Abstract
Rød / nær-infrarødt lys terapi (R / NIR-LT), levert av laser eller lysdiode (LED), forbedrer funksjonelle og morfologiske utfall i en rekke sentralnervesystemet skader i vivo, muligens ved å redusere oksidativt stress. Imidlertid har effekten av R / NIR-LT på oksidativt stress har vist seg å variere avhengig av bølgelengden eller intensiteten av bestrålingen. Studier som sammenligner behandlingsparametere mangler, på grunn av fravær av kommersielt tilgjengelige enheter som leverer flere bølgelengder eller intensitet, egnet for høy gjennomstrømning i vitro optimaliseringsstudier. Denne protokollen beskriver en teknikk for avgivelse av lys i et område av bølgelengder og intensiteter for å optimalisere terapeutiske doser som kreves for en gitt skademodell. Vi antok at en metode for å levere lys, i hvilken bølgelengde og intensitet parametrene kan lett bli endret, kan forenkle bestemmelse av en optimal dose av R / NIR-LT for reduksjon av reaktive oksygenarter(ROS) in vitro.
Ikke-koherent Xenon lys ble filtrert gjennom smalbåndsinterferensfiltre for å levere forskjellige bølgelengder (senterbølgelengder på 440, 550, 670 og 810nm) og fluences (8,5 x 10 -3 til 3,8 x 10 -1 J / cm 2) i lyset til dyrkede celler. Lys sendes ut fra apparaturen var kalibrert til å avgi terapeutisk relevante, like quantal doser av lys ved hver bølgelengde. Reaktive arter ble påvist i glutamat streket celler behandlet med lys, ved hjelp av DCFH-DA og H 2 O 2 sensitive fluorescerende fargestoffer.
Vi levert lys på en rekke fysiologisk og terapeutisk relevante bølgelengder og intensiteter, til dyrkede celler eksponert for glutamat som en modell av CNS skade. Mens fluences av R / NIR-LT anvendt i denne studien ikke utøve en virkning på ROS generert av de dyrkede celler, er metoden for å lette levering gjelder for andre systEMS inkludert isolerte mitokondrier eller flere fysiologisk relevante organotypic skive kultur modeller, og kan brukes til å vurdere effekter på en rekke utfallsmål oksidativ metabolisme.
Introduction
Reaktive oksygenforbindelser (ROS) er nødvendig for en rekke signaltransduksjonsveiene og normale reaksjoner av cellenes stoffskifte, inkludert de av nevro en. Men når endogene antioksidant mekanismen er ikke i stand til å styre produksjonen av ROS, kan cellene bukke under for oksidativt stress 2,3. Etter skade på sentralnervesystemet, er de tilhørende økning i nærvær av ROS og oksidativt stress antatt å spille en betydelig rolle i progresjonen av skaden 4,5. Til tross for omfattende rekke strategier for å dempe oksidativt stress som er vurdert, er det i dag ingen fullstendig effektive, er klinisk relevante antioksidant strategier for å dempe ROS produksjon og tilhørende oksidativt stress i klinisk bruk følgende neurotrauma 6. Derfor demping av oksidativt stress er fortsatt et viktig mål for terapeutisk intervensjon 7.
Forbedringer følgering R / NIR-LT har blitt rapportert i et bredt spekter av skader og sykdommer, inkludert reduksjoner i cardial infarktstørrelsen, nyre- og lever komplikasjoner under diabetes, retinal degenerasjon, CNS skade og hjerneslag 8, kanskje ved å redusere oksidativt stress. Med særlig hensyn til CNS skade, har prekliniske studier av effekten av 670nm lys vist gode effekter i modeller av retinal degenerasjon 9-11, ryggmargsskade 12, neuronal død 13. Kliniske studier har blitt gjennomført for tørr aldersrelatert makuladegenerasjon, og er for tiden i gang for hjerneslag 14, men resultatene av disse studiene ikke synes lovende, kanskje på grunn av en feil å ansette effektiv behandling Parametere 15. Som sådan, R / NIR-LT har ikke vært i omfattende bruk som en del av vanlig klinisk praksis i neurotrauma, til tross for å være en enkel å administrere, non-invasiv og relativt billig behandling. Barrierer for klinisk oversettelse inkluderer mangel på en cltidlig forstått virkningsmekanisme og fravær av en standardisert effektiv behandlingsprotokoll 16,17. Aktuell litteratur om lysterapi avslører en mengde variasjon i behandling parametere med hensyn til bestrålingskilder (LED eller laser), bølgelengde (f.eks, 630, 670, 780, 810, 830, 880, 904nm), Total dose (joule av bestråling / arealenhet), varighet (eksponeringstiden), timing (før eller etter fornærmelse), behandling frekvens og modus for levering (puls eller kontinuerlig) 8. Variasjonen i behandlingsparametere mellom studier gjør sammenligning vanskelig og har bidratt til skepsis til effekt 16.
Derfor er optimalisering av R / NIR-LT klart nødvendig, med cellekultursystemer i stand til å tilveiebringe den high-throughput screening mekanisme nødvendig å sammenligne de flere variable. Men det er få kommersielt tilgjengelige belysningssystemer som kan gi tilstrekkelig fleksibilitet og kontroll over wavelength og intensitet for å utføre slike optimalisering eksperimenter. Kommersielt tilgjengelige LED-enheter er generelt ikke i stand til å levere flere bølgelengder eller intensitet, noe som resulterer i undersøkere som anvender flere LED-enheter fra forskjellige produsenter, som kan variere ikke bare i intensitet, men også spekteret for bølgelengden av lys emittert. Vi har løst dette problemet ved å anvende en bredbånds Xenon lyskilde filtrert gjennom smalbånds interferensfiltre, for derved å generere et område av bølgelengder og fluences av lys, slik at nær, nøyaktig styring av parameterne til R / NIR-LT.
Det er viktig å merke seg at den terapeutiske dosen av behandlingen er definert av antall fotoner som vekselvirker med photoacceptor (kromofor), som, i tilfelle av R / NIR-LT er postulert å være cytokrom c oksidase (COX) 18. Foton energi levert varierer med bølgelengde; betyr like doser av energi ved forskjellige bølgelengder vil være comettertraktet av forskjellige antall fotoner. Derfor ble det lyset som sendes ut fra enheten kalibrert til å avgi et tilsvarende antall fotoner for hvert av de valgte bølgelengder for å bli testet. Vi har utviklet et system som kan brukes til å levere R / NIR-LT i et område av bølgelengder og intensiteter til celler in vitro og viste evnen til å måle virkningene av den leverte R / NIR-LT på ROS produksjonen i celler utsatt for glutamat stress.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Optisk Kalibrering: Måling Light Output
- For å forberede lys leveranseapparat, kobler du en bredbånds lyskilde (f.eks Xenon eller wolframlampe) til en passende strømforsyning. Plasser en kollimeringslinse foran lyskilden for å produsere en kollimert lysstråle. Passerer lyset gjennom et flytende varme filter for å fjerne mesteparten av varmen fra lysstrålen. Avhengig av programmet, fokusere kollimert strålen på til inngangen blenderåpning på en flytende lys guide, som gir mer fleksibel levering av lyset (f.eks., I en inkubator).
- I den andre enden av den flytende lysleder, posisjonere en andre kollimasjonslinse og deretter en holder for forstyrrelser og nøytrale tetthetsfilter. Kontroller at dette arrangementet frembringer en jevnt belyst flekk av lys av den ønskede bølgebånd og intensitet.
Merk: Avstanden mellom enden av lyset guide og prøveplanet må kanskje variere avhengig avdet området som skal belyses, men husk at etter hvert som avstanden fra enden av lyslederen øker, vil lysintensiteten avta. I den foreliggende undersøkelse, er denne avstand på 14 cm, og frembringer en stråletverrsnitt som jevnt belyser en 3x3 brønn på en 96-brønners plate. - Sikre at strølys fra lampen og tilhørende optiske komponenter ikke er i stand til å nå prøven.
- Skru på vannet kjøler for flytende varmefilter og sikre at det er utveksling av vann gjennom filteret jakke. Slå på lampen strømkilde og vente i minst fem minutter for bredbånd lyskilde for å stabilisere seg. Merk: Bruken av vannkjøleren er nødvendig for å hindre overoppvarming av apparatet.
- Velg en smal interferens filter (vanligvis beskrevet av sin sentrum bølgelengde, peak transmisjon og full bredde ved halv maksimum (FWHM) båndbredde) for å generere ønsket bølgelengdeområdet belysning. Merk: Den smalinterferensfiltre som brukes i denne studien var 442 nm, 550 nm, 671 nm og 810 nm.
- Måle lyset som produseres av lampen på planet hvor prøven skal plasseres under behandlingen. Måle lys ved hjelp av en kalibrert irradians probe (cosinus samler) koblet til en passende spektroradiometer, ved hjelp av anstendighet programvaren i henhold til produsentens instruksjoner.
- Bruk nøytral tetthet filter for å justere intensiteten på lyset til ønsket utgang er oppnådd. Merk: I den foreliggende undersøkelse, er intensiteten av lys som føres av hvert interferensfilter innstilles for å gi en lik quantal utgang på hver av de fire behandlingsbølgebånd. Det er viktig å kontrollere kalibreringen regelmessig, som lampen utgang kan endres.
Merk: Ved å følge den er satt opp av anordningen, er cellene klare for å bli belyst Figur 1 er en representasjon av lyset leveringsapparat anvendt i denne studien..
Figur 1. Bilde av lyset leveranseapparat. Illustrated er lyset strømkilde, xenon lampe med boliger, kollimasjonslinse, vannfilter, inngang blenderåpning, flytende lys guide, andre kollimasjonslinse, filterholder, behandling ramme og matt svart kort. Legg merke til at de smal bølgelengde og intensitet filtre ikke er vist.
2. Cell Forberedelse
- Den beskrevne R / NIR-LT leveringsmetode kan anvendes på en hvilken som helst celletype eller in vitro modellsystem; som sådan følgende beskrivelser av cellekultur er generelle, ved hjelp av veletablerte teknikker til kultur feokromocytom (PC12), Müller (rMC1) og primær blandede netthinnens celler.
- Før celle seeding for lysbehandling og oksidativt stress analysen, kultur udødelig celler i deres respektive vekstmedier som inneholder riktige kosttilskudd (f.eks., FBS, antibiotika) i T75 flasks inntil 70-80% konfluent.
- Løsne immortaliserte celler fra T75-kolber ved bruk av fremgangsmåten egnet for den celletype som skal testes, f.eks., Trypsin. Hvis det er nødvendig, før du fortsetter med seeding av celler i 96-godt analyseplatene, frakk analysen plate brønner med 10 ug / ml poly-L-lysin for 1t (f.eks., For PC12-celler) eller 10 mikrogram / ml poly-L-lysin for 1H etterfulgt av en O / N inkubasjon med 10 ug / ml laminin (f.eks., for blandede netthinnens celler).
- Sentrifuger cellene for å samle inn etter behov (f.eks., 3 min ved 405 xg i PC12-celler, eller 10 minutter ved 218 xg i rMC1 celler), fjern supernatanten og resuspender i 8 ml riktige cellekulturmedier.
- Hvis blandet netthinnens celler skal brukes, forberede fra P0-5 neonatal rotteunger ved enzymatisk fordøyelse (papain) i henhold til etablerte prosedyrer 19
- Tell antall levedyktige celler med unntak av 0,4% (w / v) trypanblått-farvestoff, ved hjelp av et hemocytometer.
- Juster celletetthet such at cellene vil være ca 70-80% konfluent etter 24 eller 48t i kultur. (For PC12-celler seeding tetthet er 4,0 x 10 5 levedyktige celler / ml, for rMC1 celler, er det 2,5 x 10 5 levedyktige celler / ml, og for blandet netthinneceller er 8 x 10 5 levedyktige celler / ml). Etter tilsetning av celler til enten klare eller svarte 96-brønns plater (anvendt for H 2 O 2 eller DCFH-DA assay respektivt), i 100 ul av passende vekstmedier, tillate platen å sitte på en flat overflate ved 37 ° C, 5 % CO 2 (eller hva forholdene er egnet til den spesifikke celletype) i minst 24 timer for å tillate celle tilslutning.
- Kultur cellene i vekstmedier i de aktuelle 96-brønners brett til de er 70-80% sammenflytende (24h for PC12 og rMC1 celler, 48t for blandede netthinnens celler).
3. Legge Glutamat Stressor til Cells
- Forberede L-glutaminsyre mononatrium- salthydrat stressor konsentrasjoner av 0-10mM i passende fullt vokseth kulturmedier.
- Fjern media fra cellene og forsiktig vaske cellene tre ganger med PBS (PC12) eller HBSS (rMC1 og blandede netthinnens celler). Etter vaskinger, tilsett glutamat-inneholdende medium til et totalt volum på 100 ul / brønn.
4. Først Doser av lysbehandling
- Umiddelbart etter tilsetning av glutamat eller stressor av valget, utsette celler til lysbehandling på de ønskede bølgelengder og intensiteter ved å plassere under forberedt lys leveranseapparat. Vær sikker på å endre quantal utgang av lysstrålen ved hjelp av de etablerte kombinasjoner av nøytral tetthet filter avhengig av bølgelengden som blir administrert.
Merk: I dagens eksperimenter, utsette celler til lysbehandling for 3 min opprettholde temperaturen ved å hvile de 96 brønners plater på en 37 o C varmepute. Behandlingstiden kan varieres etter behov.- Legg en matt svart kort under cellene for å hindre lysreflekterende til tilstøtende brønner i 96-well brettet utpekt for andre behandlingsparametere.
- Dersom behandlingen er ønsket for lengre tidsperioder, tilsett 25 mM Hepes-buffer for å opprettholde pH-verdien i cellekulturmedier, eller ideelt sett, å plassere apparatet og behandlings platene i en inkubator med CO2 konsentrasjon regulert til 5% CO2, eller betingelser som er optimale for den bestemte celletype.
- Etter gjennomføring av lysbehandling, plasserer cellene på et plant underlag og inkuberes ved 37 ° C og 5% CO 2 (eller hva forholdene er optimale for den celletype) for 24 timer.
Merk: Ytterligere doser av R / NIR-LT kan gis som beskrevet ovenfor, som ønsket.
5. Endelig Dosering av lysbehandling og Påvisning av ROS
- Før du utfører den siste runden av lysbehandling, forberede reagenser som skal brukes til ROS-deteksjon. Forbered 50 mM citrate buffer (pH 6,0), Triton X100, og H 2 O 2 deteksjonsreagens jobber-løsning (1: 2: 97-forhold på 10 mM H 2 O 2 deteksjonsreagensen stamløsning; 10 U / ml pepperrotperoksidase; 50 mM natriumcitrat (pH 6,0)). Forberede DCFH-DA på en endelig konsentrasjon på 100 ^ M i passende media.
Merk: DCFH-DA reagens for PC12-celler er i RPMI media, DCFH-DA reagens for rMC1 celler er i DMEM media. Merk at kommersielt tilgjengelige påvisningsreagenser har differensial sensitiviteter til spesifikke ROS og reagenser bør velges nøye for å gi de opplysninger som er ønsket for en individuell søknad. - Administrere lysbehandling til cellene, som beskrevet i trinn 4.1-4.1.2. Sørg for at cellene blir behandlet med de ønskede fluences / bølgelengder av lys.
- Umiddelbart etter lysbehandling, fjerne glutamat-holdige media og vask to ganger med passende bufferløsning (for PC12 celler, PBS brukes og for rMC1 celler, er HBSS brukes). Utføre ROS-analyser på cellene som følger:
- H to O to CO2 i 15 minutter. Tilsett 50 ul H 2 O 2 deteksjon arbeidsløsning og inkuber i 30 min ved RT. Måle fluorescensen ved anvendelse av en plateleser med en eksitasjonsbølgelengde på 530nm og en emisjonsbølgelengde på 480nm.
- DCF-analyse: tilsett 100 ul av 100 uM oppløsning av DCFH-DA til hver brønn og inkuberes i 30 min ved 37 ° C og 5% CO2. Fjern mediet inneholdende 100 pM DCFH-DA og vask med passende bufferoppløsning (som beskrevet ovenfor) to ganger. Legg 90 pl bufferoppløsning og 10 ul Triton X100 til hver av brønnene og rist på en orbital-rystemaskin i 30 sekunder før 15 min inkubasjon ved 37 ° C. Mål DCF avledet fluorescens ved anvendelse av en plateleser med en eksitasjonsbølgelengde på 480nm og en emisjons Wavellength av 530nm.
- Express ROS-verdier i forhold til proteinkonsentrasjonen av celler som er igjen i brønnene, ved hjelp av en kolorimetrisk sett for kvantifisering av protein-konsentrasjon i henhold til produsentens instruksjoner, med referanse til en standardkurve for å beregne mg protein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utgangen av lys levert ved en bølgelengde på 670nm ble kalibrert ved bruk av nøytral tetthet filter for å bestråle celler med en rekke fluences som omfatter en dose av 670nm lys som tidligere vist seg å være fordelaktig in vivo (0,3 J / cm2) 20. Ettersom antallet nøytral tetthet filter foran lyskilden økt, intensiteten (W / m2) ble redusert, slik at mindre lys til å passere til målområdet. Tabell 1 presenterer data kalibrerings 670nm lyset generert fra lyskilden utstyrt med et bølgelengdefilter og omfatter antallet ND filter som benyttes og intensiteten av lyset som genereres som et resultat, i det beskrevne avstander fra lysutbytte. Fluence, eller dosen av 670nm lys (J / cm2), ble beregnet ut fra ligningen: [Dose (J / cm2) = (Lysintensitet (W / m2) / 10000) x tid (er)], der tidspunktet for behandlingen var 180s.
| Antall ND filter | Avstand fra lysmengde (cm) | Intensitet (W / m ^ 2) | Dose (J / cm ^ 2) |
| 0 | 10.5 | 20.11 | 0.38 |
| 0 | 14 | 10.55 | 0,19 |
| 1 | 14 | 4,91 | 0,075 |
| 2 | 14 | 2.28 | 0.041 |
| 3 | 14 | 1,03 | 0,018 |
| 4 | 14 | 0,47 | 0,0085 |
| 5 | 14 | 0,21 | 0.0038 |
| 6 | 14 | 0.094 | 0,00169 |
| 7 | 14 | 0,045 | 0,00081 |
| 8 | 14 | 0.021 | 0.000378 |
| 9 | 14 | 0,013 | 0.000234 |
Tabell 1: Effekt av lyset leveringsapparat utstyrt med 670nm bølgelengdefilter .Number av ND filter refererer til antall nøytral tetthet filter montert på forsiden av lyskildens effekt. Intensitet (W / m 2) refererer til intensiteten av lyset som rapportert av the anstendighet programvare. Fluence, eller dosen ble beregnet ved hjelp av ligningen [Dose (J / cm2) = (Lysintensitet (W / m2) / 10000) x tid (er)], hvor eksponeringstiden var 180s og avstanden fra den lysmengde var 10,5 eller 14 cm.
To klinisk relevante quantal fluences av lys ble valgt for å undersøke ulike effekter av R / NIR-LT bølgelengde på produksjon av ROS. En dose som kan nå CNS traktene etter overføring gjennom overliggende vev ved hjelp av LED-enheter (dvs. 1,78 W / m 2 ved 670nm) 20 stilles til 0,03 J / cm 2 etter 3 min behandling, eller 4,9 x 10 14 fotoner / cm 2 / s. Lyskilden er utstyrt med filtre for å resultere i avgivelse av 442, 550, 670 eller 830nm ble så kalibrert ved å bruke kombinasjoner av nøytral tetthet filter for å avgi like quantal utganger (fotoner) for hver bølgelengde i motsetning til energiutgangene (J / cm2), og doseringene (J / cm2) og intensities i W / m 2 beregnet (tabell 2a). En ytterligere høyere dose som var innenfor de anbefalte retningslinjer for å stimulere cellulær aktivitet 21 ble også anvendt (1,29 x 10 15 fotoner / cm 2 / s), og kalibrering utført for hver bølgelengde (tabell 2b).
| Bølgelengde (λ) | Dose (J / cm ^ 2) | Intensitet (W / m ^ 2) | Emission (Fotoner / cm ^ 2 / s) |
| 442 | 0,057 | 3.21 | 4,8 x 10 ^ 14 |
| 550 | 0,051 | 2.87 | 5,0 x 10 ^ 14 |
| 670 | 0.032 | 1,78 | 4.9 x 10 ^ 14 |
| 830 | 0,018 | 1.01 | 4,9 x10 ^ 14 |
Tabell 2:. Kalibrering av intensiteten av dosen som leveres av et likt antall fotoner av lys ved forskjellige bølgelengder Intensitet (W / m2), dosering for en 3 minutters behandling (J / cm2) og emisjon (fotoner / cm 2 / s) Når utgangen fra xenon lysemitterende 442, 550, 670 og 830nm er kalibrert til å avgi A) 4,9 x 10 14 fotoner / cm 2 / s eller b) 1,3 x 10 15 fotoner / cm 2 / s i en avstand på 14 cm fra lysutbytte.
For å vurdere om lyset leveres av anordningen var toksisk for celler ved de doser som brukes, vurderte vi de gjenværende proteininnholdet i PC12-cellekulturbrønnene etter at ROS-analyser, ved anvendelse av en kolorimetrisk proteinanalyse. Det var ingen signifikant tap av protein ved en hvilken som helst av de høyere utgangs doseringer av lyset (P> 0,05), noe som indikerer at dosen av lys levert ikke var forårsaker celledød (Figure 2) og er hensiktsmessig å bruke for vurdering av oksidativ metabolisme.
Figur 2: Effekt av varierende doser av lys på den totale proteinkonsentrasjon som er igjen i dyrkningsbrønner følgende R / NIR-LT og ROS-analysen. Histogram-linjene er gjennomsnitt ± SEM proteinkonsentrasjoner i PC12-cellekulturbrønner, 6 replikater / konsentrasjon, Forsøkene ble gjentatt 3 ganger. Det var ingen statistisk signifikante forskjeller mellom kontroll og noen av behandlingsgruppene som bestemt ved analyse av varians (ANOVA), p> 0,05.
Vi først vurderes virkningene av 670nm lys, levert på fluences strekker 0,0085 til 0,38 J / cm 2, som et eksempel bølgelengde for å vurdere hensiktsmessigheten av lyset leveringsanordningen. Ingen signifikant effect av 670nm lys ble observert på noen av de fluences testet ved vurdering enten H 2 O 2 eller DCF fluorescens i PC12, rMC1 eller blandede netthinnens celler stresset med glutamat (figur 3, P> 0,05). Tilsvarende var det ingen signifikante effekter av varierende bølgelengder av R / NIR-LT leveres på 4,9 x 10 14 fotoner / cm 2 / s eller 1,3 x 10 15 fotoner / cm 2 / s på ROS produksjon, ved vurdering av H 2 O 2 eller DCF fluorescens (P> 0,05, data ikke vist). Vår evne til å oppdage endringer i reaktive arter er bekreftet av en økning i fluorescens av DCFH-DA reaktive fargestoff ved 13.44 ± 0.67 mM glutamat til 22.10 ± 2.10 på 10mm glutamat. Mens våre data ikke avsløre positive effektene av R / NIR-LT gitt ved bruk vårt lys leveranseapparat på ROS produksjon i den valgte modellen system, heller ikke var det negative effekter som cellene ikke ble kompromittert, angitt med vedvarende proteininnhold i kulturenbrønner følgende lysterapi (figur 2). Som sådan gir den beskrevne fremgangsmåte er en protokoll for behandling av celler eller mitokondrier med en definert dose av fotoner i et område av bølgelengder, og kan brukes til å vurdere høyere doser og alternative effektmål, som kan muliggjøre optimalisering av R / NIR-LT-parametere.
Figur 3: Kvantifisering av H 2 O 2 (AC), og DCF (DF) fluorescens i PC12 (A, D), rMC1 (B, E), eller blandet retinal celle (C, F) kulturer i nærvær av 10 mM glutamat stressfaktor, Følgende 670nm bestrålingsterapi ved fluence doser 0 til 0,38 J / cm2. Histogram søylene representerer midlere vilkår fluorescensenheter / ug protein ± SEM. Det var ingen statistisk signifikantforskjeller mellom kontroll og noen av behandlingsgruppene som bestemt ved ANOVA, p> 0,05, 6 replikater per gruppe, ble forsøkene gjentatt 3 ganger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har med hell tilpasset en presis og kalibrert lys leveringssystem for å tilveiebringe en mekanisme for studie av optimalisering av R / NIR-LT in vitro. Bølgelengde og intensitet parametere av R / NIR-LT er i stand til å manipuleres nøyaktig og effektivt ved hjelp av dette systemet. Vi har fastslått at lette behandlingen av cellene ikke føre til celledød, selv om ROS ble ikke redusert ved de bølgelengder og doser levert i de celletyper som ble testet. Maksimumsintensiteten oppnås ved dagens system ved 670nm (20.11W / m 2) er i overkant av tidligere publiserte tiltak av pene av bestråling inn i rottehjerne, hvor 1,17 W / m 2 nådde ventral overflaten av synsnerven og 0.3W / m 2 nådd den ventrale overflaten av hjernen tilfelle. Ved levering i 30 minutter, den dose som mottas av celler av den optiske nerven in vivo er derfor 0,054 til 0,31 J / cm2. Dosene av 670nm lys levert i denne studien (opp til 0.38J / cm 2) derfor omfatte de som er mottatt av celler i våre tidligere in vivo-studier.
Den mest aksepterte teorien om R / NIR-LT effekt er at av en photoacceptor basert system 18, derfor er det viktig å sikre at celler behandlet med varierende bølgelengder får like quantal fluences av lys (fotoner / cm 2 / s) 8. I tillegg må eksponeringstiden som brukes til å levere en bestemt innflytelse av lys holdes konsekvent mellom behandlingene, med bare intensiteten av lyset endres for å øke og redusere total fluence over tid. Tidligere studier har vist at endring av eksponeringstiden for å levere like fluences resultater i forskjeller i utfallsmål, og kan fungere som en problemfaktor, og hindre identifisering av de optimale bølgelengde / Fluence parametere som kreves for en bestemt skade modell 22,23. Som sådan, anbefaler vi nøye kalibrering av doseringved hver bølgelengde som testes, for å sikre anvendelige optimalisering av R / NIR-LT.
Den beskrevne teknikken tillater avgivelse av lys til et utvalg av in vitro modellsystemer inkludert organotypiske skive kulturer, noe som kan resultere i mer meningsfulle resultater på grunn av konservering av cellulær arkitektur og komplekse inter-cellulære interaksjoner. Variasjoner på skademodellen kan kreve forskjeller i parametere behandling av R / NIR-LT. Denne teknikken er begrenset av den maksimale utgangseffekt kan oppnås med det beskrevne instrumentering. Høyere strømutganger kan være nødvendig for noen in vitro og mest in vivo-applikasjoner. Ved høyere effekter av lys er nødvendig, kan apparatet endres for å øke intensiteten av lyset som når prøvene. Forkorting av avstanden mellom de lyse terminering og målceller vil øke intensiteten av lyset som når tallerkenen. Alternativt kan lyset reflekteres av et speil og på cellene som opposed å bli filtrert gjennom et flytende lys guide, men alternativ bølgelengde og nøytral tetthet filter vil være nødvendig for å oppnå dette. Høyere effekt ved hjelp av en mer kraftig lyskilde vil også være nødvendig hvis metoden ble å være tilrettelagt for levering av R / NIR-LT i in vivo-modeller av CNS skade, på grunn av de økte doser som kreves for å sikre effektiv pene av bestråling 8,20 .
Som konklusjon, beskriver denne studien en ny fremgangsmåte for å lette levering som gir et middel for effektivt å endre intensitet og bølgelengde parametere av lys i R / NIR-LT-studier. Denne metoden vil være nyttig ved optimalisering av R / NIR-LT anvendelse av et utvalg av effektmål og in vitro skademodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OxiSelect Intracellular ROS Assay Kit (Green Fluorescence) | Cell Biolabs | STA-342 | |
| Amplex UltraRed Reagent | Molecular Probes | A36006 | |
| 300 Watt Xenon Arc Lamp | Newport Corporation | 6258 | Very intense light source, do not look directly into the lamp. Ensure there is sufficient cooling to the lamp whilst it is switched on |
| USB4000-FL Fluorescence Spectrometer | Ocean Optics | ||
| CC-3-UV Cosine Corrector for Emission Collection | Ocean Optics | ||
| 200μm diameter quartz fibre optic | Ocean Optics | ||
| SpectraSuite Spectroscopy Platform | Ocean Optics | ||
| 2300 EnSpire Multimode Plate Reader | Perkin Elmer | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | Acute toxicity, wear gloves when handling. |
| L-Glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | 142-47-2 (anhydrous) | |
| Pheochromocytoma rat adrenal medulla (PC12) cells | American Type Culture Collection | CRL-2522 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI1640) Media | Gibco | 11875-119 | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin | Gibco | 10082-147 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Horse Serum, New Zealand origin | Gibco | 16050-122 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-061 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| 100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140-050 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Retinal Muller (rMC1) cells | University of California, San Diego | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-118 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| 75 cm2 Flasks | BD Biosciences | B4-BE-353136 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | 25988-63-0 | Aliquot and store at -20 °C |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-134 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-049 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Gibco | 23017-015 | Aliquot and store at -20 °C |
| 1X Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| 165U Papain | Worthington | ||
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | W326305 | |
| Corning 96 well plates, clear bottom, black | Corning | CLS3603-48EA | |
| Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates Untreated; Well shape: Round; Sterile. | Costar | 07-200-103 | |
| Seesaw Rocker | Standard lab epuipment | ||
| Centrifuge | Standard lab epuipment | ||
| Neutral Density Filter Paper (0.3) | THORLABS | ||
| 442 nm Bandpass Filter | THORLABS | FL441.6-10 | |
| 550 nm Bandpass Filter | THORLABS | FB550-10 | |
| 670 nm Bandpass Filter | THORLABS | FB670-10 | |
| 810 nm Bandpass Filter | THORLABS | FB810-10e | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.1) | THORLABS | NE01B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.2) | THORLABS | NE02B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.3) | THORLABS | NE03B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.5) | THORLABS | NE05B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.6) | THORLABS | NE06B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (1.0) | THORLABS | NE10B |
References
- Gutterman, D. D. Mitochondria and reactive oxygen species an evolution in function. Circulation research. 97, 302-304 (2005).
- Camello-Almaraz, C., Gomez-Pinilla, P. J., Pozo, M. J., Camello, P. J. Mitochondrial reactive oxygen species and Ca2+ signaling. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 291, C1082-C1088 (2006).
- Kowaltowski, A. J., de Souza-Pinto, N. C., Castilho, R. F., Vercesi, A. E. Mitochondria and reactive oxygen species. Free Radical Biology and Medicine. 47, 333-343 (2009).
- Coyle, J. T., Puttfarcken, P. Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders. Science. 262, 689-695 (1993).
- Doble, A. The role of excitotoxicity in neurodegenerative disease: implications for therapy. Pharmacology & therapeutics. 81, 163-221 (1999).
- Hall, E. D. Antioxidant therapies for acute spinal cord injury. Neurotherapeutics. 8, 152-167 (2011).
- Jia, Z., et al. Oxidative stress in spinal cord injury and antioxidant-based intervention. Spinal Cord. 50, 264-274 (2012).
- Fitzgerald, M., et al. Red/near-infrared irradiation therapy for treatment of central nervous system injuries and disorders. Reviews in the Neurosciences. 24, 205-226 (2013).
- Rutar, M., Natoli, R., Albarracin, R., Valter, K., Provis, J. 670-nm light treatment reduces complement propagation following retinal degeneration. J Neuroinflammation. 9, 257 (2012).
- Eells, J. T., et al. Therapeutic photobiomodulation for methanol-induced retinal toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 3439-3444 (2003).
- Begum, R., Powner, M. B., Hudson, N., Hogg, C., Jeffery, G. Treatment with 670 nm light up regulates cytochrome C oxidase expression and reduces inflammation in an age-related macular degeneration model. PloS one. 8, e57828 (2013).
- Byrnes, K. R., et al. Light promotes regeneration and functional recovery and alters the immune response after spinal cord injury. Lasers in surgery and medicine. 36, 171-185 (2005).
- Liang, H. L., et al. Photobiomodulation partially rescues visual cortical neurons from cyanide-induced apoptosis. Neuroscience. 139, 639-649 (2006).
- Zivin, J. A., et al. Effectiveness and safety of transcranial laser therapy for acute ischemic stroke. Stroke. 40, 1359-1364 (2009).
- Lapchak, P. A. Transcranial near-infrared laser therapy applied to promote clinical recovery in acute and chronic neurodegenerative diseases. Expert review of medical devices. 9, 71-83 (2012).
- Chung, H., et al. The nuts and bolts of low-level laser (light) therapy. Annals of biomedical engineering. 40, 516-533 (2012).
- Wu, Q., et al. Low-Level Laser Therapy for Closed-Head Traumatic Brain Injury in Mice: Effect of Different Wavelengths. Lasers in surgery and medicine. 44, 218-226 (2012).
- Hashmi, J. T., et al. Role of low-level laser therapy in neurorehabilitation. PM&R. 2, S292-S305 (2010).
- Fitzgerald, M., et al. Metallothionein-IIA promotes neurite growth via the megalin receptor. Experimental Brain Research. 183, 171-180 (2007).
- Fitzgerald, M., et al. Near infrared light reduces oxidative stress and preserves function in CNS tissue vulnerable to secondary degeneration following partial transection of the optic nerve. Journal of neurotrauma. 27, 2107-2119 (2010).
- Ando, T., et al. Low-level laser therapy for spinal cord injury in rats: effects of polarization. Journal of biomedical. 18, 098002 (2013).
- Lanzafame, R. J., et al. Reciprocity of exposure time and irradiance on energy density during photoradiation on wound healing in a murine pressure ulcer model. Lasers in surgery and medicine. 39, 534-542 (2007).
- Castano, A. P., et al. Low-level laser therapy for zymosan induced arthritis in rats: Importance of illumination time. Lasers in surgery and medicine. 39, 543-550 (2007).
