gjennomsnittlig BGT fluorescens intensitet. Flere faktører kan forårsake en endring i effektiviteten av FRET. Disse omfatter donor-akseptor mellomrom og relative orienteringer, så vel som molekylært miljø 35,36. En reduksjon i gavl FRET effektivitet kan muligens skriver seg fra en endring i geometrien til AChR gitteret. Men mest sannsynlig ville det være på grunn av en reduksjon i andelen av AChRs som er pakket inn i nano-skala postsynaptiske molekylær gitter 14.

Tap av sammenhengen mellom motoriske nevroner og muskelfibre synes å være den umiddelbare årsak til muskelsvakhet i Motonevronsykdom og i stillesittende aldring 9,22,23. Felles metoder og parametere for måling NMJs skal gjøre det lettere for ulike forskningsmiljøer til å sammenligne og kontrast publisert funnene. Deling av detaljerte protokoller (og fremtidige forbedringer på dem) kan bidra til fortgang i arbeidet med å forstå mekanismene for NMJ vedlikehold og hvordan det kan bli påvirket i sykdomstilstander.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scanning confocal microscope Leica DM 2000 with  TCS SP2 system Most scanning confocal microscopes should be suitable. 
Zeiss LSM 510 Meta 
Leica SPE-II
Alexa555-a-bungarotoxin (red-BGT) Life technologies B35451 Used for labelling AChRs
Alexa647-α-bungarotoxin (far-red-BGT) Life technologies B35450 Far red fluorescence: barely visible through the eyepiece 
rabbit anti-synaptophysin Life technologies 18-0130 Different batches of primary antibody differ in effective working dilution
FITC-anti-rapsyn mab1234 Milipore FCMAB134F Monoclonal antibody conjugated to FITC
FITC-donkey anti-rabbit IgG Jackson 711-095-152 Polyclonal secondary antibodies can vary in quality according to source and batch
Optimal Cutting Temperature compound (O.T.C.) ProSciTech IA018 Cryostat embedding matrix for freezing  muscles
DABCO Sigma 10981 Mounting medium that slows photobleaching of fluorophores

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schmidt, N., et al. Neuregulin/ErbB regulate neuromuscular junction development by phosphorylation of α-dystrobrevin. J Cell Biol. 195, 1171-1184 (2011).
  2. Amenta, A. R., et al. Biglycan is an extracellular MuSK binding protein important for synapse stability. J Neurosci. 32, 2324-2334 (2012).
  3. Samuel, M. A., Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Agrin and Synaptic Laminin Are Required to Maintain Adult Neuromuscular Junctions. PLOS ONE. 7, e46663 (2012).
  4. Valdez, G., et al. Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise. Proc Natl Acad Sci (USA). 107, 14863-14868 (2010).
  5. Yampolsky, P., Pacifici, P. G., Witzemann, V. Differential muscle-driven synaptic remodeling in the neuromuscular junction after denervation). Eur J Neurosci. 31, 646-658 (2010).
  6. Li, Y., Lee, Y., Thompson, W. J. Changes in Aging Mouse Neuromuscular Junctions Are Explained by Degeneration and Regeneration of Muscle Fiber Segments at the Synapse. J Neurosci. 31, 14910-14919 (2011).
  7. Zhu, H., Bhattacharyya, B. J., Lin, H., Gomez, C. M. Skeletal muscle IP3R1 receptors amplify physiological and pathological synaptic calcium signals. J Neurosci. 31, 15269-15283 (2011).
  8. Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Fox, M. A., Sanes, J. R. Shared resistance to aging and ALS in neuromuscular junctions of specific muscles. PLoS ONE. 7, e34640 (2012).
  9. Perez-Garcia, M. J., Burden, S. J. Increasing MuSK Activity Delays Denervation and Improves Motor Function in ALS Mice. Cell reports. 2, 1-6 (2012).
  10. Klooster, R., et al. Muscle-specific kinase myasthenia gravis IgG4 autoantibodies cause severe neuromuscular junction dysfunction in mice. Brain. 135, 1081-1101 (2012).
  11. Pratt, S. J., Shah, S. B., Ward, C. W., Inacio, M. P., Stains, J. P., Lovering, R. M. Effects of in vivo injury on the neuromuscular junction in healthy and dystrophic muscles. J Physiol. 591, 559-570 (2013).
  12. Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490, 187-191 (2012).
  13. Gervásio, O. L., Phillips, W. D. Increased ratio of rapsyn to ACh receptor stabilizes postsynaptic receptors at the mouse neuromuscular synapse. J Physiol. 562, 673-685 (2005).
  14. Gervásio, O. L., Armson, P. F., Phillips, W. D. Developmental increase in the amount of rapsyn per acetylcholine receptor promotes postsynaptic receptor packing and stability. Dev Biol. 305, 262-275 (2007).
  15. Brockhausen, J., Cole, R. N., Gervásio, O. L., Ngo, S. T., Noakes, P. G., Phillips, W. D. Neural agrin increases postsynaptic ACh receptor packing by elevating rapsyn protein at the mouse neuromuscular synapse. Dev Neurobiol. 68, 1153-1169 (2008).
  16. Cole, R. N., Reddel, S. W., Gervásio, O. L., Phillips, W. D. Anti-MuSK patient antibodies disrupt the mouse neuromuscular junction. Ann Neurol. 63, 782-789 (2008).
  17. Morsch, M., Reddel, S. W., Ghazanfari, N., Toyka, K. V., Phillips, W. D. Muscle Specific Kinase autoantibodies cause synaptic failure through progressive wastage of postsynaptic acetylcholine receptors. Exp Neurol. 237, 237-286 (2012).
  18. Cole, R. N., Ghazanfari, N., Ngo, S. T., Gervasio, O. L., Reddel, S. W., Phillips, W. D. Patient autoantibodies deplete postsynaptic Muscle Specific Kinase leading to disassembly of the ACh receptor scaffold and myasthenia gravis in mice. J Physiol. 588, 3217-3229 (2010).
  19. Viegas, S., et al. Passive and active immunization models of MuSK-Ab positive myasthenia: Electrophysiological evidence for pre and postsynaptic defects. Exp Neurol. 234, 506-512 (2012).
  20. Morsch, M., Reddel, S. W., Ghazanfari, N., Toyka, K. V., Phillips, W. D. Pyridostigmine but not 3,4-diaminopyridine exacerbates ACh receptor loss and myasthenia induced in mice by Muscle Specific Kinase autoantibody. J Physiol. 591, 2747-2762 (2013).
  21. Ghazanfari, N., Morsch, M., Reddel, S. W., Liang, S. X., Phillips, W. D. Muscle Specific Kinase autoantibodies suppress the MuSK pathway and ACh receptor retention at the mouse neuromuscular junction. J Physiol. 592, 2881-2897 (2014).
  22. Cheng, A., Morsch, M., Murata, Y., Ghazanfari, N., Reddel, S. W., Phillips, W. D. Sequence of age-associated changes to the mouse neuromuscular junction and the protective effects of voluntary exercise. PLoS One. 8, e67970 (2013).
  23. Schaefer, A. M., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. A compensatory subpopulation of motor neurons in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. J Comp Neurol. 490, 209-219 (2005).
  24. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLos Biol. 8, e1000412 (2010).
  25. Shimizu, S. Routes of Administration. The Laboratory Mouse. Hedrich, H. J., Bullock, G. Elsevier. (2004).
  26. Chiasson, R. B. Laboratory anatomy of the white rat. Brown. Dubuque, Iowa. (1988).
  27. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
  28. Mitra, A. K., Stroud McCarthy, M. P., M, R. Three-dimensional structure of the nicotinic acetylcholine receptor and location of the major associated 43-kD cytoskeletal protein, determined at 22A by low dose electron microscopy and x-ray diffraction to 12.5A. J Cell Biol. 109, 755-774 (1989).
  29. Paas, Y., et al. Electron microscopic evidence for nucleation and growth of 3D acetylcholine receptor microcrystals in structured lipid-detergent matrices. Proc. Natl Acad. Sci. (USA). 100, 11309-11314 (2003).
  30. Samson, A. O., Scherf, T., Eisenstein, M., Chill, J. H., Anglister, J. The mechanism for acetylhcoline receptor inhibition by α-neurotoxins and species-specific resistance to α-bungarotoxin revealed by NMR). Neuron. 35, 319-332 (2002).
  31. Ghazanfari, N., et al. Muscle Specific Kinase: Organiser of synaptic membrane domains. Int J Biochem Cell Biol. 43, 295-298 (2011).
  32. Ghazanfari, N., Morsch, M., Tse, N., Reddel, S. W., Phillips, W. D. Effects of the β2-adrenoceptor agonist, albuterol, in a mouse model of anti-MuSK myasthenia gravis. PLoS ONE. 9, e87840 (2014).
  33. Prakash, Y. S., Miller, S. M., Huang, M., Sieck, G. C. Morphology of diaphragm neuromuscular junctions on different fibre types. J Neurocytol. 25, 88-100 (1996).
  34. Salpeter, M. M., Harris, R. Distribution and turnover rate of acetylcholine receptors throughout the junction folds at a vertebrate neuromuscular junction. J Cell Biol. 96, 1781-1785 (1983).
  35. Soper, S. A., Nutter, H. L., Keller, R. A., Davis, L. M., Shera, E. B. The photophysical constants of several fluorescent dyes pertaining to ultrasensitive fluorescence spectroscopy. Photochem Photobiol. 57, 972-977 (1993).
  36. Panchuk-Voloshina, N., et al. Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates. J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).
Nevromuskulære krysset: Måling Synapse Størrelse, fragmentering og endringer i Synaptic Protein Tetthet Bruke Confocal Fluorescensmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tse, N., Morsch, M., Ghazanfari, N., Cole, L., Visvanathan, A., Leamey, C., Phillips, W. D. The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (94), e52220, doi:10.3791/52220 (2014).More

Tse, N., Morsch, M., Ghazanfari, N., Cole, L., Visvanathan, A., Leamey, C., Phillips, W. D. The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (94), e52220, doi:10.3791/52220 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter