Abstract
Lazer veya ışık yayan diyot (LED) tarafından teslim Kırmızı / yakın-kızılötesi ışık tedavisi (R / NIR-LT), muhtemelen oksidatif stresi azaltarak in vivo merkezi sinir sistemi yaralanmaları, bir dizi fonksiyonel ve morfolojik sonuçlar geliştirir. Bununla birlikte, oksidatif stres R / NIR LT etkileri dalga boyu ya da ışının yoğunluğuna bağlı olarak değişecektir gösterilmiştir. Tedavi parametreleri karşılaştıran çalışmalar nedeniyle vitro optimizasyon çalışmalarında koymak yoluyla yüksek uygun çoklu dalga boylarını veya yoğunluklarını, teslim piyasada mevcut cihazların olmaması nedeniyle, eksiktir. Bu protokol belirli bir yaralanma modeli için gerekli olan terapötik dozları optimize etmek için dalga boyu ve yoğunluk aralığında ışık iletimi için bir yöntem açıklanır. Bu dalga boyu ve yoğunluk parametreleri kolayca değiştirilebilir hangi ışık sağlamaya yarayan bir yöntem olup, reaktif oksijen türleri azaltmak için Ar / NIR LT optimal dozunun belirlenmesini kolaylaştırmak ileri sürdülerIn vitro (ROS).
Düzensiz Xenon lambası değişen dalga boylarında (440, 550, 670 merkezi dalga boylarının ve 810nm) ve akızamanları sağlamak için dar bantlı girişim filtreleri içinden süzülmüş (8.5 x 10 -3 3.8 x 10 -1 J / cm2) ışık kültür hücreleri. Aygıtından Işık çıkışı, her dalga boyunda ışık, terapötik anlamda ilgili, eşit quantal doz yayılmasını sağlamak için kalibre edilmiştir. Glutamat DCFH-DA ve H2O 2 duyarlı fluoresan boyalar kullanılarak ışık ile muamele edilmiş hücreler stresli reaktif türleri tespit edilmiştir.
Başarıyla MSS yaralanması modeli olarak glutamata maruz kültür hücreleri, ilgili dalga boylarında ve yoğunlukları, fizyolojik ve terapötik bir aralığında ışık vermiştir. Kültürlenmiş hücreler tarafından üretilen ROS üzerinde bir etki gösterebilir değil mevcut çalışmada kullanılan R / NIR LT akıcılıklarda birlikte, ışık uygulama yöntemi için diğer syst için geçerlidirems daha fizyolojik mitokondri veya ilgili organotipik dilim kültür modelleri izole dahil, ve oksidatif metabolizma sonucu önlemlerinin bir dizi üzerindeki etkilerini değerlendirmek için kullanılabilir.
Introduction
Reaktif oksijen türleri (ROS) sinyal transdüksiyon yollar ve nöro-1 de dahil olmak üzere, hücresel metabolizmanın normal reaksiyonlar, bir dizi gereklidir. Endojen antioksidan mekanizma ROS üretimini kontrol edemiyoruz Ancak, hücreler oksidatif strese 2,3 yenik düşebilir. MSS yaralanma sonrasında, ROS ve oksidatif stres varlığında ilişkili artışlar hasar 4,5 ilerlemesinde önemli bir rol oynadığı düşünülmektedir. Değerlendirilmiştir oksidatif stres zayıflatmaya yönelik stratejiler geniş olmasına rağmen, nörotravma 6 aşağıdaki klinik kullanımda ROS üretimini ve ilişkili oksidatif stresi zayıflatmaya yönelik hiçbir tamamen etkili, klinik açıdan önemli bir anti-oksidan stratejileri şu anda. Bu nedenle oksidatif stres zayıflama terapötik müdahale 7 için önemli bir hedef olmaya devam etmektedir.
İyileştirmeler takiping R / NIR LT yaralanmalar ve belki de oksidatif stres azaltarak miyokard enfarktüs boyutu, diyabet renal ve hepatik komplikasyonlar, retinal dejenerasyon, merkezi sinir sistemi hasarı ve inme 8 azalmalar da dahil olmak üzere geniş bir hastalık aralığında bildirilmiştir. MSS yaralanması, özellikle ilgili olarak, 670nm ışık etkinliğinin klinik öncesi çalışmalar, retinal dejenerasyon 9-11, omurilik yaralanması, 12 nöronal ölüm 13 modellerinde iyi etki gözlemlenmemiştir. Klinik çalışmalar, ancak bu çalışmaların sonuçları 15 parametreleri etkin tedavi istihdam belki de bir arıza, umut verici görünmüyor, bağlı makula dejeneresansı kuru yaş için yapılan ve inme 14 şu anda devam etmektedir edilmiştir. Gibi, R / NIR-LT yaygın bir non-invaziv, yönetmek kolay ve nispeten ucuz bir tedavi olmasına rağmen, nörotravmada normal klinik pratikte bir parçası olarak kabul edilmemiştir. Klinik çeviri Engeller bir cl eksikliği,Erken bir standart etkili tedavi protokolü 16,17 eylem ve yokluğu mekanizmasını anladım. Işık tedavisi ile ilgili güncel literatür ışınlama kaynaklarına göre (LED veya lazer), dalga boyu (örneğin, 630, 670, 780, 810, 830, 880, 904nm), ışınlama toplam dozu (joule / tedavi parametrelerinin varyasyon bir bolluk ortaya birim alan), süresi (maruz kalma süresi), zamanlama (öncesi veya sonrası hakaret), tedavi sıklığı ve doğum şekli () darbeli veya sürekli 8. çalışmalar arasında tedavi parametreleri değişkenlik karşılaştırma zorlaştırır ve etkinliği 16 ilişkin şüphecilik katkıda bulunmuştur.
Bu nedenle, R / NIR-LT optimizasyonu açıkça birden değişkenleri karşılaştırmak için gerekli yüksek verimli tarama mekanizması sağlamak mümkün hücre kültürü sistemleri, gereklidir. Ancak wa üzerinde yeterli esneklik ve kontrol sağlayabilir birkaç piyasada mevcut aydınlatma sistemleri vardırvelength ve yoğunluğu gibi optimizasyon deneyleri gerçekleştirmek için. Ticari olarak temin edilebilen cihazlar genel olarak ışık yoğunluğu, sadece farklı olabilir, farklı üreticiler tarafından birden çok LED elemanları içeren araştırmacılar olarak elde edilen çoklu dalga ya da yoğunlukları, teslim etmek mümkün değil, aynı zamanda yayılan ışığın dalga boyu spektrumu değildir. Biz böylece R / NIR-LT parametrelerinin yakın, doğru kontrol sağlayan, dalga boyu ve ışık akıcılıklarda bir dizi üreten, dar girişim filtreleri ile filtre geniş bant Xenon ışık kaynağı kullanılarak bu konuya değindik.
Bu tedavinin terapötik doz R / NIR LT durumunda sitokrom C oksidaz (COX) 18 olduğu kabul edilmektedir, photoacceptor (kromofor) ile etkileşim fotonların sayısı ile tanımlanır dikkat etmek önemlidir. Teslim foton enerjisi dalga boyu ile değişir; farklı dalga boylarında enerji eşit dozlarda anlam com olacakfotonların farklı sayılar ödüllü. Bu nedenle, cihazdan çıkan ışık, test edilecek seçilmiş dalga boylarının her biri için bir foton eşit sayıda yaymak üzere kalibre edilmiştir. Biz in vitro hücrelere dalga boyu ve yoğunlukları aralığında R / NIR-LT sunmak için kullanılabilecek bir sistem geliştirildi ve tabi hücrelerde ROS üretimi üzerinde teslim R / NIR-LT etkilerini ölçmek yeteneği göstermiştir glutamat stres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Optik Kalibrasyon: Ölçme Işık Çıkışı
- Işık teslim aparatı hazırlamak için, geniş bant ışık kaynağı bağlamak (örneğin, Xenon veya tungsten lamba) uygun bir güç kaynağına. Işık, birleştirilmiş ışını üretmek için, ışık kaynağının önünde bir kolimatör lensi yerleştirin. Işık demeti gelen ısının çoğunu çıkarmak için bir sıvı ısı filtre içinden ışık geçirir. Uygulamaya bağlı olarak, ışığın daha esnek teslimat (örn., Bir kuluçka makinesi içine) sağlayan bir sıvı ışık kılavuzunun giriş açıklığı, üzerine birleştirilmiş ışın odak.
- Sıvı ışık kılavuzunun diğer ucunda, ikinci bir kolimatör lensi ve daha sonra müdahale ve nötral yoğunluk filtreleri için bir tutucu yerleştirin. Bu düzenleme istenen dalga ve yoğunlukta bir ışık eşit aydınlatılmış nokta üretir olmadığını kontrol edin.
Not: Işık rehber ve örnek uçağın sonu arasındaki mesafe bağlı olarak değişebilir gerekebilirIşıklı, ancak gereken alan ışık kılavuzu artar ucundan mesafe olarak, ışık şiddeti azalacak unutmayın. Bu çalışmada, bu mesafe, 14cm ve eşit oranda 96 oyuklu bir plaka üzerinde 3x3 alan iyi aydınlatan bir kiriş kesite üretir. - Lamba ve ilişkili optik bileşenleri bu sokak ışığı olun numune ulaşmak mümkün.
- Sıvı ısı filtresi su soğutucusu açın ve filtre ceket suyun değişimi olduğundan emin olunuz. Lamba güç kaynağı açın ve stabilize genişbant ışık kaynağı için en az 5 dakika bekleyin. Not: su soğutucu kullanılması cihazın aşırı ısınmasını önlemek için gereklidir.
- Aydınlatma istenen dalga bandını oluşturmak için (genellikle yarım maksimum (FWHM) bant genişliği kendi merkez dalga boyu, tepe geçirgenlik ve tam genişliği tarafından açıklanan) bir dar girişim filtre seçin. Not: Bu çalışmada kullanılan dar girişim filtreleri 4 idi42 nm, 550 nm, 671 nm ve 810 nm.
- Numune tedavi sırasında yerleştirilmiş olan düzlemde lamba tarafından üretilen ışık ölçülür. Üreticinin talimatlarına uygun olarak uygunluk yazılımı kullanılarak, uygun bir spektrorayometrenin bağlı kalibre edilmiş bir ışık şiddeti prob (kosinüs kolektörü) kullanılarak ışık ölçülür.
- İstenilen çıkış elde edilene kadar ışık yoğunluğunu ayarlamak için nötral yoğunluk filtreleri kullanın. Not: Bu çalışmada, her bir girişim filtresi tarafından geçirilen ışığın yoğunluğu dört tedavi dalgaların her birinde eşit quantal çıkış verecek şekilde ayarlanır. Bu lamba çıkışı değişebilir gibi, düzenli kalibrasyon kontrol etmek önemlidir.
Not: aparatın set up takiben, hücreler ışıklı hazır 1 çalışmada kullanılan ışık teslim aygıtının bir temsildir..
Işık teslim aparatı. Resimli Şekil 1. Görüntü ışık güç kaynağı, konut, collimating lens, su filtresi, giriş açıklığı, sıvı ışık kılavuzu, ikinci kolimatör lens, filtre tutucu, tedavi çerçevesi ve mat siyah kart ile xenon lamba vardır. Dar dalga boyu ve yoğunluğu filtreleri gösterilmez unutmayın.
2. Hücre Hazırlanması
- açıklandığı gibi R / NIR LT dağıtım yöntemi, herhangi bir hücre tipi ya da in vitro model sisteminde uygulanabilir; Hücre kültürü, aşağıdaki tanımları, kültür feokromositoma (PC12), Müller (rMC1) ve primer karma retina hücreleri tarafından iyi bilinen teknikler kullanılarak, genel olarak.
- Işık tedavisi ve oksidatif stres tahlilinde hücre ekim önce kültür T75 flas uygun ekler (örn., FBS, antibiyotikler) ihtiva eden ilgili büyüme ortamında hücrelerin ölümsüz% 70-80, birbirine karışana kadar ks.
- Örneğin test edilecek hücre tipi için uygun yöntemi kullanarak, T75 şişelerinden ölümsüzleştirdi hücreleri ayırmak., Tripsin. Gerekirse, 96 oyuklu tahlil plâkalarında hücrelerin tohumlama ile devam etmeden önce, kaplama bir deney plakası (PC 12 hücreleri için, örneğin.) 1 saat için 10 ug / mL poli-L-lizin ile kuyu veya 10 ug / ml poli-L-lizin için 10 ug olan bir O / N inkübasyon, ardından 1 saat / mL, laminin (ör., karışık retina hücreleri için).
- Santrifüj hücreleri (örn., PC12 hücreleri için 405 x g ya da rMC1 hücreleri için 218 x g'de 10 dakika sonra 3 dakika) uygun toplamak için, uygun hücre kültür ortamı içinde 8 ml supernatant ve tekrar süspansiyon çıkarın.
- Karışık retinal hücreler kullanılacak ise, tespit edilmiş işlemler 19'a göre enzimatik sindirme (papain) ile P0-5 yenidoğan sıçan yavrularından hazırlanması
- Bir hemositometre kullanılarak,% 0.4 (a / h), tripan mavi boya hariç canlı hücre sayısı.
- Hücre yoğunluğu suc ayarlamaHücreler, kültür içinde 24 ya da 48 saat sonra yaklaşık olarak% 70-80 konfluent olacak s. (PC 12 hücreleri için tohum yoğunluğu rMC1 hücreleri için, bu, 2.5 x 10 5 canlı hücre / ml ve karışık retina hücreleri için 8 x 10 5 canlı hücre / ml, 4.0 x 10 5 canlı hücre / ml). Hücreleri ilave edildikten sonra ya da uygun bir büyüme ortamı, 100 ul, (H2O 2 veya DCFH-DA deneyi için sırasıyla kullanılır) açık ya da siyah 96 oyuklu plakalar, plaka 37 ° C'de, 5 düz bir yüzey üzerinde oturmasına olanak sağlamak için % CO2 hücre yapışmasını sağlamak için en az 24 saat boyunca (ya da koşullar, belirli bir hücre tipi için uygun).
- Uygun 96 gözlü tepsiler içinde büyüme ortamı içinde kültür hücreleri% 70-80 konfluent (PC12 ve rMC1 hücreleri için 24 saat karıştırılmış retina hücreleri için 48 saat) kadar.
3. Hücreleri Glutamat stresördür ekleme
- Uygun tam yetişmektedir 0-10mM L-glutamik asit monosodyum tuzu, hidratı stres konsantrasyonları hazırlamakinci kültür ortamı.
- Hücrelerden ortamı çıkarın ve yavaşça PBS (PC12) veya HBSS (rMC1 ve karışık retina hücreleri) ile hücreler 3 kez yıkayın. Yıkamadan sonra, / göz 100 ul toplam hacmine glutamat içeren ortamı eklenir.
Işık Tedavi 4. İlk dozları
- Hemen glutamat ya da tercih edilen stres eklenmesi ile hazırlanan ışık verme cihazının altına yerleştirilerek, istenen dalga boylarında ve yoğunluklarda ışık tedavisi hücrelerin maruz kalmaktadır. Dalga boyuna bağlı olarak nötral yoğunluk filtreleri kurulan kombinasyonları kullanılarak ışık demetinin quantal çıkışını yönetilen değiştirmek emin olun.
Not: Mevcut deneylerde, 3 dakika boyunca ışık tedavisi hücreleri maruz 37 o C ısı yastığı 96 kuyu plakaları dinlenme sıcaklığını korumak. Gerekli tedavi süresi değişebilir.- 96-wel bitişik kuyulara yansıtan ışık önlemek için hücrelerin altında bir mat siyah kart yerleştirinl tepsisi diğer tedavi parametreleri için belirlenen.
- Tedavi süresi, daha uzun için arzu edildiği takdirde, uygun olan ya da koşulları hücre kültür ortamının pH'ının muhafaza edilmesi ya da, ideal olarak% 5 CO2 ayarlandı CO2 konsantrasyonuna sahip bir kuluçka makinesi içinde cihaz ve tedavi plakaları yerleştirmek için 25 mM Hepes tampon eklemek özel bir hücre tipi için.
- Işık tedavisi tamamlandıktan sonra, düz bir yüzeye yerleştirin ve hücreleri 37 ° C ve% 5 CO 2 inkübe 24 saat için (ya da koşullar ne olursa olsun hücre tipi için en uygun).
Not: Yukarıda tarif edildiği gibi, istenen R / NIR LT ek dozlar uygulanabilir.
ROS Işık Tedavi ve Algılama 5. Nihai Doz
- Işık tedavisi son turu yapmadan önce, reaktifler ROS tespiti için kullanılacak hazırlamak. 2 O 2 algılama reaktif çalışma 50mM sitrat tamponu (pH 6.0), Triton X100 ve H hazırlayınçözeltisi (1: 2: 10 mM H2O 2 saptama reaktif maddesi stok çözeltisi 97 oranı, 10 U / ml yaban turpu peroksidaz, 50 mM soyum sitrat (pH 6.0)). Uygun bir ortamda 100uM nihai konsantrasyon DCFH-DA hazırlayın.
Not: PC 12 hücreleri için DCFH-DA reaktif RPMI ortamı içinde olan, rMC1 hücreleri için DCFH-DA reaktif DMEM ortamı. Piyasada mevcut algılama reaktifleri özel ROS diferansiyel hassasiyetleri var ve reaktifler bir bireysel başvuru için istenen bilgileri temin etmek dikkatle seçilmelidir unutmayın. - Aşama 4.1-4.1.2 tarif edildiği gibi, hücrelere ışık tedavisi uygulayın. Emin olun hücreler ışık istenen etkilenirler / dalga boyları ile tedavi ediliyor.
- Hemen glutamat içeren ortamını çıkarın ve uygun tampon çözeltisi ile iki kez yıkanır, ışık tedavisi aşağıdaki gibidir (PC 12 hücreleri için, PBS kullanılır ve rMC1 hücreleri için, HBSS kullanılır). Aşağıdaki gibi hücreler üzerinde ROS tahlilleri gerçekleştirin:
- H2O 2 CO2 37 ° C'de inkübe etmek ve% 5. H 50 ul H2O 2 algılama çalışma çözeltisi eklenir ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir. 530nm bir eksitasyon dalga boyu ve 480nm emisyon dalga boyu olan bir plaka okuyucusu kullanılarak floresan ölçülür.
- DCF deneyi: bölümlerinin her birine DCFH-DA, 100 uM çözeltisi 100 ul ve 37 ° C'de 30 dakika% 5 CO2 inkübe edilir. 100 uM DCFH-DA içeren Ortamı çıkarın ve (yukarıda anlatıldığı gibi) iki kez uygun bir tampon çözeltisi ile yıkanır. Kuyusunun herbirine, tampon çözeltisi ve 10 ul Triton X100, 90 ul ekleyin ve yavaşça 37 ° C'de 30 saniye 15 önce dakika kuluçkalama için bir orbital çalkalayıcı üzerinde çalkalayın. 480nm bir eksitasyon dalga boyu ve emisyon Wavel bir plaka okuyucusu kullanılarak DCF edilen floresan ölçülür530nm ve ength.
- Hızlı ROS mg protein hesaplamak için standart bir eğri değini ile, üreticinin talimatlarına uygun olarak protein konsantrasyonunu belirlemek için kolorimetrik bir kit kullanılarak, oyuklarda kalan hücrelerin protein konsantrasyonu ile ilgili değerler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
670nm bir dalga boyunda, iletilen ışığın, önceden in vivo üretimi (0.3 J / cm2), 20 olarak yararlı olduğu gösterilmiştir 670nm ışık dozu kapsayan akıcılıklarda bir dizi hücre ışın tedavisi amacıyla nötr yoğunluk filtreleri kullanılarak kalibre edilmiştir. Artan ışık kaynağının önünde nötral yoğunluk filtreleri sayısı arttıkça, yoğunluk (W / m 2) daha az ışık hedef alana geçmek için izin düşmüştür. Tablo 1, bir dalga boyu filtre takılmış bir ışık kaynağından üretilen 670nm ışık kalibrasyon verilerini sunar ve ışık çıkışı tanımlanmıştır mesafelerde kullanılan ND filtre sayısını ve bunun sonucunda ortaya çıkan ışığın yoğunluğunu kapsamaktadır. Doz ya da 670nm ışık (J / cm2) dozu, aşağıdaki denklemden hesaplandı: [Doz (J / cm2) = (ışık yoğunluğu () m 2 / G / 10000) X zaman (lar)], burada tedavi süresi 180s oldu.
| ND filtre sayısı | Işık çıkışı uzaklık (cm) | Yoğunluk (W / m ^ 2) | Doz (J / cm ^ 2) |
| 0 | 10.5 | 20.11 | 0.38 |
| 0 | 14 | 10.55 | 0.19 |
| 1 | 14 | 4.91 | 0.075 |
| 2 | 14 | 2.28 | 0.041 |
| 3 | 14 | 1.03 | 0.018 |
| 4 | 14 | 0.47 | 0.0085 |
| 5 | 14 | 0.21 | 0.0038 |
| 6 | 14 | 0.094 | 0,00169 |
| 7 | 14 | 0.045 | 0.00081 |
| 8 | 14 | 0.021 | 0.000378 |
| 9 | 14 | 0.013 | 0.000234 |
Tablo 1: B filtreleri 670nm dalga boyu filtre numarayı çevirin ile donatılmış ışık dağıtım tertibatının çıkışı, ışık kaynağı çıkışı ön tarafına takılır ND filtrelerin sayısını ifade eder. Th tarafından rapor edilen yoğunluğu (W / m2) ışığın yoğunluğuna karşılık gelire yerindelik yazılımı. Doz ya da doz maruz kalma süresi ışık çıkışı 180s ve mesafe olduğu denklem [Doz (J / cm2) = (ışık yoğunluğu (W / m2) / 10,000) x zaman (lar)] hesaplanmıştır 10.5 veya 14 cm idi.
Işık iki klinik açıdan anlamlı quantal etkilenirler ROS üretimi R / NIR LT dalga boyu farklı etkileri araştırmak için seçilmiştir. Örten dokuda LED cihazlar kullanarak aracılığıyla iletim aşağıdaki MSS yolları ulaşabilir Bir doz (yani, 1.78 W / 670nm m 2) 20 3 dk tedavisi için 0.03 J / cm 2 eşit veya 4.9 x 10 14 fotonlar / cm 2 / s. , filtreler ile donatılmış ışık kaynağı, 442 emisyonu 550, 670 sonuçlanması veya 830nm sonra enerji çıkışları yerine, her dalga boyu için (J / cm 2) eşit quantal çıkışlar (fotonlar) yayarlar nötral yoğunluk filtreleri kombinasyonu kullanılarak kalibre edildi ve dozajlar, (J / cm2) ve entegrasyonW / m 2 hesaplanan (Tablo 2a) nsities. Önerilen kurallar içinde olduğunu bir ek daha yüksek doz her dalga boyu için yapılan hücresel 21 de (1.29 x 10 15 fotonlar / cm 2 / s) kullanılan aktivite ve kalibrasyonu uyarmak için (Tablo 2b).
| Dalgaboyu (λ) | Doz (J / cm ^ 2) | Yoğunluk (W / m ^ 2) | Emisyon (fotonlar / cm ^ 2 / s) |
| 442 | 0.057 | 3.21 | 4.8 x 10 ^ 14 |
| 550 | 0.051 | 2.87 | 5.0 x 10 ^ 14 |
| 670 | 0.032 | 1.78 | 4.9 x 10 ^ 14 |
| 830 | 0.018 | 1.01 | 4.9 x10 ^ 14 |
Tablo 2:. Değişen dalga boylarında ışık foton eşit sayıda tarafından verilen dozaj yoğunluğunun kalibrasyonu yoğunluk (W / m2), bir 3 dakika muamele (J / cm2) ve emisyon için dozaj (foton / cm2 / s), 442, 550, 670 ve 830nm emisyon ksenon ışık çıkışı 14 cm mesafede) 4.9 x 10 ila 14 foton / cm2 / sn ya da B) 1.3 x 10 15 foton / cm2 / s A yaymak üzere kalibre edildiğinde ışık çıkışı.
Aygıtı tarafından iletilen ışık kullanılan dozajlarda hücreler için toksik olup olmadığını değerlendirmek için, bir kolorimetrik protein deneyi kullanılarak ROS deneyleri aşağıdaki PC12 hücre kültür çukurlarına kalan protein içeriği değerlendirildi. Işık (p> 0.05) daha yüksek çıkış dozajlarda herhangi bir proteinin önemli bir kayıp (İletilen ışığın dozaj, hücre ölümüne neden olmadığını Figür işaret yoktuE 2) ve oksidatif metabolizma değerlendirmeler için kullanımı uygundur.
Şekil 2, R / NIR-LT ve ROS deneyinin ardından, kültür çukurlarına kalan toplam protein yoğunluğunda ışık değişen dozları etkisi. Histogram çubukları PC12 hücre kültür çukurlarına SEM protein konsantrasyonları ortalama ± 6 tekrar / konsantrasyon, deneyler 3 kez tekrarlanmıştır. Varyans analizi (ANOVA), p> 0.05 tarafından belirlenen kontrol ve tedavi gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı fark yoktu.
Başlangıçta açık dağıtım aparatının uygunluğunu değerlendirmek için bir Örnek olarak dalga boyu, 0.0085 0.38 J / cm2 arasında değişen akıcılıklarda teslim 670nm ışık etkileri değerlendirildi. Anlamlı effH2O 2 ya da PC12, rMC1 veya karışık retina hücrelerinde DCF floresan glutamat (Şekil 3, p> 0.05) ile ya da stresli değerlendirirken 670nm ışık vb test akıcılıklarda herhangi birinde gözlenmemiştir. Benzer şekilde, H 2 O 2 değerlendirirken / NIR-LT 4.9 x 10 14 foton teslim R / cm 2 / s veya 1.3 x 10 15 fotonlar / cm ROS üretimi 2 / s, dalga boylarını değişen anlamlı etkisi vardı ya DCF floresan (p> 0.05, veriler gösterilmemiştir). Reaktif türler değişiklikleri tespit etmek bizim yeteneği 10mM glutamat de 22.10 ± 2.10 13.44 ± 0.67 mM glutamat de DCFH-DA reaktif boya floresan bir artış ile teyit edilir. Bizim veri Seçilen model sisteminde ROS üretimi bizim ışık dağıtım cihazı kullanılarak teslim R / NIR-LT olumlu etkilerini ortaya, ne var hücreler kültürde sürekli protein içeriği ile gösterilen, tehlikeye değil gibi olumsuz etkileri vardı yok ikenışık tedavisi (Şekil 2) Aşağıdaki kuyuları. Bu nedenle, tarif edilen yöntem, bir dalga boyu aralığında bir foton tanımlanan dozaj hücreleri ya da mitokondri tedavi etmek için bir protokol sağlamakta ve daha yüksek dozlar ve R / NIR LT parametrelerinin optimizasyonu sağlayabilir alternatif sonuç ölçümleri, değerlendirmek için de kullanılabilir.
Şekil 3: PC12 (A, D) H 2 O 2 (AC) ve DCF (DF) floresan miktarının belirlenmesi, rMC1 (B, E) ya da karışık retinal hücre (C, F) 10 mM glutamat stres varlığında kültürleri, 0.38 J / cm 2 - 0 arasında değişen akıcılık dozlarında 670nm ışınlama tedavisi sonrası. Histogram çubukları ± SEM ortalama keyfi floresan üniteleri / ug protein temsil eder. Istatistiksel olarak anlamlı saptanmadıgrup başına replike ANOVA, p <0.05, 6 ile belirlendiği gibi kontrol ve tedavi grupları arasında herhangi bir fark arasındaki deneyler 3 kez tekrarlanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz başarıyla R / NIR-LT in vitro optimizasyonu çalışması için bir mekanizma sağlamak için kesin ve kalibre ışık iletim sistemini adapte var. R Dalgaboyu ve yoğunluk parametreleri / NUR-LT, bu sistemi kullanarak doğru ve etkili bir şekilde manipüle edilmesi mümkün bulunmaktadır. ROS test edilen hücre tiplerinde, Verilen dalga boylarında ve dozajlarda düşük değil, ancak biz, hücre ölümüne yol açmamıştır hücrelerininkine ışık tedavisi kurulmuştur. 670nm (20.11W / m 2) akım sistem tarafından ulaşılan maksimum yoğunlukları 1.17 W / m 2 optik sinir ve 0,3W ventral yüzeyi ulaştı sıçan beyninde, içine ışınlama penetrans önce yayınlanan önlemler aşan / m 2 beyin durumda ventral yüzeyi ulaştı. 0.31 J / cm 2 - 30 dakika teslim edildiğinde, in vivo optik sinirin hücreleri tarafından alınan doz nedenle 0.054 olduğunu. Bu çalışmada yer verilen 670nm ışık dozları (0.38J / cm2) 'e kadar bu nedenle in vivo olarak daha önceki çalışmalarda hücreleri tarafından alınan da kapsar.
R / NIR-LT etkinliği en yaygın kabul gören teori, bu nedenle değişen dalga boyları ile tedavi edilen hücreler ışık (fotonlar / cm 2 / s) eşit quantal akızamanları almalarını sağlamak için zorunludur, bir foto tabanlı sistem 18 olduğunu 8. Buna ek olarak, belirli bir ışık fluens teslim etmek için kullanılan maruz kalma süresi artar ve zaman içinde toplam fluens azaltmak için değişen ışık yalnızca yoğunluğu, işlemler arasında tutarlı tutulması gerekir. Önceki çalışmalar pozlama süresini değiştirme sonuç önlemler farklılıklar eşit etkilenirler sonuçlar sunmak ve bir karıştırıcı faktör olarak hareket edebilir, ve belli bir yaralanma modelinde 22,23 için gerekli optimum dalgaboyu / akıcılık parametrelerinin belirlenmesi engel olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, biz doz dikkatli kalibrasyon tavsiyeTest edilen her dalga boyunda, R / NIR-LT yararlı optimizasyonu sağlamak.
Kullanılan teknik, bağlı hücre mimarisi ve kompleks hücre içi etkileşimler korunmasına daha anlamlı sonuçlar neden olabilir Organotipik dilim kültürler de dahil olmak üzere, in vitro model sistemlerinde bir dizi ışık iletimini sağlar. Yaralanma modelinde Üzerine Çeşitlemeler R / NIR-LT tedavi parametreleri farklılıkları gerektirebilir. Bu teknik tarif enstrümantasyon ile elde edilebilen maksimum güç çıkışı tarafından sınırlıdır. Yüksek güç çıkışları in vivo uygulamalarda, in vitro olarak bir ve en çok için gerekli olabilir. Işık daha yüksek kapasite talep durumunda, cihaz örnekleri ulaşan ışık yoğunluğunu arttırmak için değiştirilebilir. Işık sonlandırma ve hedef hücreler arasındaki mesafeyi kısaltmak plakası ulaşan ışığın yoğunluğunu artıracak. Alternatif olarak, ışık ayna kapalı ve Oppo gibi hücreler üzerine yansıyan olabilirbir sıvı ışık kılavuzu ile filtre olmanın sed, ancak alternatif dalga boyu ve nötral yoğunluk filtreleri bunu başarmak için gerekli olacaktır. Yöntem R'nin teslim için adapte edilmesi halinde, daha güçlü bir ışık kaynağı kullanılarak yüksek çıkışları da gerekli olacaktır / NIR LT farklılıklardan dolayı, ışınlama 8,20 etkin penetrasyonun sağlamak için gerekli artan dozlarda MSS yaralanması vivo modeller, .
Sonuç olarak, bu çalışma, etkili bir şekilde R / NIR LT çalışmalarda ışığın şiddeti ve dalga boyu parametrelerini değiştirmek için bir araç sağlar, ışık temin için yeni bir yöntem tarif eder. Bu metodoloji sonuç bir dizi tedbir istihdam R / NIR-LT optimizasyonu ve in vitro yaralanma modellerinde yararlı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OxiSelect Intracellular ROS Assay Kit (Green Fluorescence) | Cell Biolabs | STA-342 | |
| Amplex UltraRed Reagent | Molecular Probes | A36006 | |
| 300 Watt Xenon Arc Lamp | Newport Corporation | 6258 | Very intense light source, do not look directly into the lamp. Ensure there is sufficient cooling to the lamp whilst it is switched on |
| USB4000-FL Fluorescence Spectrometer | Ocean Optics | ||
| CC-3-UV Cosine Corrector for Emission Collection | Ocean Optics | ||
| 200μm diameter quartz fibre optic | Ocean Optics | ||
| SpectraSuite Spectroscopy Platform | Ocean Optics | ||
| 2300 EnSpire Multimode Plate Reader | Perkin Elmer | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | Acute toxicity, wear gloves when handling. |
| L-Glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | 142-47-2 (anhydrous) | |
| Pheochromocytoma rat adrenal medulla (PC12) cells | American Type Culture Collection | CRL-2522 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI1640) Media | Gibco | 11875-119 | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin | Gibco | 10082-147 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Horse Serum, New Zealand origin | Gibco | 16050-122 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-061 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| 100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140-050 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Retinal Muller (rMC1) cells | University of California, San Diego | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-118 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| 75 cm2 Flasks | BD Biosciences | B4-BE-353136 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | 25988-63-0 | Aliquot and store at -20 °C |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-134 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-049 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Gibco | 23017-015 | Aliquot and store at -20 °C |
| 1X Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| 165U Papain | Worthington | ||
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | W326305 | |
| Corning 96 well plates, clear bottom, black | Corning | CLS3603-48EA | |
| Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates Untreated; Well shape: Round; Sterile. | Costar | 07-200-103 | |
| Seesaw Rocker | Standard lab epuipment | ||
| Centrifuge | Standard lab epuipment | ||
| Neutral Density Filter Paper (0.3) | THORLABS | ||
| 442 nm Bandpass Filter | THORLABS | FL441.6-10 | |
| 550 nm Bandpass Filter | THORLABS | FB550-10 | |
| 670 nm Bandpass Filter | THORLABS | FB670-10 | |
| 810 nm Bandpass Filter | THORLABS | FB810-10e | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.1) | THORLABS | NE01B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.2) | THORLABS | NE02B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.3) | THORLABS | NE03B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.5) | THORLABS | NE05B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.6) | THORLABS | NE06B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (1.0) | THORLABS | NE10B |
References
- Gutterman, D. D. Mitochondria and reactive oxygen species an evolution in function. Circulation research. 97, 302-304 (2005).
- Camello-Almaraz, C., Gomez-Pinilla, P. J., Pozo, M. J., Camello, P. J. Mitochondrial reactive oxygen species and Ca2+ signaling. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 291, C1082-C1088 (2006).
- Kowaltowski, A. J., de Souza-Pinto, N. C., Castilho, R. F., Vercesi, A. E. Mitochondria and reactive oxygen species. Free Radical Biology and Medicine. 47, 333-343 (2009).
- Coyle, J. T., Puttfarcken, P. Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders. Science. 262, 689-695 (1993).
- Doble, A. The role of excitotoxicity in neurodegenerative disease: implications for therapy. Pharmacology & therapeutics. 81, 163-221 (1999).
- Hall, E. D. Antioxidant therapies for acute spinal cord injury. Neurotherapeutics. 8, 152-167 (2011).
- Jia, Z., et al. Oxidative stress in spinal cord injury and antioxidant-based intervention. Spinal Cord. 50, 264-274 (2012).
- Fitzgerald, M., et al. Red/near-infrared irradiation therapy for treatment of central nervous system injuries and disorders. Reviews in the Neurosciences. 24, 205-226 (2013).
- Rutar, M., Natoli, R., Albarracin, R., Valter, K., Provis, J. 670-nm light treatment reduces complement propagation following retinal degeneration. J Neuroinflammation. 9, 257 (2012).
- Eells, J. T., et al. Therapeutic photobiomodulation for methanol-induced retinal toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 3439-3444 (2003).
- Begum, R., Powner, M. B., Hudson, N., Hogg, C., Jeffery, G. Treatment with 670 nm light up regulates cytochrome C oxidase expression and reduces inflammation in an age-related macular degeneration model. PloS one. 8, e57828 (2013).
- Byrnes, K. R., et al. Light promotes regeneration and functional recovery and alters the immune response after spinal cord injury. Lasers in surgery and medicine. 36, 171-185 (2005).
- Liang, H. L., et al. Photobiomodulation partially rescues visual cortical neurons from cyanide-induced apoptosis. Neuroscience. 139, 639-649 (2006).
- Zivin, J. A., et al. Effectiveness and safety of transcranial laser therapy for acute ischemic stroke. Stroke. 40, 1359-1364 (2009).
- Lapchak, P. A. Transcranial near-infrared laser therapy applied to promote clinical recovery in acute and chronic neurodegenerative diseases. Expert review of medical devices. 9, 71-83 (2012).
- Chung, H., et al. The nuts and bolts of low-level laser (light) therapy. Annals of biomedical engineering. 40, 516-533 (2012).
- Wu, Q., et al. Low-Level Laser Therapy for Closed-Head Traumatic Brain Injury in Mice: Effect of Different Wavelengths. Lasers in surgery and medicine. 44, 218-226 (2012).
- Hashmi, J. T., et al. Role of low-level laser therapy in neurorehabilitation. PM&R. 2, S292-S305 (2010).
- Fitzgerald, M., et al. Metallothionein-IIA promotes neurite growth via the megalin receptor. Experimental Brain Research. 183, 171-180 (2007).
- Fitzgerald, M., et al. Near infrared light reduces oxidative stress and preserves function in CNS tissue vulnerable to secondary degeneration following partial transection of the optic nerve. Journal of neurotrauma. 27, 2107-2119 (2010).
- Ando, T., et al. Low-level laser therapy for spinal cord injury in rats: effects of polarization. Journal of biomedical. 18, 098002 (2013).
- Lanzafame, R. J., et al. Reciprocity of exposure time and irradiance on energy density during photoradiation on wound healing in a murine pressure ulcer model. Lasers in surgery and medicine. 39, 534-542 (2007).
- Castano, A. P., et al. Low-level laser therapy for zymosan induced arthritis in rats: Importance of illumination time. Lasers in surgery and medicine. 39, 543-550 (2007).
