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Neuroscience

神経筋接合部:測定シナプスサイズ、断片化および共焦点蛍光顕微鏡を用いてシナプスタンパク質の密度の変化

doi: 10.3791/52220 Published: December 26, 2014

Abstract

神経筋接合部(NMJ)は、哺乳動物、運動ニューロンは、自発的な筋収縮を制御を通じて大、コリン作動性シナプスのリレーです。 NMJでの構造変化は、弱さ、萎縮と筋線維の死で、その結果、神経伝達障害が発生することができます。多くの研究は、遺伝子改変または疾患マウスNMJの構造を変化させることができる方法を検討した。残念ながら、それは直接、彼らはしばしば、異なるパラメータおよび分析方法を採用しているため、これらの研究からの知見を比較することは困難であることができる。 3つのプロトコルは、ここで説明されている。最初は、アセチルコリン受容体(AChRの)の面積を測定するために最大値投影共焦点画像を使用して終板とその上のシナプス前神経終末におけるシナプス小胞の染色の領域におけるリッチシナプス後膜ドメイン。第二のプロトコルは、シナプス後膜におけるシナプス蛋白質の免疫染色の相対強度を比較します。第三のPRotocolはエンドプレートでのシナプス後性AChRのパッキングの変化を検出するために蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を使用します。プロトコルが開発され、一連の研究の上に洗練されてきた。品質と結果の一貫性に影響を与える要因を議論すると基準データは健康な若い成体マウスのNMJで提供される。

Introduction

神経筋接合部(NMJ)は、神経系および骨格筋との間の通信を仲介する重要な中継シナプスである。これは、すべての自発的な運動のために必要とされる。蛍光顕微鏡は、長いNMJ 1-3マウスの導入遺伝子の影響を研究するために、またはげっ歯類のNMJ 4-11時の年齢、食事、運動、および疾患の影響を比較するために使用されてきた。このような研究は私たちにNMJの生理学および病態生理学について多くを教えてきましたが、( 例えば、AChRのエリア、終板面積、周囲長、断片化指数)が報告多様なパラメータは、しばしば、それが難しいこれらの研究の調査結果を比較することにする。前臨床研究者が特に疾患12の齧歯類モデルを用いた研究では、再現性を発揮できるようにするための増加期待があります。ここで説明するプロトコルは、発達生理学的および病態生理学的CHを調査の一連の研究を通して洗練されたNMJにアンジェス。このような研究は、マウスの運動終板と後シナプスの専門分野13-15内のシナプスタンパク質のパッキングの相対密度でシナプスの専門分野の面積の測定を必要とする。

これらの方法の有用性は、重症筋無力症、抗MuSKのマウスモデルにおける最近の研究によって示されている。抗MuSKの陽性重症筋からのIgGの毎日の注射は成体マウスに、患者は彼らが2週間以内に16弱になった原因無力。 (神経端末で)シナプトフィジンのための二重標識された筋肉切片の共焦点最大投影画像とシナプス後性AChRは、一次変化としてのAChR染色の分野で進行性の低下を明らかにした。重要なことには減少率は、同等のシナプス電位の振幅の減少、シナプス伝達の障害及び筋衰弱17,18を説明するのに十分であった。定性的に類似の所見は他の研究グループにより報告された10,19。同じNMJ測定方法ので、このマウスモデル20,21に無力抗MuSKの重症筋を治療するための3種の薬物の影響を評価するために使用されている。

座りがちな高齢化は、神経筋の​​接続の損失につながることができます。マウスは古い時代に進行としてここに記載されているプロトコルは、モータのエンドプレートでの神経終末シナプトフィジンのエリアの加齢に伴う減少を明らかにした。同じ方法は、自発的な運動は、主に他のグループ4による以前の研究と一致して、シナプス前神経末端領域22の低下を防ぐことができることを明らかにした。神経接続の損失はまた、筋萎縮性側索硬化症9,23のSOD1G93Aマウスモデルにおいて発生する。

上記の研究では、健康状態の様々なNMJでの前または後シナプスの専門分野のいずれかの面積の削減につながる可能性があることを示している。これは損なわれ、シナプス楽しいことがありctionまたは神経筋の接続の完全な喪失を告げることがあります。 3つのプロトコルは、シナプスの専門分野の面積と密度の定量化を可能にすることが記載されている。第一のプロトコルの目的は、蛍光顕微鏡を用いて、シナプス前および後の専門および哺乳類のNMJでのその配列の領域の実用的かつ再現可能な測定を提供することにある。二次元の最大投影共焦点画像およびNIH ImageJを用いて画像解析をシナプトフィジン染色(シナプス小胞)、シナプス後性AChRおよびシナプス重なり領域の面積の変化を検出するために使用される。シナプスの専門分野を識別するために使用される視覚情報が最大となるように共焦点撮像パラメータ(ゲイン、オフセット·レベル)は、各NMJのために最適化される。神経筋障害はまた、シナプス後のAChRおよび/または他のシナプスタンパク質の密度の変化に起因することができます。第二のプロトコルは、シナプス後のタンパク質の相対密度の変化を検出するために適用することができるムスク、rapsyn、ジストログリカン、リン酸化されたSrcキナーゼおよびリン酸化のAChR 18,21-として。

重症筋無力症では、シナプス後膜内のAChRの減少密度は、シナプス障害や筋力低下の直接の原因である。第三のプロトコルは、シナプス後膜14,15内の隣接性AChRの近接性の変化を評価するための蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)法が記載されている。この方法は、蛍光αブンガロトキシン(BGT)で標識された隣接性AChRの間のエネルギー移動を検出する。 FRETは、蛍光ドナーとアクセプタープローブが離れて10nm未満である場合にのみ発生します。これは、直接シナプス電位の振幅に関連することができるのAChRパッキングの気密性で(超顕微鏡)の変化を明らかにすることができます。

過去10年間で洗練されたこれらの3つのプロトコルは、一貫して再現可能な方法で、NMJ整合性の補完的な対策を提供する。標準化されたプロトコルを使用してA番目のパラメータは、哺乳類のNMJの際の遺伝子と環境介入の効果の比較を容易にするはずである。

Protocol

注:動物実験の設計、行為および報告は、現在のガイドライン24を考慮すべきである。このような作業は地元の動物福祉局(シドニー大学の我々の場合動物倫理委員会)によって事前に承認されなければならない。

動物と筋解離の1安楽死

  1. それは清水25による詳細なマウス操作法を用いて、ペントバルビトン溶液(30 mg / kgを)の腹腔内注射で安楽死された別の部屋に保持部屋からマウスを転送します。そのケージに戻ってマウスを置きます。
  2. マウスの呼吸以上1分間停止したら、軽く角膜をブラッシングにより穏やかに足をつまんで足-引っ込め反射、および角膜反射をテストします。反射反応が存在しないときだけマウスを解剖するために調製することができる。
  3. そのようなChiasson 26などのげっ歯類解剖学のアトラスに相談する、および/ ​​またはの体験の助けを求める興味のある筋肉の解剖を試みる前にCED解剖学者。それぞれのケースで筋肉を露出するために皮膚を開く前に、小型電気シェーバーを使用して覆う皮膚から毛を取り除く。
    注:解剖は、各解剖学的に、個別の筋肉のために異なります。
  4. 鈍鉗子を使用すると、膜の上に位置し、周辺組織からの筋肉を解放する。つかみ、その挿入から筋肉を分離するための遠位腱を切った。
  5. ゆっくりと右バックその原点に周囲の組織から自由な筋肉をいじめるとスニップ。簡単に言えば、さらに処理する前に、0.1Mリン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液またはリンゲル液中に新たに解剖筋肉を置く。

2.凍結切片化のための筋肉の準備

注:オプションのステップ2.1で説明したように最適な構造的な保存が(小さ ​​な筋肉のために)全体以前に詳細な27のような動物の灌流、または浸漬固定することによって達成することができる。しかし、4%パラホルムアルデヒド固定は、多くの抗体プローブを用いて、蛍光-BGTとその後の染色を損なうことができます。グルタルアルデヒドは特に避けるべきである。筋肉が、彼らはすぐにスナップ凍結されなければならない固定されていない場合には(2.3​​に進む)。

  1. オプションの浸漬固定:ピン静止長でペトリ皿中のワックスの筋肉。 RTで2時間(新たにPBSに溶解)のVパラホルムアルデヒド/ wの2%の筋肉をカバーしています。その後、PBS中の30%W / Vのスクロースを含むPBSを交換し、4℃でO / Nインキュベート30分(3×10分)以上のPBSを3回交換でそれを洗ってください。
  2. 図1に示すように、アルミ箔2cmの×1.5センチメートルの部分を折り曲げることにより、予め金型(「ボート」)を作る。ボートの底にニトロセルロース膜片を置き。穏やかに気泡を避けるように注意しながら、2mmの深さまでボートにクライオスタット埋め込 ​​みマトリックス( 材料テーブル )を注ぐ。上のボールペンラインでそれを合わせて、ボートに筋肉を置きニトロセルロース。完全に筋( 図1)を覆うように、より埋め込 ​​みマトリックスを追加する。
  3. 消えないマーカーを用いたプレラベルポリプロピレンチューブ。各管中の水滴を置き、液体窒素中でチューブを冷却。
    注:凍結水滴は、蒸気圧を維持し、長期の-80℃の貯蔵中に乾燥を防ぎ
  4. フェイスシールド、厚い保護手袋と鈍い鉗子の大ペアを使用して、部分的に30秒間液体窒素の容器にイソペンタンの2cmの深さを含む小さな金属ビーカー(8センチメートル深い直径3cmを、)を下げる。ビーカーを取り外し、作業台の上に置きます。鈍鉗子の小さいペアを使用すると、金型の筋肉を含有し、冷やしたイソペンタンに行列を埋め込むを置く。イソペンタンとの混合液体窒素を避けるように注意してください。
  5. ブロックの2分が出て凍結されたブロックを持ち上げて鈍鉗子を使用する前に、完全にフリーズして、正しいPRにそれをシールすることを許可する電子ラベルとあらかじめ冷却チューブ(ステップ2.3)。
  6. C -80℃に移す前に液体窒素中で一時的に管を保管してください。冷凍庫内容のスプレッドシートにすべてのサンプルをログに記録します。

3.凍結切片化し、蛍光染色のNMJのエン顔画像のために

  1. アルミニウム金型をはがす。 20μmの凍結切片は、筋線維の長軸( 図1)に平行に切断するように-20℃の低温保持チャンバ内クライオスタットチャックに凍結されたブロックを添付。ポリ-L-リジンまたはゼラチンコーティングされた顕微鏡スライド上のセクションをピックアップ。
  2. 注:組織は凍結前に固定されている場合は、この手順を省略します。の項では、スライド上に乾燥するために30分をさせた後、室温で15分間、各セクションの上にPBS中の2%パラホルムアルデヒドの低下を置くことによって、それらを修正。
  3. 洗浄は、コプリンジャーPBSで3×10分スライドし、次に、残留アルデヒド基をブロックするために30分間、0.1Mグリシンを含むPBS中でスライドを浸す。
  4. 洗浄はPBS中で10分間にスライドし、7分間(-20ºCに冷却)をメタノール中に浸す。この透過処理ステップは、蛍光-BGTと抗シナプトフィジンとの二重標識のルーチンの一部ですが、それは悪影響をいくつかの他のタンパク質の免疫染色に影響する場合があります。
  5. ウォッシュをPBS中で2×10分をスライドその後安定した平ら加湿チャンバー内で各スライドを配置。すぐに室温で1時間ブロッキング溶液を20μl(0.2%トリトンX-100、PBS中の2%ウシ血清アルブミン(BSA))を用いて、各セクションをカバーする。切片は、免疫染色プロセスの任意の段階で乾燥させてはいけません。
  6. 主なインキュベーションを行ってください:一度に一つのスライドを取ることに慎重各セクションの上から余分なブロッキング溶液を除去し、ウサギ抗シナプトフィジン20μlのと交換してください(:200をブロッキング溶液中で1希釈)。
  7. 唯一のブロッキング溶液とインキュベートされるネガティブコントロールスライドを含めます。この「無一次抗体コントロール「すべての免疫染色ランで不可欠です。
  8. 一次抗体は、各セクション上の所定の位置に残っていることに注意しながら、加湿チャンバーを閉じて、4ºCで1〜2日間インキュベートする。
  9. 一次抗体が所定の位置に残っていることを確認するために、各セクションを点検。優しくPBSで各スライドをすすぎ、コプリンジャーに入れてパスツールピペットを使用してください。すべてのスライドをPBS中で3×10分を洗う。
  10. 二次インキュベーションを行ってください。一度に一つのスライドを撮影、慎重に、過剰のPBSを削除加湿チャンバー内に置き、FITC結合ロバ抗ウサギIgGとBGTローダミンテトラメチルに結合または別の赤の蛍光体を含有する混合物20μlを各セクション(TRITC-をカバー/ redBGT; 5グラム/ ml)をブロッキング溶液中に希釈した。室温で2時間インキュベートする。
  11. ウォッシュは、コプリンジャーにPBS中で3×10分をスライド。
  12. 一度に一つのスライドを撮影、慎重に過剰のPBSを除去して、グリセロの最小限のボリュームを使用してカバーガラスでマウントLベース、フェード耐封入。明確なマニキュアでカバースリップの端をシール。それはハード乾燥することができます。
  13. より長い保存期間(数ヶ月まで)のために1週間まで、または-20ºCための4ºCで暗所でスライドを保管してください。

4.公平サンプリングとモーターエンドプレートのエンフェイスイメージング

  1. のみ(分析に関与していない)は、第2の研究者に知られたままランダムコード番号で各スライドを標識することによりスライドをブラインド。 NMJのパラメータの定量はすべてのサンプルについて完了するまでは、操作者は、処置群に対して盲検化残る。
  2. 顕微鏡ステージ上にスライドを置き、TRITCフィルターセット(63X油1.3のNA対物レンズ)と広い視野照明の下でそれを表示します。右へと戻ってエンドプレートは、フィールド( 図2A)に表示されるまで左(フィールドごとに)徐々に移動します。
    注:サンプリング基準:比較的あるすべてのAChR染色した構造フラットと対物レンズ( すなわち、<z次元における15メートルを拡張)に臨むが、終板とみなされ、(AChRの染色の三日月形の終板を介して断面積を表し、したがって、除外されている)分析のために結像される。
  3. 1.0エアリーユニットと低レーザパワーに焦点ピンホール設定するとゲインを最適化し、画像化されるべきであるエンドプレートでTRITC /赤-BGT(532nmレーザー)のためのレベルを相殺した。次に488nmのレーザーを用いてFITC /シナプトフィジン蛍光を最適化する。各光学スライスの間に0.7μmの間隔で終板のzスタックを収集します。撮像セッションの日付、スライドのコード名とエンドプレートの番号を含むファイル名で画像を保存します。
    注:488 nmのを使用してスキャンし、532nmのレーザ(FITCおよびTRITC)は(ブリードスルー)赤蛍光団およびその逆からの蛍光によってFITCチャンネルの汚染を避けるために(しない同時に)を順次収集する必要があります。
  4. サンプリングAを繰り返しますNDステップのイメージング4.2から4.3まで、20のエンドプレートは、スライド/サンプルから収集されます。
  5. 次のコード化されたスライドに変更し、4.2から4.4を繰り返します。コー​​ド化されたスライドのそれぞれについて、これを繰り返します。
  6. 実験的なスライド(FITC蛍光チャンネルは暗く表示されます)のための最適な発見された共焦点設定を使用して制御スライド(無一次抗体コントロール)からのエンドプレートのいくつかの画像を収集します。
  7. 別のコンピュータへの共焦点セッション転送画像ファイルの最後に、外部ドライブ、またはサーバー上の元のファイルをバックアップする。

5.エン顔画像におけるシナプスのSpecializationの面積を測定する

  1. 各zスタックから最大投影(MIP)画像を用意するために、NIH ImageJのフリーウェア(http://imagej.nih.gov/ij/)を使用します。 TIFFファイル( 図2A&B)として保存する。ファイル名は、画像セッションの日付、サンプル·コード、エンドプレート番号と蛍光チャネル( 例えば、060414_57を含むべきである23_7_FITC.tiff)。
  2. ImageJの中のz投影画像を開きます。アセチルコリン受容体画像チャンネル( 図3A)を選択し、[選択]: 画像を>画面上の3つの8ビットグレースケール画像に24ビットRGBカラー画像に変換するために> 8ビットを入力します
  3. 特定の個人のエンドプレートのすべての見かけの染色領域を含むようにImageJのポリゴンツールは関心のエンドプレート(由来しない任意の染色を除く一方で、redBGT染色(ACHR)チャンネルに興味のあるエンドプレートの周りにラフアウトラインを描く使い方図3C)。
  4. 選択することで、画像の最小強度閾値を適用します。 画像>調整>しきい値図3Eおよび関連ImageJのスクリーンショット)。
  5. サブスレッショルド( 図3E)のような周囲のバックグラウンド信号を除外したAChR染色された部分を分離するようにしきい値レベルを調整します。第二の風を開く閾値についての決定を容易にするために、比較のために、ウィンドウの横にすぐに元の(連続階調)の画像とOW。共局在化に後で使用するための閾値を解析し、記録する。
  6. エンドプレートの周りにポリゴンのアウトラインを保持することを選択: 分析>パーティクルを分析します 。 (これは光電子増倍管で電気的ノイズに起因する小さなアーティファクトを排除)無限ピクセルに50:ポップアップメニューのようにサイズの範囲を指定します。
  7. 分析粒子のコマンドは、個別の閾値上の領域のリストを持つウィンドウを作成し、彼らは二値画像( 図3Gおよび関連ImageJのスクリーンショット)に表示されるようにそれらの蛍光強度値は番号。ラベルスプレッドシートにこのデータをコピーします。
  8. >メジャーを分析 :選択して、総エンドプレート面積(ポリゴン内の面積)を測定します。これは全体の終板面積が得られます。 AChRのエリアや強度にするためのコピー&ペーストしたデータ適切に、列にラベルを付けて確認してスプレッドシートには、行は特定のスライドのための個々のエンドプレートに使用されます。
  9. 抗シナプトフィジン蛍光チャネルに切り替え、繰り返し5.1手順- 5.5が、FITCチャネル( 図3B、DおよびF)のために。目的は、目によって知覚される、可能な限り厳密に、染色の境界に一致する二値画像を作成するように閾値を調整することである。しきい値を記録します。
  10. 画像スタック>画像>スタックの次の手順を適用することにより、重なりの面積を測定します。2チャンネル画像を含むオリジナルのファイルを開き、選択することによって、2つの別々の画像に分割。
  11. 共局在のプラグインを使用して、(ImageJのWebページからダウンロードしてインストール)を選択します:Pluggin>共局在し、入力を以前のAChRのために記録のしきい値と神経チャネルはそれぞれのチャネルクエリーbにOX。これは白画素( 図3Hおよび関連ImageJのスクリーンショット)でのオーバーラップ画像が得られます。
  12. 新しく作成されたオーバーラップ画像は、グレースケール形式に変換し、最大値にしきい値を適用する。最大閾値は、前の2つのチャネルの重複領域に対応し、白画素を選択する。スプレッドシートのレコードをピクセル単位での重なり部分の面積を表して「共局在化」の結果の面積値、。
  13. データサンプル手段のスプレッドシートを準備し、ヒストグラムや散布図20,22のような標準偏差と標準誤差を計算し、プロットします。 nの値は、一般的に、統計目的のためのサンプル群あたりのマウスの数を表している。
  14. 散布図または頻度ヒストグラムとしてプロット終板のAChR領域は、データが正常に統計的検定( 図6)の前に分散されているかどうかを判断する。

6.相対染色強度は、横光学切片を用いて比較

注:このプロトコル処理のためのすべての筋肉のサンプルを一緒と画像シングル共焦点セッションで。実験の計画では、筋肉のサンプルあたり30分の撮影時間まで許可する。

  1. 筋線維の長軸に対して横方向に15μmの凍結切片をカットし、ステップ3.1で説明したようにスライド上に集める。
  2. ステップ3.2から3.13に記載されているように蛍光染色を行ってください。
  3. コー​​ドステップ4.1で説明したように、そのイメージングおよび分析ので染色したスライドを、治療群にオペレータブラインドで行われている。
  4. 簡単に各スライドからセクションを調査40X蛍光対物レンズ(NA 0.75)を使用すると、単一の利得を決定し、すべての試料スライド上のすべてのエンドプレートに適してAChRのためのレベル設定を相殺する。明るいエンドプレートは、ちょうどスケールで256階調以下でなければならない。この最適化は、第二fluorescencで別々に行われるべきである電子チャネル(逐次収集)。固定ゲインを記録し、レベルの設定をオフセットし、撮像セッションを通して、それらを変更しない。
  5. レーザー強度の任意の可能な変動を検出するために、共焦点セッションの開始時と終了時に、同じパラメータを使用して、蛍光標準スライド( 例えば、非漂白蛍光ビーズ)の画像を収集する。
  6. エンドプレートを見つけるために徐々にスライドをスキャンするのAChRチャネルを使用してください。
  7. AChRの染色されたエンドプレートのほとんどの数を含む各顕微鏡の視野内の単一の光切断面を見つけるにフォーカス。
  8. この単一の光学部は二回スキャンし、平均した画像( 図4G)を保存。
  9. 第2の蛍光チャネルに対して同じ焦点面スイッチ(関心対象のタンパク質)を維持し、ステップ6.8において、画像を収集する。撮像セッションの日付、サンプル·コード、画像番号と蛍光チャネルを示す記号:ファイル名を含め、画像ファイルを保存します。 Fは rapsyn、ムスクやα-ジストログリカン(-dg)と比較したのAChRの終板分布の例を示している。
  10. 1つ以上のエンドプレートを含む次のフィールドに、ステージを移動し、ステップ6.8から6.9を繰り返します。 60のエンドプレートの合計が画像化されるまで、これを繰り返します。
  11. イメージングセッション転送の終了時に、すべてのファイルを別のコンピュータに、それらをバックアップします。
  12. 各元の画像ファイルを開き、AChRのチャンネルを見ながら、選択します。 画像>スタック>スタックイメージに 、チャンネルを分割する。
  13. 選択してください: 画像>タイプ> 8ビットが画面に8ビットグレースケール形式に変換する。両方の蛍光チャネルのためにこれを行います。
  14. 選択してください: 画像>スタック>イメージをスタックに 。 2以前に分離8ビット画像から新しいスタックを開きます。一つは、単一のウィンドウ内の2つの蛍光チャネルの間で便利に切り替えることができます。
  15. LINを描画するポリゴンツールを使用して、EしっかりAChRの染色( 図4I)の境界付近。
  16. 選択:囲まれた領域内のAChRの平均ピクセル強度を測定するために測定>分析 (しっかりと線を描画することの重要性を注意してください)。ラベルスプレッドシートには、この値をコピーします。
  17. 分析>対策 :同じポリゴンのアウトラインを(測定すべき領域を定義するために)、第二の蛍光チャネル( 例えば、 図4B、D、F)に切り替えて、選択し保持。これは、AChRの染色によって定義シナプス領域内の関心のあるタンパク質の平均染色強度が得られる。
  18. 選択し離れて見えるの端板染色から地域を選択: 分析>平均バックグラウンドの蛍光強度を測定するために測定します 。他の蛍光チャネル/ sのためにこれを繰り返し、蛍光値のスプレッドシートにバックグラウンド値をコピーします。
  19. サブ性AChRに対する補正強度と各エンドプレートでの目的のタンパク質を得るために、エンドプレート値から平均バックグラウンド値をトラクト。
  20. 蛍光強度比14,21を生成するために修正さBGT蛍光強度により、目的のタンパク質に対する補正終板の強度値を分割

7. FRETを使用して、シナプス後膜のAChR密度を比較すると、

注:このプロトコルは、シナプス後膜に性AChRが密接にパックされている程度(<10nmの間隔)を評価する。正確なドナーおよびアクセプターフルオロフォアの組み合わせは、このFRETアッセイのために重要である。名前およびフルオロフォアの詳細は材料の表に示す。彼らのスペクトル特性は、FRETに関連して、私たちの前の論文14,15で説明します。

  1. 6.1節で説明したように固定された横方向の凍結切片を準備します。すべてのサンプルグループは一緒にして画像処理しなければならない同じ共焦点セッションでD。
  2. 徹底的に10グラムと2.5グラム/ mlの赤-BGT(FRETドナー)をミックス/ mlの遠赤色-BGT(アクセプターをFRET)を12回ピペッティングにより小さなプラスチックチューブ内の溶液をブロッキング。この1:4のモル混合物は、FRET 14の効率を最大化します。
  3. 加湿チャンバー内の各スライドを置き、慎重に上記の混合物の滴(12μL)との各セクションをカバーし、室温で1.5時間インキュベートする。
  4. コントロールセクション:(のみドナーラベル付きC1コントロール)2.5グラム/ mlの赤-BGTとセクションの小さな数字をカバーし、10グラム/ mlの遠赤-BGTともいくつかのセクション(;ラベルC2のコントロールのみアクセプター)。ステップ7.3でのように、これらのコントロールをインキュベートする。
  5. ウォッシュは、PBS中で3×10分をスライドして(ステップ3.12参照)グリセロールベース、フェードに抵抗を封入剤でマウントします。
  6. ステップ6.7のように、エンドプレートのサンプリングを行います。ドナーとアクセプターからの蛍光は完全に蛍光BGT分子のランダム結合のためにエンドプレートで共局在するべきである。
  7. 制御画像:対物レンズ40倍と低レーザパワー最適化redBGTゲインを使用し、コントロールスライドC1からエンドプレートのためのレベル設定をオフセット。遠redBGTゲインを最適化し、制御スライドC2からエンドプレートのためのレベルを相殺した。すべての蛍光ブリードスルーがないことを確認してください。
  8. レーザパワーを変化させずに、ゲインやオフセット·レベルの設定は、実験のスライドに移動し、両方の蛍光チャネル用の画像(プリ光退色)を収集する。
  9. 選択的に遠赤-BGTは、100%のパワーで633nmのレーザーで10回スキャンし、スキャン領域にズームことにより、単一の端板の部分の上に光退色。スキャンされたエリア内の蛍光は薄暗いなるはずである。
  10. レーザーパワーをリセットし、ズームや7.7で確立された共焦点の設定を使用して、両方の蛍光チャネルでポスト漂白画像を収集。
  11. アクセプターの光退色(遠赤-B以下のドナーの増加率(赤-BGT)蛍光からFRET効率(E)を計算次の式*によるGT):
    式1
    *ドナーの蛍光がアクセプターを光退色後に増加させ、すべての状況では。

Representative Results

NMJでのシナプス面積の測定

エリアの任意の推定値は、シナプスの専門分野の範囲を定義するために、境界の描画に依存している。健康な若い成人の筋肉のNMJの画像がのAChRとシナプトフィジン染色( 図2AおよびB)の両方のために明確に定義された境界線を表示する必要があります。 AChRの及びシナプトフィジンの両方の蛍光強度は、運動終板( 図5A '及びB')のペリシナプスシナプス部分との境界で急激に上昇する。そのようなイメージの場合(単にシナプスバックグラウンド蛍光以上)最小しきい値は、容易にエンドプレート(( 図5(a) 'B')の水平の破線)のAChRの豊富なまたはシナプトフィジンが豊富なエリアを隔離します。老化マウスでは、いくつかの疾患状態でのAChRのための終板染色はあまり強くすることができる、のAChRクラスターエッジがぼやけて表示されてもよい再高いシナプス外自家蛍光のレベル(; 17,22 図5D)であってもよい。不明瞭な境界を有する蛍光染色は、シナプス領域の推定値に誤差を導入することができる。すべての状況において目的は、元の、連続階調画像に目に見えるようにAChR-またはシナプトフィジンに富む領域への形状及び大きさが類似し、二値画像が得られる閾値を選択することである。治療群に分析ブラインドを実施する閾値ステップ(ステップ4.1)における主観的バイアスのリスクを減少させるはずである。時々かすかなまたはぼやけたエンドプレート画像は、次善の処理から生じ得る。 図2C及びDは、健康な2ヶ月齢マウスからの低品質の終板の画像の例を示す。かすみエッジとかすかなシナプトフィジン染色は、凍結切片の前に筋肉を部分的に融解と再凍結からこのインスタンスで発生している可能性があります。若い健康(ポジティブコントロール)筋肉のいくつかのセクションが区分されるべきであるndはNMJ画像において明らか減損は、免疫染色の問題によるものではないことを保証するために実験サンプルと並行して処理される。次善の処理によって損なわれた画像のバッチは、分析から除外されるべきである。

顔のzスタック画像ENの場合は、15〜20のエンドプレートは、シナプスの領域を推定するための合理的なサンプルサイズです。のNMJの形や大きさで幅の広い多様性は、任意の筋肉内で発見されている。散布図は、個々のマウス( 図6A)前脛骨筋の終板の中のAChRが豊富な地域でかなりの範囲を明らかにする。それにもかかわらず、(顔の端板画像EN 15-20に基づく)平均のAChR面積は7サンプルマウス(; 図6A〜200メートル2)の間で類似していた。終板シナプトフィジン染色の面積も与えられた筋肉からのエンドプレート間でかなり変動した。再び、15-20のサンプルサイズを使用してエンドプレートシナプトフィジンの平均面積はシミたエンドプレート7匹のマウスの中でLARを検討(〜170メートル2; 図6B)。プールされたデータの周波数ヒストグラムは終板のAChRとシナプトフィジン( 図6A 'B')のエリアのおおよそ正規分布を明らかにした。しかし、シナプス領域の正規分布は、重症筋無力16,20などの疾患状態に仮定することはできない。これは、統計的検定の選択に影響を与えることができる。

表Iは、これまでの研究から、健康(ヤングアダルト)2ヶ月の雌のC57BL / 6JマウスのためのNMJのためのシナプス前および後の専門分野の領域を示しています。シナプス前および後の専門分野の両方の領域が定住高齢化22に減少しました。のAChR領域も著しく抗ムスク重症筋無力患者17,21を無力からのIgGを注射したマウスに減少した。コリンエステラーゼ阻害薬、ピリドスチグミンで処置した筋無力症のマウスは、<エンドプレートのAChR領域20においてさらに有意な減少を示した/ SUP>。

エンドプレート蛍光標識の相対強度

免疫蛍光標識の相対強度は、シナプスタンパク質の興味、年齢、遺伝子型および/または疾患状態の密度の​​変化を明らかにすることができる。 AChRの蛍光(赤BGTまたは遠赤BGT)は、第NMJの位置を定義するために使用される。 8ビットのAChRに富む領域内の蛍光の明るさは、その後、動物を対照と比較目的のタンパク質の濃度の変化を評価するために使用される。横断面では( 図4A、C、E、H)終板性AChRは、一般的に三日月形として表示されますが、この形状は、多くの場合、不規則である。低強度のバックグラウンド蛍光は、通常のAChR染色のパッチが単一のエンドプレートを表し、または隣接する筋線維に位置する2つの別々のエンドプレートかどうかを明らかにする。 (そのようなrapsyn、ムスクおよびSrcなど)多くのシナプスタンパク質であるエンドプレート( - D図4A)でのAChRと共局在。ホスホ特異的抗体を用いた免疫蛍光染色は、特定のシナプス後膜タンパク質21のリン酸化状態についての実験的介入の効果を比較するために使用することができる。

蛍光強度測定の信頼性と再現性が凍結し、筋肉の完全性および免疫染色の品質に大きく依存します。筋肉を切開し、すぐにスナップ凍結又はパラホルムアルデヒド固定(動物の死の数分以内)にNMJに退行性変化を避けるようにする必要があります。免疫染色は、試薬の品質に非常に依存し、特定の抗体のための染色プロトコルを最適化。実験を免疫染色一次抗体パイロットの新たなバッチのために必要とされる。健康な若い筋肉の新たに切断した凍結切片を一次抗体の連続2倍希釈液と共にインキュベートする。 A既知の信頼できる二次抗体が使用され、結果が比較される。目的のタンパク質がNMJに制限されることが知られている場合、最高の抗体濃度は、筋肉(バックグラウンド蛍光)のシナプスの部分に見られるものと比較しNMJの蛍光強度の最も高い割合を生じるものである。シナプス(おそらく非特異的)蛍光強度は、通常、エンドプレート蛍光強度の15%を超えてはならない。同様に、(二次抗体のみとインキュベート) 'は一次抗体コントロール」セクションでは、二次抗体が非特異的に結合しなかったことが確認され、暗く見えるべきではない。 (ポリクローナル)の異なるバッチの品質は、二次抗体は、そのように、代替二次抗体バッチは、標準的なプロトコールを確立する前に比較されるべきで著しく変化することができる。免疫蛍光の特異性のための理想的な試験は、マウスtから、野生型マウスおよび陰性対照切片から切片を直接比較することを含む帽子は、タンパク質の関心(遺伝子ノックアウト)を欠いている。以下の参考文献はムスク、rapsyn、ジストログリカン、srcとのAChR 13,14,18,21のためのエンドプレートの蛍光染色の定量を説明する。

小さなサンプルサイズは、相対的な蛍光強度の推定値に誤差を導入する。個々のエンドプレートは、蛍光強度にかなり変化。おそらく与えられた筋肉内のエンドプレート間のこの変動は、サンプリングされた光学部におけるNMJ構造と偶然の違いの多様性を反映している。しかし、平均蛍光強度( 図7)のより安定した推定値で結果をサンプリングした終板の数を増加させる。平均終板蛍光強度を推定するために各筋肉サンプルから40〜60のエンドプレートを平均する必要があります。

のAChR-AChRのFRET

各のAChR(各アルファサブユニットに1つずつあります)BGTのための2つの結合部位を有する五量体である。の結合これら二つのサイトへの赤BGTと遠赤-BGTは約9nm 28-30のドナー·アクセプターの分離をもたらすであろう。したがって、低効率のFRETは、性AChRクラスタ14に集合する前であっても検出することができる。しかし、マウスのエンドプレートでのFRETの効率はおおよそ密に詰まったシナプス後膜の格子14への性AChRをより効率的に組み込むことと一致して、出生後に倍増した。 FRETドナーおよびアクセプター(それぞれ)として赤BGT遠赤BGTを使用して、1-2月齢マウスの終板は、20〜37%( 表2)の範囲の平均FRET効率を生じた。 20%以上のFRET効率が14性AChRのタイトなパッキングを表すと考えられている。終板FRET効率はわずかに除神経14以下の減少、及びマウス抗MuSKの陽性重症筋無力症の患者18からのIgGを注射した後に顕著に減少した。これらは、個々性AChRはあまりきつくpostsyにパックされている条件であるシナプス後MuSKの/ rapsynシステム31によるnaptic膜骨格。

図1
図1の埋め込 ​​みおよび凍結切片のために凍結筋 (1-5)金型を準備する(「ボート」)は、筋肉のバッチを凍結する前に:(1)アルミニウム箔を長方形(2.0×3.0センチメートル)とに切断される(2)。 (3)金型/ボートを作成するために起訴としてつ折り。 (4)ニトロセルロースイムノブロッティング紙の矩形は、金型に合わせてカットされ、ボールペンは、筋肉を配向するための行を除外するために使用される。 (5)ニトロ矩形金型内に配置される。 (6-8)埋め込みおよび筋肉凍結:(6)クリオ埋め込みマトリックス液を穏やかに2mmの深さ(ニトロセルロースの上に)金型に注入される。 (7)ファイン鉗子nitrocelluと整列して、埋め込みマトリックスへの腱によって、筋肉を低下させるために使用されている判決を失い、(8)その他の埋め込みマトリックス穏やかに泡立てないように注意しながら、筋肉を覆うように鋳型に注ぐ。埋め込まれた筋肉は、その後のチューブに密封し、テキストで説明したように-80℃で保存し、スナップ凍結されている。凍結切片のための(9-12)の調製:(9)ファイン鉗子アルミニウム金型を剥がすために使用され、凍結ブロックをその後-20℃でクライオスタットチャンバ(10)内に配置され、ニトロセルロースでマーキングを整列させるために使用されている長手方向切片用チャック(11)の面に平行な筋(12)。液体凍結包埋剤の液滴を冷却チャックにブロックを取り付けるために使用される。鈍鉗子凍結筋ブロックを操作するために使用される。筋肉がチャックの表面に対して垂直になるように横断面を得るために、ブロックは、代わりに(図示せず)が取り付けられている。

図2
F2ヶ月の雌のC57BL6Jマウスの前脛骨からigureのNMJの2エン顔画像を、 ステップ 3.2で説明したように、新鮮な筋肉が瞬間凍結し、切片をスライド上に固定された。第一のプロトコルに記載のようにz軸のスタックの最大強度投影画像が得られた。(A)赤BGT染色(面図エン)のAChRに富む主要postjunctional樋二組からなる単一運動終板を明らかにする。(B)シナプトフィジンFITC結合二次抗体で染色すると、プライマリシナプス樋を占める、シナプス前神経末端を明らかにする。プレ末端軸索の一部がパネルの上部に表示されている。(C&D)の若い健康なマウスからの低品質のNMJ画像の一例。染色は弱く、シナプス前および後の専門分野の境界がぼやけて。これは、トンの不足に起因していた彼は組織および/または不十分な時間の処理は、一次抗体のインキュベーションを可能にした。パネルD中のスケールバーは、10μmを表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
図(プロトコル1で概説されるように)顔NMJ画像専用の処理におけるステップ3。 (A&B)オリジナル連続階調MIP画像はAChRのそれぞれシナプトフィジン緑免疫蛍光を明らかに赤色BGT蛍光を示す。(C)の端板を描くポリゴンツールの8ビットグレースケール画像に変換し、使用後のAChR染色(薄黄色の線)。(D)エンドプレートの境界線が緑色シナプトフィジン画像に引き継が。(E)APPL閾値上赤-BGT(AChRの)蛍光を分離し、二値画像を作成するための最低限の強度閾値コマンドのication。 ImageJのユーザインターフェースのスクリーンショットのシーケンスは、画像の左側に表示されます(F)バイナリシナプトフィジン画像別個のしきい値を適用した後の離散閾値上のAChRリッチドメインの(G)の同定終板内の分析粒子のコマンドを適用することによってバイナリ赤BG​​Tイメージに。パネルの左側の対応をImageJ((G)は 。必要な閾値上の画素領域の最小サイズを入力する必要があり、必要な入力データを示している。(H)バイナリシナプトフィジンとのAChR画像の重複領域の同定。重複が白画素で表現されるバイナリ重複画像に到達するためのステップを示す。選択された最小強度閾値を各蛍光cについて(パネルHの下)。ImageJのユーザインターフェースのスクリーンショットhannelは「共局在」ウィンドウ内で入力する必要があります。スケールバーは、10μmを表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
図相対蛍光強度(プロトコル2)を比較するために使用横断光学切片の4例としては。筋肉が瞬間凍結したとステップ3.2で説明したようにセクションでは、スライド上に固定された。(A&B)は 、単一のエンドプレート遠くで二重標識-Red-BGT。(AChRを、青疑似カラーにここに示されている)およびFITC抗rapsynがシナプス後膜におけるこれらの2つの相互作用タンパク質の共局在を示している(C&D)は 、隣接する筋線維ディスプレイ上の2つのエンドプレートは、共局在AC HRとMuSKの。(E&F)エンドプレートのAChRとα-ジストログリカン(-dg)のための二重標識。 -dgは(パネルAFのために、F中のスケールバー:25μm)を右筋繊維周囲の周りに延びるが、端板で濃縮されている(G - I)強度測定のためのエンドプレートを分離(G)は 、典型的な顕微鏡の視野を、。。 。三つ遠赤BGT-染色終板パネルGにおいて(スケールバーを含む:40ミクロン(H)箱入り終板の拡大画像(I)と同じ終板は、8ビットのグレースケール画像に変換され、ポリゴンを用いて線引き。ImageJの(薄い黄色の線)のツールの平均蛍光強度がこの境界線内で測定されている。(H&Iのためのスケールバー:10μm)をこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

常に ">:" =キープtogether.withinページFO」ontent 図5
シナプス領域を評価する上での画質の図5.影響。(A&B)、赤BGTと抗シナプトフィジン蛍光チャネル上で見る2ヶ月のマウスから健康NMJの顔画像EN高品質。(A '&BそれぞれAおよびBのために終板を横切って引かれた線に対応する')蛍光強度プロフィール。水平の赤い破線は。二値画像を作成するために使用される最小しきい値を示している高齢者のマウスから(C&D)エンドプレート。エンドプレートシナプトフィジン染色は、一般的にあまり強烈である。(C '&D')の強度プロファイルは、バック(シナプトフィジン(FITC)チャンネル内のシナプス外(ベースライン)蛍光変動の高レベルを示し、適切な閾値の決定に影響を与えるグラウンド)。この多くは、広域スペクトルの組織自己蛍光である。スケールバーは、10μmを表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図6
図6.筋肉内およびマウスとの間のNMJ間のシナプス領域の変動。(A)散布は、著者NTによって得られた7ナイーブ2ヶ月の雌のC57BL / 6Jマウスの前脛骨筋からのエンドプレートの合計のAChRが豊富な領域を示している。各シンボルは、エンドプレートを表す。各棒は1マウスから採取したエンドプレートのための平均±SDを表す。(B)散布が同じエンドプレート用のシナプトフィジンに富む領域を示す。(A ') )。(B ')のエンドプレート(プールされたデータ)のシナプトフィジンの豊富な地域のための度数分布のための周波数分布。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図7
エンドプレートの蛍光強度の推定の際にサンプルサイズの図7の効果。横光学切片は、健康な2ヶ月齢マウスの前脛骨筋から40 60のエンドプレートで(任意の単位)の蛍光強度を測定した。累積平均は平均に含まれるエンドプレートの数に対してプロットされている。(A)エンドプレート赤BGTの蛍光強度は、著者のAVによって得られた。(B)抗synaptophysi著者NGによって第筋肉試料から得られた。パネルCと同じ終板から(D)抗rapsyn免疫蛍光強度nはパネルAと同様の終板のための免疫蛍光強度。(C)エンドプレート遠赤BGT蛍光強度。

調査 筋肉 マウスの数 AChRのエリア シナプトフィジンエリア オーバーラップエリア
平均±SD(μm2で) 平均±SD(μm2で) 平均±SD(μm2で)
MORSCH (2012年)1 腓腹筋 3 181±7 163±24
ダイアフラム 3 130±41 102±21 76±26
MORSCH (2013年)1 前脛骨筋 3 166±26 117±21 ND
Cheng ら。(2013)2 前脛骨筋 4 226±18 150±44 110±34
ツェ(未発表)2 前脛骨筋 7 213±27 157±23 111±11
図1は、ツァイスLSM 510メタ顕微鏡ではなく、固定ゲインで画像化し、レベルをオフセット。閾値化とシナプス領域の測定値はをMetaMorph softwarを使用MMによる電子。
図2は、治療群にブラインド示される第1の著者による現在のプロトコル以下のライカDM IRE2顕微鏡で画像化し、分析した。
ND決まっていない。

2月齢の雌C57BL / 6JマウスののNMJ表1.シナプス領域(健常対照)

調査 筋肉 *効率(%)をFRET レンジ(%)
(平均±SEM)
Brockhausen (2008) 前脛骨筋 24±1 NA
Cole 2010 前脛骨筋 26±1 22から30
MORSCH(未発表) ダイアフラム 37±1 24から47
Ghazanfari(未発表) 前脛骨筋 30±1 20から45
* FRETペア= 51A用の赤BGTと遠赤-BGT(フェルスター半径(Life Technologies社)との間のFRET。
データは使用できません、NA

表若い成体マウスC57BL6JマウスからのAChR FRET 2.効率性

Discussion

ここで説明するプロトコルは、確実に測定し、正常な老化と疾病状態を含む条件の範囲にわたって、NMJの特性の変化を定量化するために私たちを有効にしている。顔NMJ画像専用のために記載された方法は、研究者が前と後シナプスの専門分野の面積とシナプス重なり/位置合わせの面積を比較することができるようになります。前およびシナプス後のタンパク質の相対的強度を比較するために横方向の光学切片を使用する第2のプロトコルは、好ましい。第三のプロトコルは、具体的にはシナプス後膜における性AChRのパッキングの近接の変化をテストします。

特異コントロールは、免疫蛍光顕微鏡で不可欠です。間接的免疫蛍光のために、任意の一次抗体を使用する場合は、最初に、筋肉切片におけるその標的タンパク質に特異的に結合することを保証する必要がある。組織処理および固定異なる種類の差次の特異性を変化させることができる抗体。それは本当に運動終板でのAChRに集中している(たとえばのrapsyn用)その免疫蛍光染色を確認することが重要です。陰性対照セクションはまた、抗体結合が特異的であることを確実にするために検査する必要があります。 - / -マウス例えば、rapsyn免疫蛍光のための最高の負の制御はrapsynからのセクションになります。これらは、抗rapsynとのエンドプレート染色を示さないはずである。非特異的蛍光は、組織(自家蛍光)または蛍光二次抗体コンジュゲートにより、非特異的結合からの内因性蛍光化学物質から生じ得る。このような蛍光は、多くの場合、アルデヒド固定によって悪化する。また、エンドプレートのTRITC-BGT染色は時々FITC蛍光チャネルで検出することができ、この蛍光ブリードスルーは、特定のFITC免疫蛍光と混同されるかもしれない。非特異的蛍光の後者の三つの形式を防ぐため、染色されたスライドのすべてのバッチは、いくつかの 'Nを含むべきであるO-一次抗体コントロール」セクション(3.7および4.6ステップ)。これらの制御部からエンドプレートの画像は、のNMJの間接的な免疫蛍光染色が本当に一次抗体の結合を反映していることを確認するために実験的なスライドからのものと比較すべきである。

横方向の共焦点切片はシナプスにおける免疫染色の相対強度の違いを評価するために特に有用である。横断共焦点セクションでは、シナプスタンパク質の正確な共局在を判断する方が簡単です。三日月形のエンドプレートプロファイルは、単にサンプルカットスルーNMJ問題になっているを表します。しかし、バックグラウンド(シナプス)の蛍光は、一般的に下面をz投影画像専用と比較される。このように、「本当の」(特定の)免疫染色を識別し、固定された共焦点ゲインを確立し、横方向の光学切片13-15,18を使用して値相殺するために容易にすることができます。例えば、重症筋無力症のマウスモデルにおいて(wher無力E端板のAChR染色は著しく減少する)エンドプレートは明らかに横断光学切片18,21-に描写された。 NMJでの蛍光の平均強度の差は、シナプスの専門内の標的タンパク質の改変された密度を反映する可能性がある。注意点は、いくつかの状況では、隣接するタンパク質による抗体結合の標的タンパク質または閉塞の構造変化は、改変された染色強度を説明するかもしれない、ということである。

実験のデザインは、いくつかの検討が必要です。多くの場合、実験は、NMJのサイズに導入遺伝子、遺伝子ノックダウン、または疾患状態の影響をテストすることを目指す。実験サンプルのグループは、同じ性別と遺伝的背景の健康な若い(野生型)マウスと比較されることがあります。終板シナプトフィジン、AChRのいくつかの筋シナプスの重なり部分の面積の基準値を表1に示した。サンプルサイズは、動物性の程度に依存する治療群内の-to-動物変動と効果の大きさ(標準偏差あたりの実験対対照群のための平均の差)。分析は、品質の良い画像に制限されると一貫性の公正度は、試料中に発見された健康的な2ヶ月の雌のC57BL6Jマウス( 図6AおよびB)間のエンドプレート領域ための手段。このように、3匹のマウス17,20,32のサンプルサイズが、対照と比較して、患者を無力抗MuSKの陽性重症筋からのIgGを注射したマウスにおけるシナプス領域において有意な30〜40%の減少を実証することができた。高齢マウスは、若いマウス22よりエンドプレートパラメータのより大きな動物·ツー·動物の変動を示した。結果的に老齢マウスを含む実験は、より大きなサンプルサイズが必要になる場合があります。

主な関心事は、専用顔終板のサイズを測定することである場合、ゲインとオフセットレベルの設定は、すべての個々のNMJのために最適化されるべきである。枚ずつ指定idualのNMJは、疾患状態が検査される場合は特に、のAChRとシナプトフィジン染色の明るさがかなり変化することができる。また余分なシナプス(非特異的)蛍光の強度は、健康な若い動物( 図5CおよびD)のものと比較して、老化した動物の筋肉の多くの場合より高く、より可変である。最終画像内に保持される色調情報を最大にするように、1〜256の階調を十分に活用すべきである。これは、ゲインを調整伴い、zスタックを収集する対象となるすべてのNMJためのレベルを相殺する。 図5Dは、色調情報の前および後の領域の境界を定義する上で重要である可能性がNMJ画像の一例を示しているシナプスの専門分野。

シナプス領域の測定は、異なる筋肉製剤および実験に適用することができる。シナプス領域の我々の測定のほとんどは、スナップから縦凍結切片を採用してきた凍結した筋肉。固定前に筋肉をフリーズすると、広範囲のタンパク質の抗原性を維持します。ときは、抗原との互換性、事前の凍結切片にパラホルムアルデヒド固定およびショ糖浸潤(ステップ2.1)はNMJ構造の良好な保存を提供することができます。最適な構造的な保存はパラホルムアルデヒドで心臓灌流によって得られる可能性があります。凍結切片のアーティファクトは、完全に固定された筋肉21からからかわ分冊に無傷で筋肉やイメージングのNMJの表面上の標識のエンドプレートによって回避することができる。関係なく、準備の、サンプリング、画像処理およびエリア定量のための手順は、(プロトコル手順4〜5)変わらない。ブラインドサンプリング、イメージングおよび分析プロトコルの一貫した適用は、かなり再現性の平均値( 表1のチェンとツェ結果を比較)をもたらすことができる、(異なるオペレータ、マウスおよび異なる時間の異なる試料を用いて)。

">エンドプレートは、種々の疾患状態における「断片化」になっとして記載されている。例えば、マウスの筋肉、筋線維の散発変性老化にプレッツェルのようなエンドプレートのAChRプラークのリモデリングをもたらした(その再生が続く)フォームに複数の小さいのAChRクラスター6。抗ムスク重症筋無力患者を無力からのIgGを注射したマウスでは、エンドプレートの断片化はかなり異なっていた。大部分が分散したエンドプレートのAChRのプレッツェル、小さな(<4メートル2)のAChR「微小凝集の星座を残し「20,21。これらの2つの例は、実験動物に対する制御21の終板でのAChRクラスタのサイズ分布を比較する必要性を強調している。

他の方法は、NMJでのシナプス領域または染色強度を評価するために報告されている。ここで使用される2次元のz投影画像がSYNを過小評価する可能性がありますように、モータのエンドプレートは、時には折り畳むことができるaptic地域。絶対的なシナプスの面積が33を定義する必要があります場合は、三次元共焦点再構成は、より正確な措置を提供することがあります。ここで説明するz軸投影プロトコルの重要な利点は、しかしながら、複数の治療群と電位の変化の信頼できる同定から測定されるエンドプレートの多数の許可された比較的単純である。終板の染色強度を比較するためのプロトコルは、多くの異なるシナプスタンパク質のレベルの変化を研究するために適合させることができる。この方法は、全てのサンプルは、同じ共焦点セッション中に撮像された免疫蛍光のために処理される要求によって、しかし、限られている。ヤンポリスキー 5による最近の研究では、この制限を克服するに役立つかもしれないエンドプレートのAChR密度を測定するための方法を説明した。本研究では、終板の同じフィールドは、いくつかの異なるレーザパワー設定で画像化した。レーザパワーとrhodami関係の傾きね-BGT蛍光強度が異なるマウス5におけるエンドプレートでのAChR密度の相対的変化を評価するために使用した。この方法は、長期間の研究の過程で異なる時間で撮像されたサンプル中のAChRの強度を比較するのに有用かもしれない。

のAChR-AChRのFRETは、終板性AChRの組織について具体的かつ補完的な情報を提供します。 125を使用して電子顕微鏡オートラジオグラフィー。隣接する膜infoldingsはAChRの34の非常に低い密度を含んでいながら、I-α-BGTは、10 4メートルの平面密度-2直ちに伝達物質放出の各シナプス前サイトの下で密に充填することが性AChRを示している。 AChRの-AChRのFRETは、比較的簡単なAChR包装で(超顕微鏡的)の変化を検出することができる。 FRET効率の低下は、平均BGT蛍光強度の変化によって検出されないことがありシナプス後膜における性AChRの超顕微鏡的再配分を反映する。複数のF俳優はFRETの効率の変化を引き起こす可能性があります。これらは、ドナー·アクセプターの間隔と相対的な向きだけでなく、分子環境35,36が含まれいます。終板FRET効率の低下は、おそらくのAChR格子の幾何学の変化から生じる可能性がある。しかし、ほとんどの場合、それは、ナノスケールのシナプス後分子格子14にパックされ性AChRの割合の減少によるものであろう。

運動ニューロン及び筋線維の間の接続の損失は、運動ニューロン疾患および定住老化9,22,23における筋力低下の直接の原因であると思われる。のNMJを測定するための共有メソッドとパラメータは、簡単に別の研究グループは、公開調査結果を比較対照するために作る必要があります。詳細なプロトコル(およびそれらの将来の改善)の共有は、それが疾患状態に影響を受けることができるかNMJメンテナンスのメカニズムを理解する上で進歩を促進し、助けることができる。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scanning confocal microscope Leica DM 2000 with  TCS SP2 system Most scanning confocal microscopes should be suitable. 
Zeiss LSM 510 Meta 
Leica SPE-II
Alexa555-a-bungarotoxin (red-BGT) Life technologies B35451 Used for labelling AChRs
Alexa647-α-bungarotoxin (far-red-BGT) Life technologies B35450 Far red fluorescence: barely visible through the eyepiece 
rabbit anti-synaptophysin Life technologies 18-0130 Different batches of primary antibody differ in effective working dilution
FITC-anti-rapsyn mab1234 Milipore FCMAB134F Monoclonal antibody conjugated to FITC
FITC-donkey anti-rabbit IgG Jackson 711-095-152 Polyclonal secondary antibodies can vary in quality according to source and batch
Optimal Cutting Temperature compound (O.T.C.) ProSciTech IA018 Cryostat embedding matrix for freezing  muscles
DABCO Sigma 10981 Mounting medium that slows photobleaching of fluorophores

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神経筋接合部:測定シナプスサイズ、断片化および共焦点蛍光顕微鏡を用いてシナプスタンパク質の密度の変化
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Tse, N., Morsch, M., Ghazanfari, N., Cole, L., Visvanathan, A., Leamey, C., Phillips, W. D. The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (94), e52220, doi:10.3791/52220 (2014).More

Tse, N., Morsch, M., Ghazanfari, N., Cole, L., Visvanathan, A., Leamey, C., Phillips, W. D. The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (94), e52220, doi:10.3791/52220 (2014).

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