Abstract
Rød / nær-infrarødt lys terapi (R / NIR-LT), leveret af laser eller lysdiode (LED), forbedrer funktionelle og morfologiske resultater i en række skader på centralnervesystemet in vivo, eventuelt ved at reducere oxidativ stress. , Effekter af R / NIR-LT på oxidativt stress har vist sig dog at variere bølgelængde eller intensitet bestråling. Undersøgelser, der sammenligner behandling parametre mangler på grund af manglen på kommercielt tilgængelige anordninger, der giver flere bølgelængder eller intensiteter, der er egnede til høj gennemløb in vitro optimering studier. Denne protokol beskriver en teknik til levering af lys ved en række bølgelængder og intensiteter for at optimere terapeutiske doser, der kræves for en given skade model. Vi antager, at en metode til at levere lys, hvor bølgelængde og intensitet parametre let kan ændres, kan lette bestemmelse af en optimal dosis af R / NIR-LT til reduktion reaktive oxygenarter(ROS) in vitro.
Ikke-kohærent Xenon lys blev filtreret gennem smalbåndede interferensfiltre at levere varierende bølgelængder (center bølgelængder 440, 550, 670 og 810nm) og fluenser (8,5 x 10 -3 til 3,8 x 10 -1 J / cm2) af lys til dyrkede celler. Lyseffekt fra apparatet blev kalibreret til at udsende terapeutisk relevante, lige kvantale doser af lys ved hver bølgelængde. Reaktive arter blev påvist i glutamat stressede celler behandlet med lys, ved hjælp af DCFH-DA og H 2 O 2 følsomme fluorescerende farvestoffer.
Vi succes leveret lys på en afstand af fysiologisk og terapeutisk relevante bølgelængder og intensiteter, til dyrkede celler udsat for glutamat som en model for CNS skade. Mens fluenser af R / NIR-LT anvendes i den aktuelle undersøgelse ikke udøve en virkning på ROS genereret af de dyrkede celler, hvilken fremgangsmåde lys levering kan anvendes til andre SystEMS herunder isolerede mitokondrier eller mere fysiologisk relevante organotypiske skive kultur modeller, og kan bruges til at vurdere effekter på en række resultatmål for oxidativ metabolisme.
Introduction
Kræves reaktive oxygenarter (ROS) for en række signaltransduktionsveje og normale reaktioner af cellulær metabolisme, herunder neurobeskyttelse 1. Men når endogene antioxidant mekanisme ikke er i stand til at kontrollere produktionen af ROS kan celler bukke under for oxidativt stress 2,3. Efter skade på CNS, er de tilhørende stigninger i forekomsten af ROS og oxidativt stress menes at spille en væsentlig rolle i udviklingen af skader 4,5. På trods af den omfattende række strategier for formildende oxidativ stress, der er blevet vurderet, er der i øjeblikket ingen fuldstændig effektiv, klinisk relevante antioxidant strategier for formildende ROS produktion og tilhørende oxidativt stress i klinisk brug efter neurotrauma 6. Derfor dæmpningen af oxidativt stress er fortsat et vigtigt mål for terapeutisk intervention 7.
Forbedringer følgering R / NIR-LT er blevet rapporteret i en bred vifte af skader og sygdomme, herunder reduktioner i Cardial infarktstørrelse, nyre- og lever komplikationer under diabetes, retinal degeneration, CNS skade og slagtilfælde 8, måske ved at reducere oxidativ stress. Især med hensyn til CNS skade, har prækliniske undersøgelser af effekten af 670 nm lys vist gode effekter i modeller for retinal degeneration 9-11, rygmarvsskade 12, neuronal død 13. Kliniske forsøg er blevet udført for tør aldersrelateret makuladegeneration og er i øjeblikket i gang for slagtilfælde 14 dog resultaterne af disse forsøg ikke synes lovende, måske på grund af en manglende ansætte effektiv behandling parametre 15. Som sådan R / NIR-LT er ikke blevet udbredt som led i almindelig klinisk praksis neurotrauma, trods en nem at administrere, ikke-invasiv og forholdsvis billig behandling. Hindringer for klinisk oversættelse omfatter manglen på en cltidligt forstod virkningsmekanisme og fraværet af en standardiseret effektiv behandling protokol 16,17. Aktuel litteratur om lysterapi afslører et væld af variation i behandling parametre med hensyn til bestråling kilder (LED eller laser), bølgelængde (fx 630, 670, 780, 810, 830, 880, 904nm), total dosis (joule af bestråling / arealenhed), varighed (eksponeringstid), timing (præ- eller post-fornærmelse), behandlingshyppighed og leveringsmåde (puls eller kontinuerlig) 8. Variabiliteten i behandling parametre mellem studier gør sammenligning vanskelig og har bidraget til skepsis over for effekten 16.
Derfor er optimering af R / NIR-LT klart påkrævet, med cellekultur systemer, der kan levere den high-throughput screening mekanisme nødvendigt at sammenligne de mange variable. Men der er få kommercielt tilgængelige belysningssystemer, der kan give tilstrækkelig fleksibilitet og kontrol over wavelength og intensitet til at udføre sådanne optimering eksperimenter. Kommercielt tilgængelige LED-enheder er generelt ikke i stand til at levere flere bølgelængder eller intensiteter, hvilket resulterer i efterforskere beskæftiger flere LED enheder fra forskellige producenter, som kan variere ikke kun i intensitet, men også det spektrum af bølgelængden af lys, der udsendes. Vi har behandlet dette spørgsmål ved at anvende en bredbåndsforbindelse Xenon lyskilde filtreres gennem smalbånd interferensfiltre, hvorved der genereres en række bølgelængder og fluenser af lys, så tæt på, nøjagtig styring af parametrene for R / NIR-LT.
Det er vigtigt at bemærke, at den terapeutiske dosis af behandlingen er defineret ved antallet af fotoner, der interagerer med photoacceptor (kromofor), som i tilfælde af R / NIR-LT postuleres at være cytochrom c-oxidase (COX) 18. Foton energi leveret varierer med bølgelængden; betyder lige store doser af energi ved forskellige bølgelængder vil være comværdsat af forskellige antal fotoner. Derfor blev det udsendte lys fra indretningen kalibreres til at udsende et tilsvarende antal fotoner for hver af de valgte bølgelængder der skal testes. Vi har udviklet et system, der kan anvendes til at levere R / NIR-LT ved en række bølgelængder og intensiteter til celler in vitro og demonstreret evne til at måle virkningerne af den leverede R / NIR-LT på ROS produktion i celler udsat for glutamat stress.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Optisk kalibrering: Måling Light Output
- For at forberede lyset apparat levering, skal du tilslutte en bredbåndsforbindelse lyskilde (f.eks Xenon eller wolfram lampe) til en passende strømforsyning. Placer en kollimatorlinse foran lyskilden til at producere en kollimeret lysstråle. Før lys gennem en flydende varme filter til at fjerne det meste af varmen fra lysstrålen. Afhængigt af programmet, fokusere kollimeret stråle på indgangen blænde af et flydende lysleder, som giver mere fleksibel levering af lyset (f.eks., I en inkubator).
- I den anden ende af den flydende lysleder, placere et andet kollimatorlinse og derefter en holder til interferens og neutralfiltre. Kontroller, at denne ordning giver en jævnt belyst lysplet af det ønskede bølgeområde og intensitet.
Bemærk: Afstanden mellem enden af lyslederen og prøven flyet kan være nødvendigt at varieredet område, der skal belyses, men husk, som afstanden fra enden af lyslederen stiger, vil lysintensiteten falde. I den foreliggende undersøgelse, er denne afstand 14cm og danner en stråle tværsnit, jævnt belyser en 3x3 godt område på en plade med 96 brønde. - Sørg for, at falsk lys fra lampen og tilhørende optiske komponenter ikke er i stand til at nå prøven.
- Tænd vandkøler for væsken varme filter og sikre, at der er udveksling af vand gennem filteret jakke. Tænd lampen strømkilde og vente mindst 5 min for bredbånd lyskilde at stabilisere sig. Bemærk: Brugen af vandkøleren er forpligtet til at forhindre overophedning af enheden.
- Vælg en smalbånd interferens filter (sædvanligvis karakteriseres ved deres center bølgelængde, peak transmittans og fuld bredde ved halvt maksimum (FWHM) båndbredde) for at generere det ønskede bølgeområde af belysning. Bemærk: smalbånds interferensfiltre anvendes i den aktuelle undersøgelse var 442 nm, 550 nm, 671 nm og 810 nm.
- Mål lys fra lampen på det plan, hvor prøven skal placeres under behandlingen. Mål lys ved hjælp af en kalibreret bestråling probe (cosinus kollektor) forbundet til en passende spektroradiometer hjælp den software i henhold til producentens anvisninger.
- Brug neutralfiltre at justere intensiteten af lys, indtil den ønskede effekt er opnået. Bemærk: I den foreliggende undersøgelse, er intensiteten af lys passeret af hvert filter interferens indstillet til at give en lige kvantalt output ved hver af de fire behandlingsgrupper bølgebånd. Det er vigtigt at kontrollere kalibreringen jævnligt, da lampen output kan ændres.
Bemærk: Efter opsætning af apparatet, er cellerne klar til at blive belyst Figur 1 er en repræsentation af den lette levering apparat, der anvendes i den aktuelle undersøgelse..
Figur 1. Billede af lyset levering apparat. Illustreret er lys strømkilde, xenon lampe med boliger, kollimatorlinse, vand filter, indgang blænde, flydende lysleder, andet kollimatorlinse, filterholder, behandling ramme og mat sort kort. Bemærk, at den smalbåndede bølgelængde og intensitet filtre ikke er vist.
2. Cell Forberedelse
- Den beskrevne R / NIR-LT levering metode kan anvendes på enhver celletype eller in vitro modelsystem; som sådan de følgende beskrivelser af cellekultur er generelle, ved hjælp af veletablerede teknikker til kultur pheochromocytoma (PC12), Müller (rMC1) og primære blandede retinale celler.
- Forud for celle såning til lysbehandling og oxidativt stress assay, kultur udødeliggjort celler i deres respektive vækstmedier indeholder passende supplementer (f.eks., FBS, antibiotika) i T75 flasks indtil 70-80% sammenflydende.
- Frigør immortaliserede celler fra T75 kolber ved anvendelse af fremgangsmåden passende for celletypen, der skal testes f.eks. Trypsin. Hvis det er nødvendigt, før du fortsætter med podning af celler i 96 brønde assayplader, frakke assaypladebrønde med 10 ug / ml poly-L-lysin i 1 time (f.eks., For PC12 celler) eller 10 ug / ml poly-L-lysin til 1H efterfulgt af en O / N inkubation med 10 ug / ml laminin (f.eks., for blandede retinale celler).
- Centrifuger cellerne at indsamle så passende (f.eks., 3 min ved 405 xg i PC12-celler eller 10 minutter ved 218 xg i rMC1 celler), supernatanten fjernes, og resuspender i 8 ml passende celledyrkningsmedier.
- Hvis de blandes retinale celler skal anvendes, skal der ud fra P0-5 neonatal rotteunger ved enzymatisk fordøjelse (papain) ifølge etablerede procedurer 19
- Tæl antallet af levedygtige celler eksklusive 0,4% (w / v) trypanblåt, anvendelse af et hæmocytometer.
- Juster celledensitet such at celler vil være ca 70-80% sammenflydende efter 24 eller 48 timer i kultur. (For PC12-celler seeding tæthed er 4,0 x 10 5 levedygtige celler / ml for rMC1 celler er 2,5 x 10 5 levedygtige celler / ml og blandet retinale celler er 8 x 10 5 levedygtige celler / ml). Efter tilsætning af celler til enten klare eller sort 96-brønds plader (bruges til H 2 O 2 eller DCFH-DA-assay henholdsvis) i 100 pi passende vækstmedium, tillade pladen at sidde på en flad overflade ved 37 ° C, 5 % CO2 (eller hvad betingelserne er passende for den specifikke celletype) i mindst 24 timer for at tillade celle vedhæftning.
- Kultur celler i vækstmedier i de relevante 96-brønds bakker, indtil de er 70-80% sammenflydende (24 for PC12 og rMC1 celler, 48h for blandede retinale celler).
3. Tilføjelse Glutamat Stressor til celler
- Forbered L-glutaminsyre mononatriumsalt hydrat stressor koncentrationer af 0-10mM i passende fuld vokseth kulturmedier.
- Fjern medier fra cellerne og forsigtigt vaske cellerne 3 gange med PBS (PC12) eller HBSS (rMC1 og blandede retinale celler). Efter vask tilsættes glutamat-holdige medier til et samlet volumen på 100 pl / brønd.
4. Første Doser Lysets Behandling
- Umiddelbart efter tilsætning af glutamat eller stressor valg, udsætte celler til lysbehandling på de ønskede bølgelængder og intensiteter ved anbringelse under den forberedte apparat lys levering. Sørg for at ændre den kvantemekaniske produktion af lysstrålen ved hjælp af de etablerede kombinationer af neutralfiltre afhængigt af bølgelængden bliver administreret.
Bemærk: I de nuværende forsøg udsættes celler for lys behandling i 3 minutter holde temperaturen ved at hvile 96-brønds plader på et 37 ° C varme pad. Behandlingstiden kan varieres efter behov.- Placer en mat sort kort nedenunder cellerne til at forhindre lysreflekterende ind i tilstødende brønde i 96-welll bakke udpeget til andre behandlingsmetoder parametre.
- Hvis behandling er ønsket for længere tidsrum, tilsættes 25 mM Hepes-buffer for at opretholde pH i cellekulturmedier eller ideelt placere apparatet og behandling plader i en inkubator med CO 2 koncentration reguleres til 5% CO 2, eller betingelser, der er optimale for den specifikke celletype.
- Efter afslutning af lysbehandlingen placere cellerne på en plan overflade og inkuberes ved 37 ° C og 5% CO 2 (eller hvad betingelser er optimale for celletypen) i 24 timer.
Bemærk: Yderligere doser af R / NIR-LT kan indgives som beskrevet ovenfor, som ønsket.
5. Endelig Dosering af Light Behandling og påvisning af ROS
- Før udførelse af sidste runde af lysbehandling forberede reagenserne skal anvendes til ROS detektion. Forbered 50 mM citratbuffer (pH 6,0), Triton X100, og H 2 O 2 påvisningsreagens arbejderopløsning (1: 2: 97-forhold af 10 mM H 2 O 2 påvisningsreagens stamopløsning; 10 U / ml peberrodsperoxidase; 50 mM natriumcitrat (pH 6,0)). Forbered DCFH-DA til en endelig koncentration på 100 uM i passende medier.
Bemærk: DCFH-DA reagens til PC12 celler i RPMI medier DCFH-DA reagens til rMC1 celler i DMEM medier. Bemærk, at kommercielt tilgængelige reagenser afsløring har differentierede følsomheder til specifik ROS og bør vælges reagenser omhyggeligt for at tilvejebringe den ønskede for en individuel ansøgning oplysninger. - Administrere lysbehandling til cellerne, som beskrevet i trin 4.1-4.1.2. Sikre cellerne bliver behandlet med de ønskede fluenser / bølgelængder af lys.
- Umiddelbart efter lysbehandling, fjerne glutamat-holdige medier og vask to gange med passende pufferopløsning (til PC12 celler, bliver PBS brugt og til rMC1 celler, der HBSS anvendes). Udfør ROS assays på cellerne som følger:
- H 2 O 2 CO2 i 15 minutter. Der tilsættes 50 pi H 2 O 2 detektion arbejdsopløsning og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur. Mål fluorescens under anvendelse af en pladelæser med en excitationsbølgelængde på 530 nm og en emissionsbølgelængde på 480 nm.
- DCF-assay: tilsættes 100 pi af 100 uM opløsning af DCFH-DA til hver af brøndene og inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C og 5% CO2. Fjern mediet indeholdende 100 pM DCFH-DA og vaskes med egnet buffer-opløsning (som beskrevet ovenfor) to gange. Tilføj 90 pi pufferopløsning og 10 pi Triton X100 til hver af brøndene og ryst forsigtigt på en orbitalryster i 30 sek, før 15 min inkubation ved 37 ° C. Mål DCF afledt fluorescens under anvendelse af en pladelæser med en excitationsbølgelængde på 480 nm og en emissionsbølgelængde Wavelength af 530 nm.
- Express ROS værdier i forhold til proteinkoncentrationen af celler tilbage i brøndene ved hjælp af en kolorimetrisk kit til at kvantificere protein koncentrationen i henhold til producentens instruktioner, med reference til en standardkurve for at beregne mg protein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Udgangen af lys afgivet ved en bølgelængde på 670 nm blev kalibreret under anvendelse af neutralfiltre for at bestråle cellerne med en række fluenser omfatter en dosis af 670 nm lys tidligere vist sig at være gavnlig in vivo (0,3 J / cm2) 20. Da antallet af neutralfiltre foran lyskilden forøges, intensiteten (W / m 2) faldt, så mindre lys at passere til målområdet. Tabel 1 viser data kalibrering af 670nm lys genereret fra lyskilden er udstyret med en bølgelængde filter og omfatter antallet af ND-filtre anvendes, og intensiteten af lys, der genereres som et resultat på beskrevne afstande fra lysudbytte. Fluens eller dosis af 670 nm lys (J / cm2), blev beregnet ud fra ligningen: [Dosis (J / cm2) = (Lysintensiteten (W / m2) / 10.000) x (s)], hvor tidspunkt for behandlingen var 180s.
| Antal ND-filtre | Afstand fra lyseffekten (cm) | Intensitet (W / m ^ 2) | Dosis (J / cm ^ 2) |
| 0 | 10.5 | 20.11 | 0.38 |
| 0 | 14 | 10.55 | 0,19 |
| 1 | 14 | 4.91 | 0,075 |
| 2 | 14 | 2,28 | 0,041 |
| 3 | 14 | 1.03 | 0,018 |
| 4 | 14 | 0,47 | 0,0085 |
| 5 | 14 | 0,21 | 0,0038 |
| 6 | 14 | 0,094 | 0,00169 |
| 7 | 14 | 0,045 | 0,00081 |
| 8 | 14 | 0.021 | 0.000378 |
| 9 | 14 | 0,013 | 0.000234 |
Tabel 1: Produktion af lys levering apparat udstyret med 670 nm bølgelængde filter .Number af ND-filtre refererer til antallet af neutralfiltre monteret foran lyskilden output. Intensitet (W / m 2) henviser til intensiteten af lys, som rapporteret af the sømmelighed software. Fluence, eller dosis blev beregnet ved ligningen [dosis (J / cm 2) = (Lys intensitet (W / m2) / 10.000) x tid (s)], hvor tidspunktet for eksponering var 180s og afstand fra lyseffekt var 10,5 eller 14 cm.
To klinisk relevante kvantale fluenser af lys blev valgt til at undersøge forskellige virkninger af R / NIR-LT bølgelængde på produktionen af ROS. En dosis, der kan nå CNS skrifter følgende transmission gennem overliggende væv ved hjælp af LED-enheder (dvs., 1,78 W / m2 ved 670 nm) 20 sidestilles med 0,03 J / cm2 for et 3 minutters behandling eller 4,9 x 10 14 fotoner / cm2 / s. Lyskilden er udstyret med filtre til at resultere i udledning af 442, 550, 670 eller 830 nm blev derefter kalibreret ved hjælp af kombinationer af neutralfiltre at udsende lige kvantale udgange (fotoner) for hver bølgelængde i modsætning til energi output (J / cm2), og doserne (J / cm2) og intensities i W / m2 beregnet (tabel 2a). En yderligere højere dosis, der var inden for de anbefalede retningslinjer til at stimulere cellulær aktivitet 21 blev også anvendt (1,29 x 10 15 fotoner / cm2 / s), og kalibrering foretaget for hver bølgelængde (tabel 2b).
| Bølgelængde (λ) | Dosis (J / cm ^ 2) | Intensitet (W / m ^ 2) | Emission (Fotoner / cm ^ 2 / s) |
| 442 | 0,057 | 3.21 | 4,8 x 10 ^ 14 |
| 550 | 0,051 | 2.87 | 5,0 x 10 ^ 14 |
| 670 | 0,032 | 1,78 | 4,9 x 10 ^ 14 |
| 830 | 0,018 | 1,01 | 4.9 x10 ^ 14 |
Tabel 2:. Kalibrering af intensiteten af dosis leveret af lige antal fotoner af lys ved forskellige bølgelængder Intensity (W / m 2), dosering for et 3 minutters behandling (J / cm2) og emission (fotoner / cm2 / s) når produktion af xenon lysemitterende 442, 550, 670 og 830 nm er kalibreret til at afgive A) 4.9 x 10 14 fotoner / cm2 / s eller B) 1,3 x 10 15 fotoner / cm2 / s ved en afstand på 14 cm fra lysudbytte.
For at vurdere, om lys leveres af apparatet var toksiske for celler ved de anvendte doser, vurderede vi proteinindholdet tilbage i PC12 cellekultur brønde følgende ROS assays, ved hjælp af en kolorimetrisk proteinanalyse. Der var ingen signifikant tab af protein på nogen af de højere output doseringer af lys (P> 0,05), hvilket indikerer, at doseringen af lys leveres ikke forårsager celledød (Figure 2), og er egnet til brug for vurderinger af oxidativ metabolisme.
Figur 2: Effekt af varierende doser af lys på den totale proteinkoncentration tilbage i dyrkningsbrønde følgende R / NIR-LT og ROS assay. Histogram barer er middelværdien ± SEM proteinkoncentrationer i PC12 celle dyrkningsbrønde, 6 replikater / koncentration, forsøg blev gentaget 3 gange. Der var ingen statistisk signifikante forskelle mellem kontrol og nogen af behandlingsgrupperne som bestemt ved analyse af varians (ANOVA), p> 0,05.
Vi oprindeligt vurderet virkningerne af 670nm lys, der leveres på fluenser spænder fra 0,0085 til 0,38 J / cm2, som et eksempel bølgelængde at vurdere egnetheden af lys indføringsapparat. Ingen signifikant effect af 670 nm lys blev observeret ved nogen af de testede fluenser ved vurderingen enten H 2 O 2 eller DCF fluorescens i PC12, rMC1 eller blandede retinaceller understreget med glutamat (figur 3, P> 0,05). Ligeledes var der ingen signifikante virkninger af varierende bølgelængder af R / NIR-LT leveret ved 4,9 x 10 14 fotoner / cm 2 / s eller 1,3 x 10 15 fotoner / cm 2 / s på ROS produktion ved vurderingen H 2 O 2 eller DCF fluorescens (P> 0,05, data ikke vist). Vores evne til at detektere ændringer i reaktive arter bekræftes af en stigning i fluorescens af DCFH-DA reaktivt farvestof ved 13.44 ± 0,67 mM glutamat til 22.10 ± 2.10 ved 10 mM glutamat. Mens vores data ikke forekommer positive effekter af R / NIR-LT leveres via vores lys levering apparatet ROS produktion i den valgte model systemet hverken var der negative effekter som celler ikke blev kompromitteret, angivet ved vedvarende proteinindhold i kulturbrønde følgende lys terapi (figur 2). Som sådan er den beskrevne fremgangsmåde tilvejebringer en protokol til behandling af celler eller mitokondrier med en defineret dosis af fotoner ved en række bølgelængder og kan anvendes til at vurdere højere doser og alternative effektmål, som kan muliggøre optimering af R / NIR-LT parametre.
Figur 3: Kvantificering af H 2 O 2 (AC) og DCF (DF) fluorescens i PC12 (A, D), rMC1 (B, E) eller blandet retinal celle (C, F) kulturer i nærvær af 10 mM glutamat stressor, efter 670 nm bestråling terapi ved intensitetsniveauer doser 0-0,38 J / cm2. Histogram søjler repræsenterer den gennemsnitlige arbitrære fluorescensenheder / ug protein ± SEM. Der var ingen statistisk signifikantforskelle mellem kontrol og nogen af behandlingsgrupperne som bestemt ved ANOVA, p> 0,05, 6 replikater pr gruppe, blev eksperimenter gentaget 3 gange.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har med succes tilpasset en præcis og kalibreret lys leveringssystem at tilvejebringe en mekanisme til undersøgelse af optimering af R / NIR-LT in vitro. Bølgelængde og intensitet parametre R / NIR-LT er i stand til at blive manipuleret præcist og effektivt ved hjælp af dette system. Vi konstaterede, at lysbehandling af cellerne førte ikke til celledød, selvom ROS ikke blev reduceret ved de bølgelængder og doser først leveres i celletyper testet. De maksimale intensiteter opnås ved den nuværende ordning ved 670 nm (20.11W / m2) er på over tidligere offentliggjorte foranstaltninger af penetrans af bestråling i rottehjernen, hvor 1,17 W / m 2 nåede den ventrale overflade af synsnerven og 0,3 W / m 2 nået den ventrale overflade af hjernen sag. Når leveret i 30 minutter, modtaget af celler af synsnerven in vivo dosis er derfor 0,054-0,31 J / cm2. Doserne af 670 nm lys afgivet i den aktuelle undersøgelse (op til 0.38J / cm2) derfor omfatte dem, der modtages ved hjælp af celler i vores tidligere in vivo studier.
Den mest udbredte teori om R / NIR-LT effekt er, at en photoacceptor system 18, er det derfor bydende nødvendigt at sikre, at celler behandlet med varierende bølgelængder får lige kvantale fluenser af lys (fotoner / cm2 / s) 8. Desuden skal eksponeringstiden anvendes til at levere en bestemt fluens af lys holdes konsistent mellem behandlinger med kun intensiteten af lyset ændrer sig at hæve og sænke den samlede fluens over tid. Tidligere undersøgelser har vist, at en ændring af eksponeringen tid til at levere lige fluenser resulterer i forskelle i resultatmål og kan virke som en forstyrrende element, og hindre identifikation af de optimale bølgelængde / intensitetsniveauer parametre, der kræves for en bestemt skade model 22,23. Som sådan anbefaler vi omhyggelige kalibrering af doseringVed hver undersøgt bølgelængde, for at sikre nyttig optimering af R / NIR-LT.
Den beskrevne teknik tillader levering af lys til en række in vitro modelsystemer herunder organotypiske skive kulturer, hvilket kan resultere i mere meningsfulde resultater på grund af opretholdelsen af cellulære arkitektur og komplekse inter-cellulære interaktioner. Variationer over skaden model kan kræve ulige behandling parametre R / NIR-LT. Denne teknik er begrænset af den maksimale effekt opnås med den beskrevne instrumentering. Kan kræves højere effektudtag for nogle in vitro og mest vivo-anvendelser. Hvis højere output af lys er nødvendige, kan apparatet ændres til at øge intensiteten af lys, der når prøverne. Afkortning afstanden mellem de lette terminerings- og målceller vil øge intensiteten af lys, der når pladen. Alternativt kan lyset reflekteres fra et spejl og på cellerne som opposed at blive filtreret gennem en flydende lysleder dog alternative bølgelængde og neutralfiltre vil være forpligtet til at opnå dette. Højere output ved hjælp af en mere kraftfuld lyskilde vil også blive nødvendig, hvis den metode, der blev tilpasses til levering af R / NIR-LT i in vivo modeller for CNS skade på grund af de øgede doser er nødvendige for at sikre en effektiv penetrans af bestråling 8,20 .
Afslutningsvis aktuelle undersøgelse beskriver en ny fremgangsmåde til let levering, der tilvejebringer et middel til effektivt at ændre intensitet og bølgelængde parametre af lys i R / NIR-LT studier. Denne metode vil være nyttige i optimering af R / NIR-LT anvender en række resultatmål og in vitro skade modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OxiSelect Intracellular ROS Assay Kit (Green Fluorescence) | Cell Biolabs | STA-342 | |
| Amplex UltraRed Reagent | Molecular Probes | A36006 | |
| 300 Watt Xenon Arc Lamp | Newport Corporation | 6258 | Very intense light source, do not look directly into the lamp. Ensure there is sufficient cooling to the lamp whilst it is switched on |
| USB4000-FL Fluorescence Spectrometer | Ocean Optics | ||
| CC-3-UV Cosine Corrector for Emission Collection | Ocean Optics | ||
| 200μm diameter quartz fibre optic | Ocean Optics | ||
| SpectraSuite Spectroscopy Platform | Ocean Optics | ||
| 2300 EnSpire Multimode Plate Reader | Perkin Elmer | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | Acute toxicity, wear gloves when handling. |
| L-Glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | 142-47-2 (anhydrous) | |
| Pheochromocytoma rat adrenal medulla (PC12) cells | American Type Culture Collection | CRL-2522 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI1640) Media | Gibco | 11875-119 | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin | Gibco | 10082-147 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Horse Serum, New Zealand origin | Gibco | 16050-122 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-061 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| 100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140-050 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Retinal Muller (rMC1) cells | University of California, San Diego | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-118 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| 75 cm2 Flasks | BD Biosciences | B4-BE-353136 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | 25988-63-0 | Aliquot and store at -20 °C |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-134 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-049 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Gibco | 23017-015 | Aliquot and store at -20 °C |
| 1X Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| 165U Papain | Worthington | ||
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | W326305 | |
| Corning 96 well plates, clear bottom, black | Corning | CLS3603-48EA | |
| Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates Untreated; Well shape: Round; Sterile. | Costar | 07-200-103 | |
| Seesaw Rocker | Standard lab epuipment | ||
| Centrifuge | Standard lab epuipment | ||
| Neutral Density Filter Paper (0.3) | THORLABS | ||
| 442 nm Bandpass Filter | THORLABS | FL441.6-10 | |
| 550 nm Bandpass Filter | THORLABS | FB550-10 | |
| 670 nm Bandpass Filter | THORLABS | FB670-10 | |
| 810 nm Bandpass Filter | THORLABS | FB810-10e | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.1) | THORLABS | NE01B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.2) | THORLABS | NE02B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.3) | THORLABS | NE03B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.5) | THORLABS | NE05B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.6) | THORLABS | NE06B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (1.0) | THORLABS | NE10B |
References
- Gutterman, D. D. Mitochondria and reactive oxygen species an evolution in function. Circulation research. 97, 302-304 (2005).
- Camello-Almaraz, C., Gomez-Pinilla, P. J., Pozo, M. J., Camello, P. J. Mitochondrial reactive oxygen species and Ca2+ signaling. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 291, C1082-C1088 (2006).
- Kowaltowski, A. J., de Souza-Pinto, N. C., Castilho, R. F., Vercesi, A. E. Mitochondria and reactive oxygen species. Free Radical Biology and Medicine. 47, 333-343 (2009).
- Coyle, J. T., Puttfarcken, P. Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders. Science. 262, 689-695 (1993).
- Doble, A. The role of excitotoxicity in neurodegenerative disease: implications for therapy. Pharmacology & therapeutics. 81, 163-221 (1999).
- Hall, E. D. Antioxidant therapies for acute spinal cord injury. Neurotherapeutics. 8, 152-167 (2011).
- Jia, Z., et al. Oxidative stress in spinal cord injury and antioxidant-based intervention. Spinal Cord. 50, 264-274 (2012).
- Fitzgerald, M., et al. Red/near-infrared irradiation therapy for treatment of central nervous system injuries and disorders. Reviews in the Neurosciences. 24, 205-226 (2013).
- Rutar, M., Natoli, R., Albarracin, R., Valter, K., Provis, J. 670-nm light treatment reduces complement propagation following retinal degeneration. J Neuroinflammation. 9, 257 (2012).
- Eells, J. T., et al. Therapeutic photobiomodulation for methanol-induced retinal toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 3439-3444 (2003).
- Begum, R., Powner, M. B., Hudson, N., Hogg, C., Jeffery, G. Treatment with 670 nm light up regulates cytochrome C oxidase expression and reduces inflammation in an age-related macular degeneration model. PloS one. 8, e57828 (2013).
- Byrnes, K. R., et al. Light promotes regeneration and functional recovery and alters the immune response after spinal cord injury. Lasers in surgery and medicine. 36, 171-185 (2005).
- Liang, H. L., et al. Photobiomodulation partially rescues visual cortical neurons from cyanide-induced apoptosis. Neuroscience. 139, 639-649 (2006).
- Zivin, J. A., et al. Effectiveness and safety of transcranial laser therapy for acute ischemic stroke. Stroke. 40, 1359-1364 (2009).
- Lapchak, P. A. Transcranial near-infrared laser therapy applied to promote clinical recovery in acute and chronic neurodegenerative diseases. Expert review of medical devices. 9, 71-83 (2012).
- Chung, H., et al. The nuts and bolts of low-level laser (light) therapy. Annals of biomedical engineering. 40, 516-533 (2012).
- Wu, Q., et al. Low-Level Laser Therapy for Closed-Head Traumatic Brain Injury in Mice: Effect of Different Wavelengths. Lasers in surgery and medicine. 44, 218-226 (2012).
- Hashmi, J. T., et al. Role of low-level laser therapy in neurorehabilitation. PM&R. 2, S292-S305 (2010).
- Fitzgerald, M., et al. Metallothionein-IIA promotes neurite growth via the megalin receptor. Experimental Brain Research. 183, 171-180 (2007).
- Fitzgerald, M., et al. Near infrared light reduces oxidative stress and preserves function in CNS tissue vulnerable to secondary degeneration following partial transection of the optic nerve. Journal of neurotrauma. 27, 2107-2119 (2010).
- Ando, T., et al. Low-level laser therapy for spinal cord injury in rats: effects of polarization. Journal of biomedical. 18, 098002 (2013).
- Lanzafame, R. J., et al. Reciprocity of exposure time and irradiance on energy density during photoradiation on wound healing in a murine pressure ulcer model. Lasers in surgery and medicine. 39, 534-542 (2007).
- Castano, A. P., et al. Low-level laser therapy for zymosan induced arthritis in rats: Importance of illumination time. Lasers in surgery and medicine. 39, 543-550 (2007).
