Abstract
レーザーまたは発光ダイオード（LED）によって送達赤/近赤外光療法（R / NIR-LT）は、おそらく酸化ストレスを減少させることによって、in vivoでの中枢神経系損傷の範囲内の機能的および形態学的転帰を改善する。しかし、酸化的ストレスに対するR / NIR-LTの効果は波長や照射強度に応じて変化することが示されている。治療パラメータを比較した研究は、スループットインビトロ最適化研究において高適し複数の波長または強度を提供し、商業的に入手可能なデバイスが存在しないこと、に起因する欠けている。このプロトコルは、与えられた損傷モデルに必要な治療用量を最適化するための波長および強度の範囲で光を送達するための技術が記載されている。我々は、波長および強度のパラメータを容易に変更することができた光を送達する方法は、活性酸素種を減少させるためのR / NIR-LTの最適用量の決定を容易にすることができるという仮説を立てin vitroで（ROS）。
非コヒーレントキセノン光は、光の各波長（440、550、670及び810nmの中心波長）とフルエンス（8.5×10 -3 -1×10 3.8 J / cm 2程度） を送達するために狭帯域干渉フィルターを通して濾過し培養細胞へ。装置から出力された光は、各波長の光の治療に関連する、同じ量子的用量を放出するように較正した。グルタミン酸は、DCFH-DAとH 2 O 2感受性蛍光色素を使用して、光で処理した細胞を強調に反応種が検出された。
我々は成功し、CNS損傷のモデルとしてグルタミン酸に曝露された培養細胞に、生理的におよび治療に関連する波長および強度の範囲で光を配信。現在の研究で使用したR / NIR-LTのフルエンスは、培養細胞によって生成されたROSに影響を及ぼさなかったが、光送達の方法は、他のシステム経験にも適用可能であるemsのは、単離されたミトコンドリアまたはそれ以上の生理学的に関連する器官型スライス培養モデルを含む、酸化的代謝のアウトカム指標の範囲への影響を評価するために使用することができる。
Introduction
活性酸素種（ROS）は、シグナル伝達経路および神経保護1のものを含む細胞代謝の正常な反応の範囲のために必要とされる。内因性の抗酸化機構がROSの産生を制御することができないしかし、細胞が酸化ストレス2,3に屈することができる。 CNSへの傷害後、ROS及び酸化ストレスの存在下での関連する増加は、損傷4,5の進行において重要な役割を果たしていると考えられている。評価されている酸化ストレスを減衰させるための戦略の大規模な数にもかかわらず、神経外傷6以下の臨床使用においてROS産生と関連した酸化ストレスを減衰させるには完全に有効な、臨床的に関連する抗酸化戦略は現在のところ存在しない。そのため酸化ストレスの減衰が治療的介入7のための重要な目標である。
改善が続くるR / NIR-LTは、傷害、おそらく酸化ストレスを減少させることによって噴門梗塞サイズ、糖尿病時の腎臓および肝臓の合併症、網膜変性、CNS損傷および脳卒中8の減少を含む、広範囲の疾患において報告されている。 CNS損傷に特に関連して、670nmの光の効果の前臨床試験は、網膜変性9-11、脊髄損傷12、ニューロン死13のモデルにおいて良好な効果を示した。臨床試験は、乾燥加齢黄斑変性症のために実施し、ストローク14のために、現在進行中でされてきた、しかし、これらの試験の結果はおそらく効果的な治療パラメータ15を採用する障害のため、有望な表示されません。このように、R / NIR-LTが広く、管理が容易な、非侵襲的で比較的安価な治療にもかかわらず、神経外傷の通常の臨床診療の一部として採用されていない。臨床翻訳への障壁は、CLの欠如、早期の標準化された効果的な治療プロトコル16,17の作用と不在の仕組みを理解していた。現在の光療法に関する文献は、照射源（LEDやレーザ）に対する治療パラメータの変動の過多を明らかにし、照射の波長（ 例えば 、630、670、780、810、830、880、904nm）、総投与量（ジュール/単位面積）、持続時間（露光時間）、タイミング（前または後の傷害）、配信の治療頻度及びモード（パルスまたは連続）8。研究間の治療パラメータの変動は、比較を困難にし、有効性16に関して懐疑的な見方に貢献してきました。
従って、R / NIR-LTの最適化が明らかに複数の変数を比較するために必要なハイスループットスクリーニング機構を提供することができる細胞培養系で、必要とされる。しかしWA上に十分な柔軟性と制御を提供することができ、いくつかの市販の照明システムがあるvelengthおよび強度は、このような最適化実験を行う。市販のLEDデバイスは、一般に、強度だけではなく変化し得る異なるメーカーからの複数のLED素子を用いた研究者らは、その結果、複数の波長または強度を、提供することができ、また、発光波長のスペクトルではない。我々は、狭帯域干渉フィルターを通して濾過し、広帯域キセノン光源を用いて光の波長およびフルエンスの範囲を生成し、R / NIR-LTのパラメータの近くに、正確な制御を可能にすることによって、この問題に対処している。
これは、処置の治療用量は、R / NIR-LTの場合、シトクロムcオキシダーゼ （COX）18であると仮定され、photoacceptor（発色団）と相互作用する光子の数によって定義されることに留意することが重要である。配信光子エネルギーは、波長に応じて変化する。異なる波長におけるエネルギーの等しい用量を意味するであろうコム光子の異なる数の珍重。したがって、装置から出射された光は、試験されるべき選択された波長の各々についての光子の数と同じ数を放出するように較正した。我々は、in vitroでの細胞への波長および強度の範囲でR / NIR-LTを送達するために用いることができるシステムを開発したが施さ細胞におけるROS産生に対する配信R / NIR-LTの効果を測定する能力を実証しているグルタミン酸ストレス。
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Protocol
1.光学的較正：光出力を測定する
- 光送達装置を調製するために、適切な電源に広帯域光源（ 例えば 、キセノン又はタングステンランプ）を接続する。光の平行ビームを生成する光源の前にコリメートレンズを配置します。光ビームからの熱の大部分を除去するために液体の熱フィルタを通して光を通過させる。用途に応じて、光のより柔軟な送達を提供する液体光ガイドの入口開口部上にコリメートされたビームの焦点を合わせる（ 例えば 、インキュベーター内に）。
- 液体ライトガイドの他端側に、第2コリメートレンズと、干渉および中性密度フィルタ用のホルダーを配置する。この配置は必要な波長帯と強度の光の均等に照射スポットを生成することを確認してください。
注：光ガイドと試料面の端部との距離が依存して変化する必要があるかもしれ点灯しますが、ライトガイド増加の端からの距離が、光強度が減少することを覚えなければなりません領域。本研究では、この距離は14センチメートルで均等に96ウェルプレートに3×3のウェル領域を照明ビーム断面を生成する。 - ランプと関連する光学部品からの迷光が試料に到達できないことを確認してください。
- 液体熱フィルタ用のウォータークーラーの電源を入れ、フィルターのジャケットを通る水の交換があることを確認。ランプ電源をオンにして、安定させるために広帯域光源のために少なくとも5分間待ちます。注：水冷却器の使用は、装置の過熱を防止するために必要とされる。
- 照明の所望の波長帯を生成するために（通常、中心波長、ピーク透過率及び半値（FWHM）帯域幅全幅によって記述）狭帯域干渉フィルタを選択する。注：現在の研究で使用した狭帯域干渉フィルタは4であった42ナノメートル、550ナノメートル、671 nmおよび810 nmの。
- 標本は、処理中に置かれるべき面でランプの光を測定します。製造業者の説明書に従って適正ソフトウェアを使用して、適切な分光放射計に接続された較正された放射照度プローブ（コサインコレクタ）を使用して光を測定する。
- 所望の出力が得られるまでの光の強度を調整するために減光フィルタを使用する。注：本研究では、各干渉フィルタを通過した光の強度は、4つの治療波長帯の各々で同じ量子的出力を与えるように調整される。ランプ出力を変更することがありますようにそれは、定期的にキャリブレーションを確認することが重要です。
注：装置のセットアップ後、細胞を照射することができる状態にある図1現在の研究で使用される光伝送装置の図である。
光送達装置。イラストの図1の画像は、光動力源、ハウジング、コリメートレンズ、水フィルター、入口開口部は、液体ライトガイド、第2コリメートレンズ、フィルターホルダー、処理フレームとマットブラックカードとキセノンランプである。狭帯域波長および強度フィルタが示されていないことに注意してください。
2.細胞調製
- 記載R / NIR-LT配信方法は、任意の細胞型またはin vitroモデル系で適用することができる。細胞培養のような以下の説明は、培養褐色細胞腫（PC12）、ミュラー（RMC1）及び一次混合網膜細胞への十分に確立された技術を用いて、一般的なものである。
- 光線処理および酸化ストレスアッセイのための細胞播種の前に、培養物は、T75のトロボの活用の適切な補助剤（ 例えば 、FBS、抗生物質）を含有するそれぞれの増殖培地中で細胞を不死化70〜80％コンフルエントになるまでKS。
- 例えば 、試験される細胞型に適した方法を使用して、T75フラスコから不死化細胞を剥離。、トリプシン。 96ウェルアッセイプレートを、1時間のために10μg/ mlのポリ-L-リジンで被覆アッセイプレートのウェル（ 例えば 、PC12細胞）またはのための10μg/ mlのポリ-L-リジンでの細胞の播種に進む前に、必要に応じて10μgのとO / Nインキュベートし1H / mlのラミニン（ 例えば 、混合した網膜細胞）。
- 遠心分離し、細胞のような適切な収集する（ 例えば 。、RMC1細胞用218×gでPC12細胞または10分間405×gで3分）、適切な細胞培養培地の8ミリリットルで上清と再懸濁を削除します。
- 混合した網膜細胞を使用する場合は、確立された手順19に従って、酵素消化（パパイン）によるP0-5新生児ラットの子から準備
- 血球計を使用して、0.4％（w / v）のトリパンブルー色素を除いた生存細胞の数を数える。
- 細胞密度のSUCを調整細胞は、培養中の24または48時間後に約70〜80％コンフルエントになる時間。 （PC12細胞のための播種密度はRMC1細胞については、2.5×10 5生存細胞/ mlで、混合網膜細胞を、8×10 5生存細胞/ mlで、4.0×10 5生存細胞/ mlである）。透明または黒色96ウェルプレート（それぞれH 2 O 2またはDCFH-DA分析のために使用される）のいずれかにセルを追加した後、適切な増殖培地100μlに、プレートを37℃で平坦な表面の上に座ってすることができ、5 ％CO 2細胞接着を可能にするために、少なくとも24時間（または任意の条件は、特定の細胞型に適している）。
- 適切な96ウェルトレイ内の増殖培地で培養細胞彼らは70〜80％コンフルエント（PC12とRMC1細胞について24時間、混合網膜細胞のために48時間）になるまで。
3.細胞にグルタミン酸ストレッサーを追加する
- 適切なフルグローにおける0-10mMのL-グルタミン酸モノナトリウム塩の水和物ストレッサー濃度を準備第培地。
- 細胞から培地を除去し、静かにPBS（PC12）またはHBSS（RMC1および混合網膜細胞）で細胞を3回洗浄する。洗浄後、100μl/ウェルの総容積にグルタミン酸含有培地を追加します。
光処理のまず投与量
- 直ちにグルタミン酸または任意のストレッサーを添加すると、準備された光送達装置の下に配置することによって、所望の波長および強度の光治療に細胞をさらす。投与されている波長に応じて減光フィルタの確立組み合わせを使用して光ビームの量子的出力を変更してください。
注：現在の実験では、37°C のヒートパッド96ウェルプレートを休止することによって温度を維持するために3分間光治療に細胞をさらす。必要に応じて処理時間を変化させてもよい。- 96 WEL内の隣接するウェルに光反射を防止するために、細胞の下にマットブラックカードを置きますLトレイは、他の治療パラメータに指定された。
- 治療は、時間のより長い長さのために所望される場合、細胞培養培地のpHを維持するか、理想的には、CO 2 CO 2 5％に調整濃度、または最適な条件下でインキュベーター内装置および処理プレートを配置し、25mMのHepes緩衝液を追加特定の細胞型のために。
- 光処理の終了後、水平な面に細胞を置き、24時間37℃、5％CO 2（または細胞型のための最適なあらゆる条件）でインキュベートする。
注：上記のように必要に応じて、R / NIR-LTの追加の投与量は、投与することができる。
ROSの光処理と検出5.最終剤
- 光治療の最終ラウンドを実行する前に、試薬はROSの検出に使用する準備。 50mMのクエン酸緩衝液（pH6.0）、トリトンX100、およびH 2 O 2検出試薬加工を準備溶液（1：2：10mMのH 2 O 2検出試薬原液の97比; 10 U / mlの西洋ワサビペルオキシダーゼ、50mMのクエン酸ナトリウム（pH6.0）中）。適切なメディアで100μMの最終濃度でDCFH-DAを準備します。
注：PC12細胞についてのDCFH-DA試薬RPMI培地中で、RMC1細胞のためのDCFH-DA試薬は、DMEM培地である。市販の検出試薬は、特定のROS差動感度を有しており、試薬は、個々の用途のために必要な情報を提供するように慎重に選択されるべきであることに留意されたい。 - ステップ4.1-4.1.2で説明したように、細胞に光治療を管理します。細胞が光の所望のフルエンス/波長で治療を受けていることを確認してください。
- 直ちにグルタミン酸含有培地を除去し、適当な緩衝溶液で2回洗浄し、光処置後（PC12細胞のために、PBSを使用し、RMC1細胞について、HBSSを用いている）。次のように細胞上のROSアッセイを実行します。
- H 2 O 2 2を 37℃でインキュベートし、5％。 H 2 O 2の検出作業溶液50μlを加え、室温で30分間インキュベートする。 530nmの励起波長および480nmの発光波長でプレートリーダーを用いて蛍光を測定する。
- DCFアッセイ：各ウェルにDCFH-DAの100μM溶液100μlを添加し、37℃で30分間インキュベートし、5％CO 2。 100μMDCFH-DAを含む培地を除去し、（上記のように）を2回適当な緩衝液で洗浄する。各ウェルに緩衝液90μlのと10μlのトリトンX100を加え、穏やかに37℃で15分間のインキュベーションの前に30秒間のオービタルシェーカー上振る。 480nmでの励起波長および発光ヴァヴェルでプレートリーダーを使用してDCF由来の蛍光を測定する530nmののength。
- エクスプレスROSタンパク質1mgを計算するために標準曲線を用いて、製造者の指示に従ってタンパク質濃度を定量するための比色キットを使用して、ウェル内に残っている細胞のタンパク質濃度に相対値。
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Representative Results
670nmの波長で照射される光の出力は、以前に、生体内 （0.3 J / cm 2）を20 で有益であることが示さ670nmの光の量を包含するフルエンスの範囲で細胞を照射するために減光フィルタを用いて較正した。光源の前に減光フィルタの数が増加するにつれて、強度（W / m 2）が少ない光がターゲット領域に通過させる、減少した。表1は、波長フィルターを取り付けた光源から発生した670nmの光の較正データを提示し、光出力の記載距離で使用されるNDフィルタの数と、結果として生成された光の強度を含む。フルエンス、または670nmの光（J / cm 2）のドーズ量、の式から計算した：量（J / cm 2）を =（光の強度（W / m 2）の/ 10,000）を時間（s）×]処理時間は180秒だった。
| NDフィルタの数 | 光出力からの距離（cm）の | 強度（W / M ^ 2） | 線量（J / cm ^ 2で） |
| 0 | 10.5 | 20.11 | 0.38 |
| 0 | 14 | 10.55 | 0.19 |
| 1 | 14 | 4.91 | 0.075 |
| 2 | 14 | 2.28 | 0.041 |
| 3 | 14 | 1.03 | 0.018 |
| 4 | 14 | 0.47 | 0.0085 |
| 5 | 14 | 0.21 | 0.0038 |
| 6 | 14 | 0.094 | 0.00169 |
| 7 | 14 | 0.045 | 0.00081 |
| 8 | 14 | 0.021 | 0.000378 |
| 9 | 14 | 0.013 | 0.000234 |
表1：NDフィルタの670nmの波長フィルタ .NUMBER を取り付け、光伝達装置の出力は、光源出力の前面に取り付けられた減光フィルタの数を指す。目によって報告される強度（W / m 2）が光の強度を指しE可否ソフトウェア。フルエンス、または用量は、露光時の光出力から180秒までの距離であった式[投与量（J / cm 2）を =（光の強度（W / m 2）の/ 10,000）×時間（秒）]によって計算した10.5または14 cmであった。
光の2つの臨床的に関連する量子的フルエンスは、ROSの産生に対するR / NIR-LT波長の異なる効果を調査するために選択した。 0.03 3分間の治療のためにJ / cm 2で、4.9×10 14光子/ cm 2の/と同一視LED素子（670nmの時、すなわち、1.78 W / m 2） の 20を使用して、その上の組織を通して送信後CNSトラクトに達することができる用量S。 442、550、670または830nmの放射をもたらすためのフィルターを備えた光源は、その後、エネルギー出力（J / cm 2）とは対照的に、波長ごとに等しい量子的出力（光子）を放出するために減光フィルタの組み合わせを使用して較正し、および投与量（J / cm 2）の及びInteにW / m 2を算出した（表2a）でnsities。細胞活性21を刺激するために推奨されるガイドラインの範囲内であった追加のより高用量もし（1.29×10 15光子/ cmの2 / s）の使用、およびキャリブレーションは、各波長（表2b）を行った。
| 波長（λ） | 線量（J / cm ^ 2で） | 強度（W / M ^ 2） | 放射（光子/ cm ^ 2の/秒） |
| 442 | 0.057 | 3.21 | 4.8×10 ^ 14 |
| 550 | 0.051 | 2.87 | 5.0×10 ^ 14 |
| 670 | 0.032 | 1.78 | 4.9×10 ^ 14 |
| 830 | 0.018 | 1.01 | 4.9 X10 ^ 14 |
表2：波長を変化させて光の光子等しい数によって送達投与量の強度の較正強度（W / m 2）を 、3分の処理（J / cm 2）のための投薬量および放出（光子/ cm 2の/秒）。 442、550、670及び830nm発光キセノン光の出力は、14センチの距離で）4.9×10 14光子/ cmの2 / s以下B）1.3×10 15光子/ cm 2の/ sにAを放出するように較正されたとき光出力。
装置によって供給される光が使用される投与量で細胞に対して毒性であったかどうかを評価するために、我々は、比色タンパク質アッセイを使用して、ROSアッセイ以下のPC12細胞の培養ウェル中に残存するタンパク質含有量を評価した。光（P> 0.05）の高出力用量のいずれかでのタンパク質の有意な損失はFIGURは、（供給される光の投与量は、細胞死を引き起こすしなかったことを示す、存在しなかった電子2）及び酸化的代謝の評価に使用することが適切である。
図2：R / NIR-LT及びROSアッセイ以下の培養ウェル中に残存する総タンパク質濃度での光の様々な用量の効果 。ヒストグラムバーはPC12細胞培養ウェルにおけるSEMタンパク質濃度の平均±6回の反復/濃縮され、実験は3回繰り返した。分散分析（ANOVA）において、p> 0.05によって決定されるように制御し、いずれの処置群の間で統計的に有意な差はなかった。
我々は、最初に光送達装置の適合性を評価するために、例えば波長として、0.0085から0.38 J / cm 2の範囲のフルエンスで送達670nmの光の影響を評価した。有意なEFFんH 2 O 2またはPC12、RMC1または混合網膜細胞におけるDCF蛍光は、グルタミン酸（ 図3、P> 0.05）とのストレスを評価する際にいずれかの670nm光の電気ショック療法は、試験したフルエンスのいずれかで観察された。同様に、H 2 O 2を評価する際に/ NIR-LTは、4.9×10 14光子で送達R /センチメートル2 / s以上1.3×10 15光子/ cmのROS産生に対する2 /秒、波長を変化させる有意な効果はなかった、またはDCF蛍光（P> 0.05、データは示さず）。反応種の変化を検出する能力は、10mMのグルタミン酸で22.10±2.10に13.44±0.67 mMのグルタミン酸でのDCFH-DA反応性色素の蛍光の増加によって確認される。我々のデータは、R / NIR-LTは、選択されたモデル系におけるROS産生に対する我々の光送達装置を用いて送達されず、いずれも細胞培養における持続タンパク質含有量によって示される、損なわれていなかったとしてそこに負の効果であったの正の効果を明らかにしていないが光療法（ 図2）は、次の井戸。このように、記載の方法は、ある範囲の波長で光子の定義された量で、細胞またはミトコンドリアを処置するためのプロトコルを提供し、より高い投薬量およびR / NIR-LTパラメータの最適化を可能にすることができる代替のアウトカム指標を評価することができる。
図3：PC12（A、D）におけるH 2 O 2（AC）およびDCF（DF）蛍光の定量、RMC1（B、E）または混合網膜細胞（C、F）、10mMのグルタミン酸ストレッサの存在下で培養物0.38 J / cmで、2 - 0に至るまでフルエンス用量で、670nmの照射療法後 。ヒストグラムバーは平均値±SEM任意の蛍光単位/μgタンパク質を表す。統計的に有意なはなかったANOVA、pで決定されるように制御し、いずれの処置群間の差> 0.05、群当たり6回の反復は、実験を3回繰り返した。
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Discussion
我々が正常にR / NIR-LT インビトロの最適化の研究のためのメカニズムを提供するための正確かつ較正された送達システムを適応している。 R / NIR-LTの波長および強度のパラメータは、このシステムを使用して、正確かつ効率的に操作されることが可能である。我々は、ROSは、試験した細胞型において、送達波長および用量で減少しなかったが、細胞の光治療は、細胞死をもたらさなかったことを確立した。 670nmの（20.11W / m 2）の時、現在のシステムによって達成される最大強度は1.17 W / m 2を視神経及び0.3Wの腹側表面に到達したラットの脳への照射の浸透度の以前に公表された措置を超えている/ m 2の脳のケースの腹面に達した。 0.31 J / cm 2を - 30分間送達される場合、 生体内での視神経の細胞によって受ける線量は、したがって0.054です。現在の研究で配信さ670nmの光の量（0.38J / cm 2程度）まで、したがって我々のin vivoでの以前の研究で細胞によって受信されたものを包含する。
R / NIR-LTの有効性の最も広く受け入れられている理論は、したがって、それは、様々な波長で処理した細胞は、光の（光子/ cm 2に /秒）に等しい量子的フルエンスを受け取ることを保証するために不可欠である、photoacceptorベースのシステム18のものである8。また、光の特定のフルエンスを提供するために使用される露光時間が増加し、時間をかけて合計フルエンスを減少させるために変更する光の強度のみで、治療間で一貫性が維持されなければならない。以前の研究は、露光時間を変更するアウトカム指標の差に等しいフルエンスの結果を提供し、交絡因子として作用することが、特に損傷モデル22,23に必要な最適な波長/フルエンスパラメータの識別を妨げることを実証した。このように、我々は投与量を慎重に校正をお勧めします試験した各波長で、R / NIR-LTの有用な最適化を確実にする。
記載された技術は、細胞構造の維持、複雑な細胞間相互作用に起因するより有意義な結果をもたらし得る器官型スライス培養を含むインビトロモデル系の範囲への光の送達を可能にする。損傷モデルの変形がR / NIR-LTの治療パラメータの差を必要とする場合がある。この技術は、記載器具類を用いて達成可能な最大電力出力によって制限される。高電力出力は、いくつかのインビトロおよびインビボ用途において最も必要とされ得る。光の高出力が必要な場合は、装置は、試料に到達する光の強度を増加させるために変更することができる。光終端と標的細胞との間の距離を短くすると、プレートに到達する光の強度を増加させる。代替的に、光がミラーから反射し、親しい同僚のような細胞上にすることができる液体ライトガイドを介して濾過されることにsedの、しかし代替波長および中性密度フィルタは、これを達成するために必要とされる。この方法は、R / NIR-LT内における照射8,20の効果的な浸透度を確保するために必要な増加した投与量に起因するCNS損傷のインビボモデルの送達に適合されるならば、より強力な光源を用いて高出力化にも必要とされる。
結論として、本研究は、効果的にR / NIR-LT研究において光の強度および波長のパラメータを変更する手段を提供する光送達の新規な方法を記載する。この方法論は、アウトカム指標の範囲を採用したR / NIR-LTの最適化およびin vitro傷害モデルで有用であろう。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OxiSelect Intracellular ROS Assay Kit (Green Fluorescence) | Cell Biolabs | STA-342 | |
| Amplex UltraRed Reagent | Molecular Probes | A36006 | |
| 300 Watt Xenon Arc Lamp | Newport Corporation | 6258 | Very intense light source, do not look directly into the lamp. Ensure there is sufficient cooling to the lamp whilst it is switched on |
| USB4000-FL Fluorescence Spectrometer | Ocean Optics | ||
| CC-3-UV Cosine Corrector for Emission Collection | Ocean Optics | ||
| 200μm diameter quartz fibre optic | Ocean Optics | ||
| SpectraSuite Spectroscopy Platform | Ocean Optics | ||
| 2300 EnSpire Multimode Plate Reader | Perkin Elmer | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | Acute toxicity, wear gloves when handling. |
| L-Glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | 142-47-2 (anhydrous) | |
| Pheochromocytoma rat adrenal medulla (PC12) cells | American Type Culture Collection | CRL-2522 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI1640) Media | Gibco | 11875-119 | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin | Gibco | 10082-147 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Horse Serum, New Zealand origin | Gibco | 16050-122 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-061 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| 100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140-050 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Retinal Muller (rMC1) cells | University of California, San Diego | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-118 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| 75 cm2 Flasks | BD Biosciences | B4-BE-353136 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | 25988-63-0 | Aliquot and store at -20 °C |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-134 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-049 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Gibco | 23017-015 | Aliquot and store at -20 °C |
| 1X Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| 165U Papain | Worthington | ||
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | W326305 | |
| Corning 96 well plates, clear bottom, black | Corning | CLS3603-48EA | |
| Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates Untreated; Well shape: Round; Sterile. | Costar | 07-200-103 | |
| Seesaw Rocker | Standard lab epuipment | ||
| Centrifuge | Standard lab epuipment | ||
| Neutral Density Filter Paper (0.3) | THORLABS | ||
| 442 nm Bandpass Filter | THORLABS | FL441.6-10 | |
| 550 nm Bandpass Filter | THORLABS | FB550-10 | |
| 670 nm Bandpass Filter | THORLABS | FB670-10 | |
| 810 nm Bandpass Filter | THORLABS | FB810-10e | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.1) | THORLABS | NE01B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.2) | THORLABS | NE02B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.3) | THORLABS | NE03B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.5) | THORLABS | NE05B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.6) | THORLABS | NE06B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (1.0) | THORLABS | NE10B |
References
- Gutterman, D. D. Mitochondria and reactive oxygen species an evolution in function. Circulation research. 97, 302-304 (2005).
- Camello-Almaraz, C., Gomez-Pinilla, P. J., Pozo, M. J., Camello, P. J. Mitochondrial reactive oxygen species and Ca2+ signaling. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 291, C1082-C1088 (2006).
- Kowaltowski, A. J., de Souza-Pinto, N. C., Castilho, R. F., Vercesi, A. E. Mitochondria and reactive oxygen species. Free Radical Biology and Medicine. 47, 333-343 (2009).
- Coyle, J. T., Puttfarcken, P. Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders. Science. 262, 689-695 (1993).
- Doble, A. The role of excitotoxicity in neurodegenerative disease: implications for therapy. Pharmacology & therapeutics. 81, 163-221 (1999).
- Hall, E. D. Antioxidant therapies for acute spinal cord injury. Neurotherapeutics. 8, 152-167 (2011).
- Jia, Z., et al. Oxidative stress in spinal cord injury and antioxidant-based intervention. Spinal Cord. 50, 264-274 (2012).
- Fitzgerald, M., et al. Red/near-infrared irradiation therapy for treatment of central nervous system injuries and disorders. Reviews in the Neurosciences. 24, 205-226 (2013).
- Rutar, M., Natoli, R., Albarracin, R., Valter, K., Provis, J. 670-nm light treatment reduces complement propagation following retinal degeneration. J Neuroinflammation. 9, 257 (2012).
- Eells, J. T., et al. Therapeutic photobiomodulation for methanol-induced retinal toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 3439-3444 (2003).
- Begum, R., Powner, M. B., Hudson, N., Hogg, C., Jeffery, G. Treatment with 670 nm light up regulates cytochrome C oxidase expression and reduces inflammation in an age-related macular degeneration model. PloS one. 8, e57828 (2013).
- Byrnes, K. R., et al. Light promotes regeneration and functional recovery and alters the immune response after spinal cord injury. Lasers in surgery and medicine. 36, 171-185 (2005).
- Liang, H. L., et al. Photobiomodulation partially rescues visual cortical neurons from cyanide-induced apoptosis. Neuroscience. 139, 639-649 (2006).
- Zivin, J. A., et al. Effectiveness and safety of transcranial laser therapy for acute ischemic stroke. Stroke. 40, 1359-1364 (2009).
- Lapchak, P. A. Transcranial near-infrared laser therapy applied to promote clinical recovery in acute and chronic neurodegenerative diseases. Expert review of medical devices. 9, 71-83 (2012).
- Chung, H., et al. The nuts and bolts of low-level laser (light) therapy. Annals of biomedical engineering. 40, 516-533 (2012).
- Wu, Q., et al. Low-Level Laser Therapy for Closed-Head Traumatic Brain Injury in Mice: Effect of Different Wavelengths. Lasers in surgery and medicine. 44, 218-226 (2012).
- Hashmi, J. T., et al. Role of low-level laser therapy in neurorehabilitation. PM&R. 2, S292-S305 (2010).
- Fitzgerald, M., et al. Metallothionein-IIA promotes neurite growth via the megalin receptor. Experimental Brain Research. 183, 171-180 (2007).
- Fitzgerald, M., et al. Near infrared light reduces oxidative stress and preserves function in CNS tissue vulnerable to secondary degeneration following partial transection of the optic nerve. Journal of neurotrauma. 27, 2107-2119 (2010).
- Ando, T., et al. Low-level laser therapy for spinal cord injury in rats: effects of polarization. Journal of biomedical. 18, 098002 (2013).
- Lanzafame, R. J., et al. Reciprocity of exposure time and irradiance on energy density during photoradiation on wound healing in a murine pressure ulcer model. Lasers in surgery and medicine. 39, 534-542 (2007).
- Castano, A. P., et al. Low-level laser therapy for zymosan induced arthritis in rats: Importance of illumination time. Lasers in surgery and medicine. 39, 543-550 (2007).
