Abstract
Rot / Nahinfrarotlicht Therapie (R / NIR-LT) durch Laser- oder Leuchtdiode (LED) geliefert werden, verbessert funktionellen und morphologischen Ergebnisse in einem Bereich des zentralen Nervensystems Verletzungen in vivo, ggf. durch Reduzierung von oxidativem Stress. Jedoch Wirkungen von R / NIR-LT auf oxidativen Stress wurde gezeigt abhängig von der Wellenlänge oder der Intensität der Bestrahlung ab. Studien zum Vergleich der Behandlungsparameter fehlen, aufgrund der Abwesenheit von im Handel erhältlichen Geräten, die mehrere Wellenlängen und Intensitäten, geeignet für Hochdurchsatz-in-vitro-Optimierungsstudien liefern. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Abgabe von Licht in einem Bereich von Wellenlängen und Intensitäten der therapeutischen Dosis für eine gegebene Verletzungsmodell erforderlich optimieren. Wir nahmen an, dass eine Methode der Bereitstellung von Licht, in dem Wellenlängen- und Intensitätsparameter könnte leicht geändert werden könnten Bestimmung einer optimalen Dosis von R / NIR-LT zur Reduzierung reaktiver Sauerstoffspezies zu erleichtern(ROS) in vitro.
Nichtkohärenten Xenon-Licht wurde mit Schmalband-Interferenz-Filter filtriert, um unterschiedlicher Wellenlänge (Mittenwellenlängen von 440, 550, 670 und 810 nm) und Fluenzen liefern (8,5 x 10 -3 bis 3,8 x 10 -1 J / cm 2) der Licht auf kultivierte Zellen. Lichtausbeute aus der Vorrichtung wurde kalibriert, um therapeutisch relevante, gleich Quanten Dosen von Licht bei jeder Wellenlänge emittieren. Reaktive Spezies nachgewiesen in Glutamat gestreßten Zellen mit Licht behandelt, mit DCFH-DA und H 2 O 2 sensitive Fluoreszenzfarbstoffe.
Wir haben erfolgreich geliefert Licht bei einer Reihe von physiologisch und therapeutisch relevanten Wellenlängen und Intensitäten, um kultivierte Zellen zu Glutamat als Modell der ZNS-Verletzung ausgesetzt. Während die Einflüsse von R / NIR-LT in der vorliegenden Studie verwendet nicht eine Wirkung auf ROS durch die kultivierten Zellen erzeugten ausübt, ist das Verfahren der Lichtabgabe auf andere systems einschließlich Einzel Mitochondrien oder mehrere physiologisch relevanten organotypischen Kulturmodellen und könnte verwendet werden, um Auswirkungen auf eine Reihe von Zielkriterien des oxidativen Stoffwechsels zu bewerten.
Introduction
Für eine Reihe von Signalwegen und normale Reaktionen des Zellstoffwechsels, einschließlich der Neuroprotektion 1 sind reaktive Sauerstoffspezies (ROS) erforderlich. Wenn jedoch endogenen antioxidativen Mechanismus nicht in der Lage, die Produktion von ROS zu steuern, Zellen gegenüber oxidativem Stress 2,3 erliegen. Nach Verletzung des ZNS, werden die damit verbundenen Anstieg in Gegenwart von ROS und oxidativer Stress vermutlich eine wesentliche Rolle bei der Progression der Schädigung 4,5 spielen. Trotz der umfangreichen Reihe von Strategien zur Abschwächung oxidativen Stress, die beurteilt wurden, gibt es noch keine vollständig wirksam, klinisch relevante antioxidativen Strategien zur Dämpfung von ROS-Produktion und die damit verbundenen oxidativen Stress in der klinischen Anwendung folgende Neurotrauma 6. Deshalb ist die Abschwächung des oxidativen Stress bleibt ein wichtiges Ziel für die therapeutische Intervention 7.
Verbesserungen folgening R / NIR-LT sind in einer Vielzahl von Verletzungen und Erkrankungen einschließlich Senkung der kardialen Infarktgröße, renale und hepatische Komplikationen bei Diabetes, Netzhautdegeneration, ZNS-Verletzung und Schlaganfall 8, vielleicht durch die Reduzierung von oxidativem Stress berichtet. Insbesondere im Hinblick auf ZNS-Verletzung, haben präklinische Studien der Wirksamkeit von 670 nm Licht gute Effekte in Modellen der Netzhautdegeneration 9-11, Verletzungen des Rückenmarks 12, neuronalen Tod 13 gezeigt. Klinische Studien haben für trockene altersbedingte Makuladegeneration durchgeführt worden und werden derzeit für einen Schlaganfall 14, aber die Ergebnisse dieser Studien nicht vielversprechend erscheinen, möglicherweise aufgrund eines Fehlers zu einer wirksamen Behandlung beschäftigen Parameter 15. Als solche R / NIR-LT, nicht sehr stark im Rahmen der normalen klinischen Praxis bei Neurotrauma angenommen, obwohl sie eine leicht zu verwalten, nicht-invasive und relativ kostengünstige Behandlung. Hindernisse für klinische Umsetzung gehören der Mangel an einem clAnfang verstanden Wirkmechanismus und das Fehlen eines standardisierten effektiven Behandlungsprotokoll 16,17. Aktuelle Literatur in Bezug auf die Lichttherapie zeigt eine Fülle von Variationen in der Behandlungsparameter in Bezug auf Strahlungsquellen (LED oder Laser), Wellenlänge (zB 630, 670, 780, 810, 830, 880, 904nm) Gesamtdosis (Joule-Bestrahlung / Flächeneinheit), Dauer (Belichtungszeit), Zeitpunkt (vor oder nach dem Insult), Behandlungshäufigkeit und Art der Lieferung (Puls oder kontinuierlich) 8. Die Variabilität der Behandlungsparameter zwischen den Studien einen Vergleich schwierig und hat zu Skepsis gegenüber der Wirksamkeit 16 beigetragen.
Daher wird die Optimierung der R / NIR-LT eindeutig erforderlich, mit Zellkultursystemen, die zur High-Throughput-Screening-Mechanismus notwendig, um die mehreren Variablen zu vergleichen ist. Allerdings gibt es nur wenige handelsübliche Beleuchtungssysteme, die eine ausreichende Flexibilität und Kontrolle über wa bieten kannvelength und Intensität, solche Optimierungsversuche durchzuführen. Kommerziell erhältliche LED-Vorrichtungen sind im Allgemeinen nicht in der Lage, mehrere Wellenlängen oder Intensitäten, was Forscher die mehrere LED-Vorrichtungen von unterschiedlichen Herstellern, die nicht nur in der Intensität variieren kann, zu liefern, sondern auch das Spektrum der Wellenlänge des emittierten Lichts. Wir haben dieses Problem durch Verwendung eines Breitband-Xenon-Lichtquelle durch schmalbandige Interferenzfilter gefiltert, wodurch eine Reihe von Wellenlängen und Energiedichten von Licht, so dass in der Nähe, eine genaue Kontrolle der Parameter des R / NIR-LT gerichtet.
Es ist wichtig zu beachten, dass die therapeutische Dosis der Behandlung wird durch die Anzahl der Photonen, die Interaktion mit dem photoacceptor (Chromophor), die im Fall von R / NIR-LT wird postuliert, Cytochrom c Oxidase (COX) 18 werden definiert. Photonenenergie geliefert mit der Wellenlänge variiert; dh gleiche Dosen von Energie bei verschiedenen Wellenlängen werden comvon unterschiedlichen Anzahlen von Photonen geschätzt. Daher wurde das Licht von der Vorrichtung emittiert wird kalibriert, um eine gleiche Anzahl von Photonen für jede der gewählten Wellenlängen zu prüfenden emittieren. Wir haben ein System, das verwendet werden kann, um R / NIR-LT in einem Bereich von Wellenlängen und Intensitäten zu Zellen in vitro zu liefern entwickelt und demonstriert die Fähigkeit, die Wirkungen des gelieferten R / NIR-LT auf ROS-Produktion in Zellen unterworfen zu messen Glutamat Stress.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Optische Kalibrierung: Messlichtleistung
- Um die Lichtabgabevorrichtung vorzubereiten, schließen Sie eine Breitbandlichtquelle (zB Xenon oder Wolframlampe) an eine geeignete Stromversorgung. Positionieren einer kollimierenden Linse vor der Lichtquelle, um einen kollimierten Lichtstrahl zu erzeugen. Passieren die Licht durch ein flüssiges Wärmefilter den größten Teil der Wärme aus dem Lichtstrahl zu entfernen. Abhängig von der Anwendung, den Schwerpunkt des kollimierten Strahls auf die Eintrittsöffnung eines Flüssigkeitslichtleiters, der für eine flexiblere Abgabe des Lichts (z. B. in einen Inkubator) liefert.
- Am anderen Ende des Flüssigkeitslichtleiter einsetzen, eine zweite Kollimatorlinse und eine Halterung für die Interferenz und Neutralfilter. Überprüfen Sie, ob diese Anordnung erzeugt eine gleichmäßig ausgeleuchtet Lichtpunkt des gewünschten Wellenbereich und Intensität.
Hinweis: Der Abstand zwischen dem Ende des Lichtleiters und der Objektebene muss je nach zu variierendie Fläche, die beleuchtet werden muss, sondern daran, dass, wenn der Abstand von dem Ende der Lichtführung zunimmt, werden die Lichtintensität zu verringern. In der vorliegenden Studie ist dieser Abstand 14cm und erzeugt einen Strahlquerschnitt, die gleichmäßig beleuchtet eine 3x3-Muldenbereich auf einem 96-Well-Platte. - Darauf achten, dass Streulicht von der Lampe und die damit verbundenen optischen Komponenten nicht in der Lage, um die Probe zu erreichen.
- Schalten Sie den Wasserkühler für das flüssige Wärmefilter und sicherzustellen, dass es den Austausch von Wasser durch den Filtermantel. Schalten die Lampe Stromquelle und eine Wartezeit von mindestens 5 min für die Breitband-Lichtquelle zu stabilisieren. Anmerkung: Die Verwendung des Wasserkühlers ist erforderlich, um ein Überhitzen der Vorrichtung zu verhindern.
- Wählen eines Schmalbandinterferenzfilter (in der Regel durch ihre Mittenwellenlänge, Spitzendurchlässigkeit und die Halbwertsbreite (FWHM) Bandbreite beschrieben), um den gewünschten Wellenbereich der Beleuchtung zu erzeugen. Anmerkung: Die in der vorliegenden Studie verwendete schmalbandige Interferenzfilter sind 442 nm, 550 nm, 671 nm und 810 nm.
- Messen Sie die von der Lampe auf der Ebene, in der die Probe während der Behandlung positioniert werden erzeugte Licht. Gemessen unter Verwendung eines kalibrierten Lichtstrahlungssonde (Kosinus Kollektor) mit einem geeigneten Spektroradiometer verbunden, mit Anstand Software entsprechend den Anweisungen des Herstellers.
- Verwenden Neutralfilter, um die Intensität des Lichts einzustellen, bis die gewünschte Ausgabe erhalten wird. Anmerkung: In der vorliegenden Arbeit wird die Intensität des von jedem Interferenzfilter geleitet eingestellt, um eine gleiche Quantenausgang an jedem der vier Behandlungswellenbänder zu ergeben. Es ist wichtig, um die Kalibrierung regelmäßig zu überprüfen, da die Lampenleistung kann sich ändern.
Anmerkung: Nach dem Aufbau der Vorrichtung, sind die Zellen bereit, beleuchtet werden: Figur 1 eine Darstellung der Lichtabgabevorrichtung in der vorliegenden Studie verwendet..
Abbildung 1. Bild des Lichtabgabevorrichtung. Dargestellt sind die Lichtenergiequelle, Xenon-Lampe mit Gehäuse, Sammellinse, Wasserfilter, Eingangsöffnung, Flüssigkeitslichtleiter, der zweite Kollimationslinse, Filterhalter, Behandlung Rahmen und mattschwarz Karte. Man beachte, dass das schmalbandige Wellenlänge und Intensität Filter sind nicht dargestellt.
2. Zellpräparation
- Die beschriebene R / NIR-LT Liefermethode kann zu jedem Zelltyp oder in vitro Modellsystem verwendet werden; als solche die folgenden Beschreibungen der Zellkultur allgemeinen unter Verwendung wohlbekannter Techniken zur Kultur Phäochromocytom (PC12), Müller (RMC1) und primären gemischten Retinazellen.
- Vor der Zellaussaat zur Lichtbehandlung und oxidativer Stress Assay immortalisierten Kulturzellen in der jeweiligen Wachstumsmedien, die geeignete Ergänzungsmittel (z. B. FBS, Antibiotika) in T75 flasks, bis 70-80% konfluent.
- Lösen immortalisierten Zellen aus T75-Kolben unter Verwendung des Verfahrens für den Zelltyp geeignet z getestet werden. Trypsin. Falls erforderlich, bevor mit der Aussaat der Zellen in 96-well-Assayplatten fortfällt Vertiefungen der Assayplatte mit 10 ug / ml Poly-L-Lysin für 1 h (z. B. für PC12-Zellen) oder 10 ug / ml Poly-L-Lysin 1h mit einem O / N-Inkubation mit 10 ug gefolgt / ml Laminin (z. B. für Mischnetzhautzellen).
- Zentrifugenzellen entsprechend zu sammeln (z. B. 3 min bei 405 · g für PC12-Zellen oder 10 min bei 218 × g für RMC1 Zellen), Entfernen des Überstandes und Resuspension in 8 ml der geeigneten Zellkulturmedien.
- Wenn gemischt Netzhautzellen zu verwenden sind, bereiten von P0-5 neonatalen Rattenjungen durch enzymatischen Abbau (Papain) nach festgelegten Verfahren 19
- Die Anzahl der lebensfähigen Zellen mit Ausnahme von 0,4% (w / v) Trypanblau unter Verwendung eines Hämozytometers.
- Passen Zelldichte such, die Zellen werden etwa 70 bis 80% konfluent nach 24 oder 48 Stunden in Kultur. (Für PC12-Zellen die Aussaatdichte von 4,0 x 10 5 lebensfähigen Zellen / ml, für RMC1 Zellen ist es 2,5 x 10 5 lebensfähige Zellen / ml und bei Zusammenretinazellen ist 8 x 10 5 lebensfähige Zellen / ml). Nach der Zugabe von Zellen, entweder klar oder schwarze 96-Well-Platten (für die H 2 O 2 oder DCFH-DA Assay jeweils verwendet werden), in 100 ul des geeigneten Wachstumsmedien, lassen Sie die Platte auf eine flache Oberfläche bei 37 ° C, 5 sitzen % CO 2 (oder welche Bedingungen angemessen sind für den spezifischen Zelltyp) für mindestens 24 h auf die Zellhaftung zu ermöglichen.
- Kulturzellen in einem Wachstumsmedium in das entsprechende 96-Well-Schalen, bis sie 70-80% konfluent (24h für PC12 und RMC1 Zellen 48h für Mischnetzhautzellen).
3. Hinzufügen Glutamat Stressor zu Zellen
- Bereiten L-Glutaminsäure Mononatriumsalz-Hydrat Stressor Konzentrationen von 0-10mm in entsprechenden Voll wachsenth Kulturmedien.
- Entfernen Sie das Medium aus den Zellen und vorsichtig waschen Zellen 3 mal mit PBS (PC12) oder HBSS (RMC1 und gemischte Netzhautzellen). Nach Wäschen hinzuzufügen Glutamat enthaltenden Medien auf ein Gesamtvolumen von 100 ul / Vertiefung.
4. Erste-Dosierungen von Lichtbehandlung
- Unmittelbar nach der Zugabe von Glutamat oder Stressor der Wahl, aussetzen Zellen Lichtbehandlung bei den gewünschten Wellenlängen und Intensitäten, indem Sie unter der vorbereiteten Lichtabgabevorrichtung. Achten Sie darauf, die Quanten Ausgang des Lichtstrahls mit den etablierten Kombinationen von Graufilter in Abhängigkeit von der Wellenlänge verabreicht ändern.
Hinweis: In den aktuellen Experimenten ausgesetzt Zellen Lichtbehandlung für 3 Minuten die Temperatur zu halten, indem die 96-Well-Platten auf einer 37 ° C Wärmepolster ruht. Behandlungszeit kann je nach Bedarf variiert werden.- Legen Sie eine matte schwarze Karte unter den Zellen, um Licht zu verhindern reflektieren in benachbarten Vertiefungen in der 96-well Fach für andere Behandlungsparameter bezeichnet.
- Wird die Behandlung über längere Zeiträume gewünscht, fügen 25 mM Hepes-Puffer, um den pH der Zellkulturmedien erhalten oder im Idealfall stellen die Vorrichtung und das Behandlungs Platten in einem Inkubator mit CO & sub2; -Konzentration von 5% CO 2 reguliert wird, oder Bedingungen, die optimal sind, für den spezifischen Zelltyp.
- Nach Abschluss der Lichtbehandlung, legen Sie die Zellen auf einer ebenen Fläche und bei 37 ° C und 5% CO 2 (oder was auch immer Bedingungen sind optimal für den Zelltyp) für 24 Stunden.
Anmerkung: Zusätzliche Dosierungen von R / NIR-LT kann wie oben beschrieben nach Wunsch verabreicht werden.
5. Schluss Dosierung des Lichts Behandlung und Erkennung von ROS
- Vor der Durchführung der Endrunde der Lichtbehandlung, bereiten die Reagenzien für ROS Erkennung verwendet werden. Vorbereitung 50 mM Citratpuffer (pH 6,0), Triton X100, und H 2 O 2 Nachweisreagenz ArbeitsLösung (1: 2: 97-Verhältnis von 10 mM H 2 O 2 Nachweisreagenz Stammlösung; 10 U / ml Meerrettichperoxidase; 50 mM Natriumcitrat (pH 6,0)). Bereiten DCFH-DA bei einer Endkonzentration von 100 uM in geeigneten Medien.
Hinweis: DCFH-DA-Reagenz für PC12-Zellen in RPMI-Medium, DCFH-DA-Reagenz für RMC1 Zellen in DMEM-Medium. Beachten Sie, dass im Handel erhältliche Nachweisreagenzien sind Differenz Empfindlichkeiten auf bestimmte ROS und Reagenzien sollte sorgfältig ausgewählt werden, um die für eine einzelne Anwendung gewünschten Informationen zu liefern. - Verabreichen Lichtbehandlung zu den Zellen, wie in Schritt 4.1-4.1.2 beschrieben. Achten Sie darauf, die Zellen werden mit den gewünschten Einflüsse / Wellenlängen von Licht behandelt.
- Unmittelbar nach der Lichtbehandlung, entfernen Sie die glutamathaltigen Medien und waschen zweimal mit geeigneten Pufferlösung (bei PC12-Zellen, PBS verwendet wird und für RMC1 Zellen, HBSS verwendet wird). Führen Sie die ROS-Assays auf die Zellen wie folgt:
- H 2 O 2 2 für 15 min. In 50 ul H 2 O 2 Erkennung Arbeitslösung und Inkubation für 30 min bei RT. Messen Fluoreszenz unter Verwendung eines Plattenlesegeräts mit einer Anregungswellenlänge von 530 nm und einer Emissionswellenlänge von 480 nm.
- DCF-Assay: 100 l der 100 & mgr; M Lösung von DCFH-DA, um jede der Vertiefungen und Inkubieren für 30 Minuten bei 37 ° C und 5% CO 2. Druckmaterial, das 100 uM DCFH-DA und wasche mit geeigneten Pufferlösung (wie oben beschrieben) zweimal. Hinzufügen von 90 ul Pufferlösung und 10 ul Triton X100 zu jeder der Vertiefungen und vorsichtig Schütteln auf einem Orbitalschüttler für 30 Sekunden vor dem 15-minütigen Inkubation bei 37 ° C. Messen DCF ableiten Fluoreszenz unter Verwendung eines Plattenlesegeräts mit einer Anregungswellenlänge von 480 nm und einer Emissions wavelength von 530 nm.
- Express ROS Werte bezogen auf die Proteinkonzentration der Zellen in den Wells verbleibende, unter Verwendung eines kolorimetrischen Kits zur Proteinkonzentration quantifiziert gemäß den Anweisungen des Herstellers, unter Bezugnahme auf eine Standardkurve auf mg Protein berechnet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Der Ausgang von Licht bei einer Wellenlänge von 670 nm abgegeben wurde mit Neutraldichtefiltern, um Zellen mit einer Reihe von Fluenzen umfassend eine Dosis eines zuvor gezeigt vorteilhaft in vivo (0,3 J / cm 2) 20 bis 670 nm sein, Licht zu bestrahlen kalibriert. Da die Zahl der Neutralfilter vor der Lichtquelle erhöht wird, die Intensität (W / m 2) verringert, so dass weniger Licht auf den Zielbereich passieren. In Tabelle 1 sind die Kalibrierungsdaten von 670nm Licht von der Lichtquelle mit einem Wellenlängenfilter ausgestattet erzeugt und enthält die Anzahl der verwendeten ND-Filter und die Intensität des Lichts als Ergebnis erzeugt wird, bei beschriebenen Abständen von der Lichtausbeute. Fluenz oder Dosis von 670 nm-Licht (J / cm 2), wurde aus der Gleichung berechnet: [Dosis (J / cm 2) = (Lichtstärke (W / m 2) / 10000) x Zeit (s)], wobei die Behandlungszeit betrug 180 Sekunden.
| Anzahl der ND-Filter | Entfernung vom Lichtleistung (cm) | Intensität (W / m ^ 2) | Dosis (J / cm ^ 2) |
| 0 | 10.5 | 20,11 | 0.38 |
| 0 | 14 | 10,55 | 0.19 |
| 1 | 14 | 4,91 | 0,075 |
| 2 | 14 | 2.28 | 0,041 |
| 3 | 14 | 1.03 | 0,018 |
| 4 | 14 | 0.47 | 0,0085 |
| 5 | 14 | 0,21 | 0,0038 |
| 6 | 14 | 0,094 | 0,00169 |
| 7 | 14 | 0,045 | 0,00081 |
| 8 | 14 | 0,021 | 0.000378 |
| 9 | 14 | 0,013 | 0.000234 |
Tabelle 1: Ausgangssignal der Lichtabgabevorrichtung mit dem Wellenlängenfilter 670nm .Anzahl von ND-Filtern ausgestattet sind, bezieht sich auf die Anzahl der Neutralfilter auf der Vorderseite des Lichtquellenausgang ausgestattet. Intensität (W / m 2) bezeichnet die Intensität des Lichts, wie durch th gemeldete proprietären Software. Fluenz oder Dosis wurde durch die Gleichung [Dosis (J / cm 2) = (Lichtstärke (W / m 2) / 10000) x Zeit (s)], wobei die Belichtungszeit war 180 Sekunden und die Entfernung von der Lichtquelle berechnet wird 10,5 oder 14 cm.
Zwei klinisch relevanten Quanten Einflüsse von Licht wurden ausgewählt, um unterschiedliche Effekte des R / NIR-LT Wellenlänge auf die Produktion von ROS zu untersuchen. Eine Dosis, die ZNS-Verträge nach der Übertragung durch den Einsatz von LED-Geräten darüber liegende Gewebe erreichen kann (dh 1,78 W / m 2 bei 670 nm) 20 bis 0,03 J / cm 2 gleichgesetzt für ein 3 min Behandlung oder 4,9 x 10 14 Photonen / cm 2 / s. Die Lichtquelle mit Filtern ausgerüstet, um in der Emission von 442 ergeben, 550, 670 nm oder 830 nm wurde dann unter Verwendung von Kombinationen von neutralen Dichtefiltern der Gleich quantal Ausgänge (Photonen) für jede Wellenlänge zu emittieren, im Gegensatz zu Energieausgänge (J / cm 2) kalibriert wird, und die Dosierungen (J / cm 2) und intensities in W / m 2, berechnet (Tabelle 2a). Eine zusätzliche höhere Dosis, die innerhalb der empfohlenen Richtlinien war zur Stimulierung zellulärer Aktivität 21 wurde auch verwendet (1,29 x 10 15 Photonen / cm 2 / s), und die Kalibrierung für jede Wellenlänge durchgeführt (Tabelle 2b).
| Wellenlänge (λ) | Dosis (J / cm ^ 2) | Intensität (W / m ^ 2) | Emission (Photonen / cm ^ 2 / s) |
| 442 | 0,057 | 3.21 | 4,8 x 10 ^ 14 |
| 550 | 0,051 | 2.87 | 5,0 x 10 ^ 14 |
| 670 | 0,032 | 1.78 | 4,9 x 10 ^ 14 |
| 830 | 0,018 | 1.01 | 4,9 x10 ^ 14 |
Tabelle 2:. Kalibrierung der Intensität der Dosis um die gleiche Anzahl von Photonen des Lichtes bei unterschiedlichen Wellenlängen gelieferten Intensität (W / m 2), die Dosierung für einen 3 min Behandlung (J / cm 2) und Emission (Photonen / cm 2 / s) wenn der Ausgang von Xenon lichtemittierende 442, 550, 670 und 830 nm werden kalibriert, um in einem Abstand von 14 cm von der zu emittieren A) 4,9 x 10 14 Photonen / cm 2 / s oder B) 1,3 × 10 15 Photonen / cm 2 / s Lichtleistung.
Um zu beurteilen, ob das Licht von der Vorrichtung geliefert wurde für Zellen toxisch in den verwendeten Dosierungen untersuchten wir den Proteingehalt in PC12-Zellkulturschalen nach den ROS Assays restlichen, unter Verwendung eines kolorimetrischen Proteinassay. Es gab keinen signifikanten Verlust an Protein bei einem höheren Ausgangs Dosierungen des Lichts (P> 0,05), was darauf hinweist, dass die Lichtdosis geliefert wurde nicht verursacht Zelltod (FigurE 2) und ist angebracht, für die Beurteilung der oxidativen Stoffwechsel zu verwenden.
Figur 2: Wirkung verschiedener Dosen von Licht auf in Kulturvertiefungen folgenden R / NIR-LT und ROS Assay verbleibenden Gesamtproteinkonzentration. Histogrammbalken stellen den Mittelwert ± SEM Proteinkonzentrationen in PC12-Zellkulturvertiefungen, 6 Wiederholungen / Konzentration Versuche wurden 3-mal wiederholt. Es gab keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen Kontrolle und jede der Behandlungsgruppen, wie durch Analyse der Varianz (ANOVA), p> 0,05 bestimmt.
Wir untersuchten zunächst die Wirkungen von 670 nm-Licht, bei Fluenzen Bereich von 0,0085 bis 0,38 J / cm 2 geliefert wird, als Beispiel Wellenlängen, um die Eignung des Lichtabgabevorrichtung zu beurteilen. Keine signifikante effect von 670nm Licht wurde bei keiner der getesteten Fluenzen wurde bei der Bewertung entweder H 2 O 2 oder DCF-Fluoreszenz in PC12, RMC1 oder Mischretinazellen betont mit Glutamat (Abbildung 3, P> 0,05). Ebenso gibt es keine signifikanten Wirkungen verschiedener Wellenlängen von R / NIR-LT bei 4,9 x 10 14 Photonen geliefert / cm 2 / s oder 1,3 × 10 15 Photonen / cm 2 / s auf ROS-Produktion, bei der Beurteilung von H 2 O 2 oder DCF-Fluoreszenz (P> 0,05, Daten nicht gezeigt). Die Fähigkeit, Änderungen in reaktive Spezies zu detektieren ist durch einen Anstieg der Fluoreszenz der DCFH-DA Reaktivfarbstoff bei 13,44 ± 0,67 mM Glutamat 22,10 ± 2,10 bei 10 mM Glutamat bestätigt. Während unsere Daten weisen nicht auf positive Effekte von R / NIR-LT geliefert mit unserem Lichtabgabevorrichtung auf ROS-Produktion in dem ausgewählten Modellsystem, noch gab es negative Auswirkungen, wie Zellen wurden nicht beeinträchtigt, durch anhaltende Proteingehalt in der Kultur angedeutetBrunnen folgenden Licht-Therapie (Abbildung 2). Somit stellt das beschriebene Verfahren ein Protokoll für die Behandlung von Zellen oder Mitochondrien mit einer definierten Dosis von Photonen in einem Wellenlängenbereich und kann verwendet werden, um höhere Dosierungen und alternativen Zielparameter, die Optimierung der R / NIR-LT Parameter ermöglichen können, beurteilt werden.
Abbildung 3: Quantifizierung von H 2 O 2 (AC) und DCF (DF) Fluoreszenz in PC12 (A, D), RMC1 (B, E) oder gemischte Retinazelle (C, F) Kulturen in Gegenwart von 10 mM Glutamat Stressor folgende 670nm Bestrahlungstherapie bei Fluenz Dosen zwischen 0 bis 0,38 J / cm 2. Histogrammbalken stellen den Mittelwert willkürlichen Fluoreszenzeinheiten / ug Protein ± SEM. Es gab keinen statistisch signifikantenUnterschiede zwischen Kontrolle und jede der Behandlungsgruppen, wie durch ANOVA, p> 0,05, 6 bestimmt Replikate pro Gruppe wurden Versuche 3 mal wiederholt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wir haben erfolgreich eine genaue und kalibrierte Lichtabgabesystem geeignet ist, einen Mechanismus für die Studie zur Optimierung der R / NIR-LT in vitro bereitzustellen. Wellenlängen- und Intensitätsparameter R / NIR-LT der Lage sind, mit diesem System genau und effektiv bearbeitet werden. Wir haben festgestellt, dass das Licht die Behandlung der Zellen nicht zum Zelltod führen, wenn auch ROS nicht bei den Wellenlängen und Dosierungen geliefert reduziert, in den getesteten Zelltypen. Höchstintensitäten nach dem derzeitigen System bei 670 nm (20.11W / m 2) erreicht werden, die über der bisher veröffentlichten Maßnahmen der Penetranz der Bestrahlung in die Rattenhirn, wo 1,17 W / m 2 erreichte die Bauchseite des Sehnervs und 0.3W / m 2 erreichte die ventralen Oberfläche des Gehirns Fall. Wenn für 30 min gestellt, die durch Zellen des Sehnervs in vivo erhaltene Dosis daher 0,054 bis 0,31 J / cm 2. Die Dosen der in der aktuellen Studie lieferte 670 nm Licht (bis 0.38J / cm 2) umfassen daher jene, die von Zellen in unseren früheren Untersuchungen in vivo erhalten.
Die am weitesten akzeptierte Theorie R / NIR-LT Wirksamkeit ist die eines photoacceptor basierten Systems 18, deshalb ist es zwingend erforderlich, um zu gewährleisten, dass die Zellen mit unterschiedlichen Wellenlängen behandelt werden, erhalten gleich quantal Fluenzen von Licht (Photonen / cm 2 / s) 8. Zusätzlich muss die Belichtungszeit für einen bestimmten Fluenz von Licht liefern konsistent zwischen Behandlungen gehalten werden, wobei nur die Intensität des Lichts verändert zu erhöhen und zu verringern Gesamtfluenz über die Zeit. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Veränderung der Belichtungszeit auf gleichen Einflüsse führt zu Unterschieden in Zielparameter zu liefern und kann als Störfaktor wirken, und behindern die Identifizierung der für einen bestimmten Verletzungsmodell 22,23 erforderliche optimale Wellenlänge / Einfluss Parameter. Als solches empfehlen wir die sorgfältige Kalibrierung der Dosierungbei jeder Wellenlänge getestet, um nützliche Optimierung der R / NIR-LT zu gewährleisten.
Die beschriebene Technik ermöglicht das Einbringen von Licht auf einen Bereich der in vitro-Modellsysteme, einschließlich organotypischen Kulturen, die in sinnvoller Ergebnisse aufgrund der Erhaltung der zellulären Architektur und komplexe interzelluläre Wechselwirkungen führen kann. Variationen über das Verletzungsmodell erfordern unterschiedliche Behandlung Parameter des R / NIR-LT. Diese Technik ist durch die maximale Leistungsabgabe erreicht werden mit dem beschriebenen Gerät beschränkt. Höhere Leistungen können für einige in vitro als auch in vivo die meisten Anwendungen benötigt werden. Wenn höhere Leistungen von Licht erforderlich sind, kann die Vorrichtung verändert werden, um die Intensität des Lichts, das die Proben zu erhöhen. Verkürzen des Abstands zwischen den Lichtabschluss und Zielzellen wird die Intensität des Lichts, das die Platte zu erhöhen. Alternativ kann das Licht von einem Spiegel und auf die Zellen, wie oppo widerspiegelnauf, die durch einen Flüssigkeitslichtleiter gefiltert sed jedoch alternative Wellenlänge und Neutralfilter wird benötigt, um dies zu erreichen. Höhere Leistungen mit einer stärkeren Lichtquelle wäre erforderlich, wenn das Verfahren wurden für die Lieferung von R angepaßt werden kann / NIR-LT in in vivo Modellen von ZNS-Verletzung, wegen der erhöhten benötigten Dosierungen wirksam Penetranz Bestrahlung 8,20 sichergestellt .
Zusammenfassend ist die vorliegende Studie beschreibt ein neuartiges Verfahren zur Lichtabgabe, die ein Mittel zur wirksamen Veränderung Intensität und Wellenlänge Parameter des Lichts in R / NIR-LT Untersuchungen bietet. Diese Methode wird bei der Optimierung der R / NIR-LT unter Verwendung einer Reihe von ergebnisorientierten Maßnahmen und In-vitro-Verletzungen Modelle nützlich sein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OxiSelect Intracellular ROS Assay Kit (Green Fluorescence) | Cell Biolabs | STA-342 | |
| Amplex UltraRed Reagent | Molecular Probes | A36006 | |
| 300 Watt Xenon Arc Lamp | Newport Corporation | 6258 | Very intense light source, do not look directly into the lamp. Ensure there is sufficient cooling to the lamp whilst it is switched on |
| USB4000-FL Fluorescence Spectrometer | Ocean Optics | ||
| CC-3-UV Cosine Corrector for Emission Collection | Ocean Optics | ||
| 200μm diameter quartz fibre optic | Ocean Optics | ||
| SpectraSuite Spectroscopy Platform | Ocean Optics | ||
| 2300 EnSpire Multimode Plate Reader | Perkin Elmer | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | Acute toxicity, wear gloves when handling. |
| L-Glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | 142-47-2 (anhydrous) | |
| Pheochromocytoma rat adrenal medulla (PC12) cells | American Type Culture Collection | CRL-2522 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI1640) Media | Gibco | 11875-119 | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin | Gibco | 10082-147 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Horse Serum, New Zealand origin | Gibco | 16050-122 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-061 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| 100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140-050 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Retinal Muller (rMC1) cells | University of California, San Diego | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-118 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| 75 cm2 Flasks | BD Biosciences | B4-BE-353136 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | 25988-63-0 | Aliquot and store at -20 °C |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-134 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-049 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Gibco | 23017-015 | Aliquot and store at -20 °C |
| 1X Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| 165U Papain | Worthington | ||
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | W326305 | |
| Corning 96 well plates, clear bottom, black | Corning | CLS3603-48EA | |
| Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates Untreated; Well shape: Round; Sterile. | Costar | 07-200-103 | |
| Seesaw Rocker | Standard lab epuipment | ||
| Centrifuge | Standard lab epuipment | ||
| Neutral Density Filter Paper (0.3) | THORLABS | ||
| 442 nm Bandpass Filter | THORLABS | FL441.6-10 | |
| 550 nm Bandpass Filter | THORLABS | FB550-10 | |
| 670 nm Bandpass Filter | THORLABS | FB670-10 | |
| 810 nm Bandpass Filter | THORLABS | FB810-10e | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.1) | THORLABS | NE01B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.2) | THORLABS | NE02B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.3) | THORLABS | NE03B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.5) | THORLABS | NE05B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.6) | THORLABS | NE06B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (1.0) | THORLABS | NE10B |
References
- Gutterman, D. D. Mitochondria and reactive oxygen species an evolution in function. Circulation research. 97, 302-304 (2005).
- Camello-Almaraz, C., Gomez-Pinilla, P. J., Pozo, M. J., Camello, P. J. Mitochondrial reactive oxygen species and Ca2+ signaling. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 291, C1082-C1088 (2006).
- Kowaltowski, A. J., de Souza-Pinto, N. C., Castilho, R. F., Vercesi, A. E. Mitochondria and reactive oxygen species. Free Radical Biology and Medicine. 47, 333-343 (2009).
- Coyle, J. T., Puttfarcken, P. Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders. Science. 262, 689-695 (1993).
- Doble, A. The role of excitotoxicity in neurodegenerative disease: implications for therapy. Pharmacology & therapeutics. 81, 163-221 (1999).
- Hall, E. D. Antioxidant therapies for acute spinal cord injury. Neurotherapeutics. 8, 152-167 (2011).
- Jia, Z., et al. Oxidative stress in spinal cord injury and antioxidant-based intervention. Spinal Cord. 50, 264-274 (2012).
- Fitzgerald, M., et al. Red/near-infrared irradiation therapy for treatment of central nervous system injuries and disorders. Reviews in the Neurosciences. 24, 205-226 (2013).
- Rutar, M., Natoli, R., Albarracin, R., Valter, K., Provis, J. 670-nm light treatment reduces complement propagation following retinal degeneration. J Neuroinflammation. 9, 257 (2012).
- Eells, J. T., et al. Therapeutic photobiomodulation for methanol-induced retinal toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 3439-3444 (2003).
- Begum, R., Powner, M. B., Hudson, N., Hogg, C., Jeffery, G. Treatment with 670 nm light up regulates cytochrome C oxidase expression and reduces inflammation in an age-related macular degeneration model. PloS one. 8, e57828 (2013).
- Byrnes, K. R., et al. Light promotes regeneration and functional recovery and alters the immune response after spinal cord injury. Lasers in surgery and medicine. 36, 171-185 (2005).
- Liang, H. L., et al. Photobiomodulation partially rescues visual cortical neurons from cyanide-induced apoptosis. Neuroscience. 139, 639-649 (2006).
- Zivin, J. A., et al. Effectiveness and safety of transcranial laser therapy for acute ischemic stroke. Stroke. 40, 1359-1364 (2009).
- Lapchak, P. A. Transcranial near-infrared laser therapy applied to promote clinical recovery in acute and chronic neurodegenerative diseases. Expert review of medical devices. 9, 71-83 (2012).
- Chung, H., et al. The nuts and bolts of low-level laser (light) therapy. Annals of biomedical engineering. 40, 516-533 (2012).
- Wu, Q., et al. Low-Level Laser Therapy for Closed-Head Traumatic Brain Injury in Mice: Effect of Different Wavelengths. Lasers in surgery and medicine. 44, 218-226 (2012).
- Hashmi, J. T., et al. Role of low-level laser therapy in neurorehabilitation. PM&R. 2, S292-S305 (2010).
- Fitzgerald, M., et al. Metallothionein-IIA promotes neurite growth via the megalin receptor. Experimental Brain Research. 183, 171-180 (2007).
- Fitzgerald, M., et al. Near infrared light reduces oxidative stress and preserves function in CNS tissue vulnerable to secondary degeneration following partial transection of the optic nerve. Journal of neurotrauma. 27, 2107-2119 (2010).
- Ando, T., et al. Low-level laser therapy for spinal cord injury in rats: effects of polarization. Journal of biomedical. 18, 098002 (2013).
- Lanzafame, R. J., et al. Reciprocity of exposure time and irradiance on energy density during photoradiation on wound healing in a murine pressure ulcer model. Lasers in surgery and medicine. 39, 534-542 (2007).
- Castano, A. P., et al. Low-level laser therapy for zymosan induced arthritis in rats: Importance of illumination time. Lasers in surgery and medicine. 39, 543-550 (2007).
