Abstract
레이저 또는 발광 다이오드 (LED)에 의해 전달 레드 / 근적외선 요법 (R / NIR-LT)은, 아마도 산화 스트레스를 감소시킴으로써 생체 내에서 중추 신경계 손상, 범위의 기능적 형태 학적 결과를 개선시킨다. 그러나, 산화 스트레스에 R / NIR-LT의 효과는 파장 또는 조사의 강도에 따라 달라질 것으로 나타났다. 치료 매개 변수를 비교하는 연구로 인해 체외 최적화 연구에 넣어 통해 높은에 적합한 여러 파장이나 강도를 제공 상업적으로 사용 가능한 장치의 부재로, 부족하다. 이 프로토콜은 주어진 손상 모델에 필요한 치료 용량을 최적화하는 파장과 강도의 범위에서 빛의 전달을위한 기술을 설명한다. 우리는 파장 및 강도 파라미터를 쉽게 변경 될 수있는 빛을 전달하는 방법은, 활성 산소 종을 감소시키기위한 R / NIR-LT의 최적 투여 량의 결정을 용이하게 할 수 있다는 가설을 세웠다시험 관내 (ROS).
비 간섭 제논 라이트는 다양한 파장 (440, 550, 670의 중심 파장 및 810) 및 플루 언스 제공하는 협 대역 간섭 필터를 통해 여과 (8.5 × 10 -3 3.8을 × 10 -1 J / cm 2) 빛의 배양 된 세포에. 장치에서 빛 출력은 각각의 파장에서 빛의 치료 관련, 동일한 계량 적 투여 량을 방출하도록 조정했다. 글루타메이트는 DCFH-DA 및 H 2 O 2에 민감한 형광 염료를 사용하여, 광 처리 된 세포 스트레스에 반응 종을 검출 하였다.
우리는 성공적으로 CNS 손상의 모델로 글루타민산 염에 노출 배양 된 세포에 관련 파장 및 강도 생리 및 치료의 범위에서 빛을 전달했다. 배양 된 세포에 의해 생성 된 ROS에 영향을주지 않았다 현재 연구에 사용 된 R / NIR-LT의 플루 언스 반면, 빛의 전달 방법은 다른 SYST에 적용 할 수있다EMS 더 중요한 생리 학적 또는 미토콘드리아 Organotypic 슬라이스 배양 모델을 포함한 절연 및 산화 대사의 결과 측정의 범위에 영향을 평가하기 위해 사용될 수있다.
Introduction
반응성 산소 종 (ROS)의 신호 전달 경로와 하나의 신경 세포를 포함한 정상적인 대사 반응의 범위에 대해 요구된다. 내인성 항산화 메커니즘은 ROS의 생성을 제어 할 수없는 때, 세포는 산화 스트레스에 굴복 2,3-있다. CNS에 손상 후, ROS 및 산화 스트레스의 존재가 증가 연관된 손상 4,5의 진행에 중요한 역할을하는 것으로 생각된다. 평가 된 산화 스트레스를 감쇠하기위한 전략의 광대 한 수에도 불구하고, 신경 외상 (6) 다음의 임상 사용 ROS 생산과 관련된 산화 스트레스를 감쇠에 대한 완전히 효과, 임상 적으로 관련된 항산화 전략은 현재 존재하지 않는다. 따라서 산화 스트레스의 감쇠는 치료 적 개입 7에 대한 중요한 목표 남아있다.
개선 사항은 다음과보내고 R / NIR-LT는 부상 아마도 산화 스트레스를 줄임으로써 심근 경색 크기, 당뇨병 및 간 동안 신장 합병증, 망막 변성, CNS 손상 및 뇌졸중 (8)의 감소를 포함하여 다양한 질환에서보고되었다. CNS 부상에 특히 관련하여, 670nm의 빛의 효능 임상 연구는 망막 변성 9-11, 척수 손상 (12), 신경 세포의 죽음 (13)의 모델에 좋은 효과를 보여 주었다. 임상 시험은 그러나이 실험의 결과는 15 매개 변수 효과적인 치료를 사용하는 것이 아마도 장애로 인해 유망 나타나지 않습니다, 황반 변성 관련 마른 나이 수행과 뇌졸중 (14)에 대해 현재 진행되고있다. 따라서, R / NIR-LT 널리 비 침습적, 관리하기 쉽고 상대적으로 저렴한 치료에도 불구하고, 신경 외상 정상 임상 실습의 일환으로 채택되지 않았습니다. 임상 번역 장벽은 CL의 부족을 포함초기 표준화 효과적인 치료 프로토콜 16, 17의 행동과 부재의 메커니즘을 이해했다. 빛 치료에 대한 현재 문헌 조사 소스에 대해 (LED 또는 레이저), 파장 (예를 들어, 630, 670, 780, 810, 830, 880, 904nm), 조사의 총 용량 (주울 / 치료 매개 변수의 변화의 과다를 보여 단위 영역), 지속 시간 (노광 시간), 타이밍 (예정 모독 또는 포스트), 치료의 빈도 및 전달 모드 () 펄스 또는 연속 8. 연구와 치료 매개 변수의 변동성 비교 어렵고 효능 (16)에 대한 회의론에 기여하고있다.
따라서, R / NIR-LT의 최적화는 명확 여러 변수를 비교하는 데 필요한 높은 처리량 스크리닝 기법을 제공 할 수있는 세포 배양 시스템이 필요하다. 그러나 워싱턴를 통해 충분한 유연성과 제어를 제공 할 수 몇 상업적으로 이용 가능한 조명 시스템이 있습니다velength 강도는 최적화 실험을 수행 할 수 있습니다. 시판 LED 장치는 일반적으로 강도뿐만 아니라 다를 수 있습니다 다른 제조 업체, 여러 LED 소자를 사용하는 연구자의 결과로 여러 파장이나 강도를 제공 할 수뿐만 아니라 방출되는 빛의 파장의 스펙트럼하지 않습니다. 우리는 따라서 R / NIR-LT의 파라미터의 근접, 정확한 제어를 허용하며, 파장 및 빛의 플루 언스의 범위를 생성하는 협 대역 간섭 필터를 통해 여과 광대역 크세논 광원을 사용함으로써이 문제를 해결했다.
그것은 치료의 치료 학적 투여 량은 R / NIR-LT의 경우 사이토 크롬 C 산화 효소 (COX) (18)로 가정하고, photoacceptor (발색단)와 상호 작용하는 광자의 수에 의해 정의된다는 점에주의하는 것이 중요하다. 전달 광자 에너지는 파장에 따라 달라집니다; 서로 다른 파장의 에너지의 동일한 용량을 의미하는 것은 COM 될 것입니다광자의 상이한 수의 입상. 따라서, 소자로부터 방출 된 광이 테스트에 선택된 파장의 광자를 각각 동일한 수의 방출하도록 조정 하였다. 생체 외에서 세포의 파장과 강도의 범위에서 R / NIR-LT를 전달하는데 사용될 수있는 시스템을 개발하고 실시 세포에서 ROS 생성에 전달되는 R / NIR-LT의 효과를 측정 할 수있는 능력을 입증 글루타민산 염 스트레스.
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Protocol
1. 광학 보정 : 측정 광 출력
- 광 전달 장치를 준비하기 위해, 광대역 광원을 연결 (예를 들어, 제논 램프 또는 텅스텐)에 적합한 전원 공급 장치에 관한 것이다. 광의 시준 된 빔을 생성하는 광원 앞의 콜리 메이팅 렌즈를 배치. 광속에서 대부분의 열을 제거하기 위해 액체 열 필터를 통해 광을 통과. 애플리케이션에 따라, 빛의보다 유연한 전달 (예., 인큐베이터) 제공 액체 광 가이드의 입사 개구에 평행 빔에 초점.
- 액체 광 가이드의 타단에, 시준 렌즈를 제하고 간섭 및 감광 필터의 위치 홀더. 이 배열은 원하는 파장 대역과 강도의 빛의 균일 조명 자리를 생산하고 있는지 확인합니다.
참고 : 라이트 가이드와 시편 평면의 끝 사이의 거리에 따라 달라질 필요가 있습니다조명되어야하지만 지역 도광 증가 단부로부터의 거리로, 광 강도가 감소한다는 것을 기억. 본 연구에서는,이 거리가 14cm이고 균일 96- 웰 플레이트에 3 × 3 웰 영역을 조명 빔 단면을 생성한다. - 램프와 관련 광학 부품으로부터 미광을 확인하는 것은 시편에 도달 할 수 없습니다.
- 액체 열 필터 물 쿨러의 전원을 켜고 필터 재킷을 통해 물 교환이 확인합니다. 램프 전원을 켜고 안정 될 때까지 광대역 광원 적어도 5 분 동안 기다립니다. 주 : 물 냉각기의 사용은 장치의 과열을 방지 할 필요가있다.
- 조명의 원하는 파장 대역을 생성하는 (보통 반 최대 (FWHM) 대역폭에서 자신의 중심 파장, 피크 투과율 및 전체 폭에 의해 기술) 협 대역 간섭 필터를 선택합니다. 참고 : 본 연구에 사용 된 협 대역 간섭 필터 (4)이었다42 나노 미터, 550 나노 미터, 671 nm에서 810 nm의.
- 시편은 치료 중에 위치하도록 평면에서 램프에 의해 생성 된 광을 측정한다. 제조업체의 지시에 따라 적부 소프트웨어를 사용하여, 적절한 접속 분광 방사 조도 교정 프로브 (코사인 콜렉터)을 사용하여 광을 측정한다.
- 원하는 출력이 얻어 질 때까지의 광의 강도를 조정하는 감광 필터를 사용한다. 참고 : 본 연구에서, 각각의 간섭 필터에 의해 통과 된 광의 강도는 네 개의 처리 wavebands 각각에서 동일한 계량 적 출력을 제공하도록 조정된다. 이 램프 출력이 변경 될 수 있습니다로, 정기적으로 교정을 확인하는 것이 중요합니다.
주 : 장치의 셋업이 이어, 세포를 조명 될 준비가 하나가 현재 연구에 사용 된 광 전달 장치의 그림 표현이다..
빛 전달 장치. 일러스트 그림 1. 이미지는 빛 전원 주택, 시준 렌즈, 물 필터, 입구 조리개, 액체 라이트 가이드, 초 콜리 메이팅 렌즈, 필터 홀더, 처리 프레임과 매트 블랙 카드 크세논 램프입니다. 협 대역의 파장과 강도 필터가 표시되지 않습니다.
2. 셀 준비
- 기재된 R / NIR-LT 배송 방법은 어떠한 세포 유형 또는 시험 관내 모델 시스템에 적용될 수있다; 세포 배양의 다음과 같은 설명은 배양 갈색 세포종 (PC12), 뮐러 (RMC1)와 일차 혼합 망막 세포에 잘 확립 된 기술을 사용하여, 일반적으로이다.
- 빛 치료 및 산화 스트레스 분석을위한 세포 파종하기 전에, 문화는 T75의 flas에서 적절한 보조제 (예., FBS, 항생제)를 포함하는 각각의 성장 배지에서 세포를 불멸화70-80% 합류 할 때까지 KS.
- 예를 테스트하기 위해 세포 유형에 적합한 방법을 사용하여 T75 플라스크로부터 불사 화 세포를 분리., 트립신. 필요한 경우, 96 웰 분석 플레이트에서 세포의 파종 진행하기 전에, 코트 분석 플레이트 (PC12 세포에 대한 예.) 1 시간에 대한 10μg / ml의 폴리 -L- 라이신과 우물 또는 10μg / ml의 폴리 -L- 라이신 10μg와 O / N 배양 한 다음 1 시간 / ㎖ 라미닌 (예., 혼합 망막 세포).
- 원심 분리 세포 (예., PC12 세포에 대한 405 XG 또는 RMC1 전지용 218 XG에 10 분에서 3 분)와 같은 적절한 수집 할 적절한 세포 배양 배지 8 ㎖에 상청에 resuspend 제거.
- 혼합 망막 세포가 사용되는 경우, 확립 된 절차에 따라 19 소화 효소 (파파인)에 의해 P0-5 신생아 래트 새끼로부터 제조
- 혈구 계를 사용하여, 0.4 % (W / V) 트립 판 블루 염색 배제 생존 세포 수를 계산.
- 셀 밀도 SUC를 조정세포 배양에서 24 또는 48 시간 후 약 70~80% 합류 될 것입니다 시간. (PC12 세포에 대한 시딩 밀도 RMC1 세포를 들어, 2.5 × 10 5 생세포 / ㎖이고, 혼합 망막 세포 것이 8 × 10 5 생세포 / ㎖이며, 4.0 × 10 5 생세포 / ㎖ 임). 셀을 추가 한 후 중 적절한 성장 배지 100 ㎕에, (H 2 O 2 또는 DCFH-DA 분석 각각 사용) 명확한 또는 검은 색 96 웰 플레이트, 플레이트는 37 ° C, 5 평평한 표면에 앉아 할 수 있도록 % CO 2 세포 부착을 허용하는 최소 24 시간 동안 (또는 어떤 조건은 특정 세포 유형에 적합한).
- 해당 96 웰 트레이 성장 미디어 문화의 세포들은 70 ~ 80 %의 합류 (PC12 및 RMC1 세포에 대한 24 시간, 혼합 망막 세포 48)까지.
3. 세포에 글루타민산 스트레스 추가
- 적절한 성장한다 전체에 0-10mM의 L 글루탐산 모노 나트륨 염 수화물 스트레스 농도 준비일 문화 미디어.
- 세포에서 미디어를 제거하고 부드럽게 PBS (PC12) 또는 HBSS (RMC1과 혼합 된 망막 세포)와 세포를 3 회 세척한다. 세척 후 / 웰에 100㎕의 총 부피로 글루타메이트 - 함유 배지를 추가한다.
라이트 치료 4. 첫 번째 투여 량
- 즉시 글루타메이트 또는 선택의 스트레스 요인의 추가에 따라, 제조 된 광 전달 장치 아래에 배치하여 원하는 파장과 강도 빛 치료에 세포를 노출합니다. 파장에 따라 중립적 인 밀도 필터의 설치 조합을 사용하여 광선의 계량 적 출력 관리중인 변경해야합니다.
참고 : 현재의 실험에서, 3 분 동안 빛 치료에 세포를 노출 37 O C 열 패드의 96 웰 플레이트를 놓아 온도를 유지한다. 요구되는 처리 시간은 변할 수있다.- 96 아 인접 우물에 반영하는 빛을 방지하기 위해 세포 아래에 매트 블랙 카드를 놓습니다L 트레이는 다른 치료 매개 변수에 대한 지정.
- 처리는 시간의 긴 길이에 대해 요구되는 경우, 최적 또는 조건을 세포 배양 배지의 pH를 유지 또는 이상적으로, 5 % CO 2로 조절 CO 2 농도 인큐베이터 내에서 장치 및 처리 판을 배치하고 25mM HEPES 완충 추가 특정 세포 유형.
- 광처리 종료 후, 평평한 표면에 세포를 넣고 37 ℃, 5 % CO 2에서 24 시간 배양한다 대 (또는 어떤 상황 세포 유형에 대해 최적).
주의 : 전술 한 바와 같이 필요에 따라 R / NIR-LT의 추가의 투여 량은, 투여 할 수있다.
ROS의 빛 치료와 탐지 5. 최종 복용량
- 광처리의 최종 라운드를 수행하기 전에 시약 ROS 검출에 사용될 준비. 2 O 2 검출 시약 작업을 50mM의 구연산 완충액 (pH6.0), 트리톤 X100 및 H 준비용액 (1 : 2 : 10 mM이 H 2 O 2 검출 시약 원액의 비율 97 10 U / ㎖의 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제, 50 mM의 시트르산 나트륨 (PH 6.0)). 적절한 미디어에서 100μM의 최종 농도 DCFH-DA를 준비합니다.
주 : PC12 세포에 DCFH-DA를위한 시약 RPMI 매체이며, RMC1 전지용 DCFH-DA 시약 DMEM 배지에서이다. 시판 검출 시약 특정 ROS에 차동 감도를 가지고 시약 개별 애플리케이션에 요구되는 정보를 제공하기 위해주의 깊게 선택되어야합니다. - 4.1-4.1.2 단계에 기재된 바와 같이, 세포에 광처리를 관리. 확인 세포는 빛의 원하는 플루 언스 / 파장으로 처리되고있다.
- 즉시 글루타메이트 - 함유 배지를 제거하고 적절한 완충 용액으로 두 번 세척 광처리는 다음의 (PC12 세포 위해 PBS를 사용하고, 셀 RMC1 위해 HBSS가 사용된다). 다음과 같이 세포의 ROS 분석을 수행합니다 :
- H 2 O 2 2를 37 ° C에서 품어 5 %. H의 50 μL 2 O 2 탐지 작업 솔루션을 추가하고 실온에서 30 분 동안 품어. 을 530nm의 여기 파장 및 ~ 480㎚의 발광 파장을 갖는 플레이트 판독기를 사용하여 형광을 측정한다.
- DCF 분석은 : 각각의 웰에 DCFH-DA의 100 μM 용액 100 μl를 추가하고 37 ° C에서 30 분, 5 % CO 2 배양한다. 100 μM DCFH-DA가 포함 된 용지를 제거하고 위에서 설명한대로 두 번 적절한 완충 용액으로 세척한다. 각각의 웰에 완충 용액 10 μL 트리톤 X100의 90 μl를 추가하고 부드럽게 37 ° C에서 30 초 15 분 전에 배양을위한 궤도 진탕 기에서 흔들어. ~ 480㎚의 여기 파장과 발광 wavel와 플레이트 판독기를 이용하여 유도 된 DCF 형광 측정을 530nm의 ength.
- 익스프레스 ROS는 단백질 MG를 계산하는 표준 곡선을 참조하여, 제조업체의 지시에 따라 단백질 농도를 비색 정량 키트를 이용하여 웰에 남아있는 세포의 단백질 농도에 대하여 값.
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Representative Results
670nm의 파장에서 전달되는 빛의 출력은 이전에 생체 내 (0.3 J / cm 2) (20)에 유익한 것으로 도시 670nm 광의 도즈 포괄 플루 언스의 범위로 셀을 조사하기 위해 감광 필터를 사용하여 보정 하였다. 증가 된 광원의 앞에 중성 밀도 필터의 개수, 강도 (W / m 2) 이하 광 표적 영역에 전달할 수 있도록, 감소 하였다. 표 1은 파장 필터 장착 광원으로부터 발생 670nm 광의 교정 데이터를 제시하고, 광 출사에서 설명한 거리에서 사용 ND 필터의 개수 및 결과 생성 된 광의 강도를 포함한다. 플루 언스, 또는 670nm의 빛 (J / cm 2)의 용량은, 수학 식으로부터 계산 하였다 : 투여 량 (J / ㎠) = (광 강도 () m 2 / W / 10000) × 시간 (S)], 여기서, 치료 시간은 180s했다.
| ND 필터의 개수 | 광 출력으로부터의 거리 (cm) | 강도 (W / m ^ 2) | 투여 량 (J / cm ^ 2) |
| 0 | 10.5 | 20.11 | 0.38 |
| 0 | (14) | 10.55 | 0.19 |
| (1) | (14) | 4.91 | 0.075 |
| 이 | (14) | 2.28 | 0.041 |
| 3 | (14) | 1.03 | 0.018 |
| 4 | (14) | 0.47 | 0.0085 |
| (5) | (14) | 0.21 | 0.0038 |
| (6) | (14) | 0.094 | 0.00169 |
| 7 | (14) | 0.045 | 0.00081 |
| 8 | (14) | 0.021 | 0.000378 |
| 9 | (14) | 0.013 | 0.000234 |
표 1 : ND 필터의 670nm 파장 필터 .Number 장착 광 전달 장치의 출력은, 광원 출력의 전면에 장착 감광 필터의 개수를 나타낸다. 일까지보고 된 강도 (W 용 / m의 2) 광의 강도를 말한다전자 타당성 소프트웨어. 플루 언스, 또는 투여 량은 노출 시간이 광 출력으로부터 180s 거리였다 수학 식 투여 량 (J / ㎠) = (광 강도 (W / m 2) / 10000) × 시간 (S)]에 의해 산출했다 10.5 또는 14 cm이었다.
빛의 두 임상 적으로 관련된 계량 적 플루 언스은 ROS의 생산에 대한 R / NIR-LT 파장의 차동 효과를 조사하기 위해 선택되었다. 상부 조직 LED 장치를 사용을 통한 전송 다음 CNS 책자에 도달 할 수있는 용량 (즉, 1.78 W / 670nm에서 m 2) 20 3 분의 치료를 위해 0.03 J / cm 2로 동일시, 또는 4.9 × 10 (14) 광자 / cm 2 / 의. 필터 장착 광원은, 442의 발광 550, 670 결과 또는 830nm 그 에너지 출력 반대로 파장마다 (J / cm 2) 동일한 계량 적 출력 (광자)를 방출하도록 감광 필터의 조합을 사용하여 보정 하였다 및 용량 (J / cm 2) INTEW의 / m에 2 계산 (표 2A)에 nsities. 권장 지침 이내 추가적인 높은 투여 량은 각각의 파장을 행하고 셀룰러 21도 (1.29 X 1015 포톤 / cm 2 / s)를 사용했다 활성 및 교정을 자극 (표 2B).
| 파장 (λ) | 투여 량 (J / cm ^ 2) | 강도 (W / m ^ 2) | 방출 (광자 / cm ^ 2 / s의) |
| (442) | 0.057 | 3.21 | 4.8 × 10 ^ (14) |
| (550) | 0.051 | 2.87 | 5.0 × 10 ^ (14) |
| (670) | 0.032 | 1.78 | 4.9 × 10 ^ (14) |
| (830) | 0.018 | 1.01 | 4.9 X10 ^ 14 |
표 2 :. 다양한 파장에서 빛의 광자의 동일한 번호로 전달 투여 량 강도의 보정 강도 (W / m 2), 3 분의 치료 (J / cm 2) 및 배출에 대한 투여 (광자 / cm 2 / s의) 442, 550, 670 및 830nm 발광 크세논 광 출력으로부터 14cm의 거리에서) 4.9 × 10 14 포톤 / cm 2 / 초 또는 B) 1.3 × 1015 포톤 / cm 2 / s의를 방출하도록 조정하면 광 출력.
장치에 의해 전달되는 빛이 사용되는 용량에서 세포 독성 여부를 평가하기 위해, 우리는 비색 단백질 분석을 이용하여, ROS 분석법 다음 PC12 세포 배양 웰에 남아있는 단백질 함량을 평가 하였다. 광 (P> 0.05)의 높은 출력 용량에서의 임의의 단백질의 유의 한 손실은 (전달 광의 투여 량은 세포 사멸의 원인이되지 않았 음을 나타내는 Figur 없었다예 2) 산화 적 대사의 평가에 사용하는 것이 적절하다.
그림 2 : R / NIR-LT와 ROS 분석을 다음과 문화 우물에 남아있는 총 단백질 농도에 빛의 용량을 변화의 효과. 히스토그램 막대 PC12 세포 배양 웰에 SEM의 단백질 농도를 평균 ± 6 복제물 / 농도는 실험은 3 회 반복 하였다. 분산 분석 (ANOVA), P> 0.05에 의해 결정된 제어 및 치료 그룹의 사이에 통계적으로 유의 한 차이가 없었다.
우리는 초기 광 전달 장치의 적합성을 평가하기위한 예시적인 파장으로, 0.0085에서 0.38 J / cm 2 범위 플루 언스에 배신 670nm 광의 효과를 평가 하였다. 유의 EFF 없습니다H 2 O 2 PC12, RMC1 또는 혼합 망막 세포에서 DCF 형광이 글루타메이트 (그림 3> 0.05 P) 강조하거나 평가할 때 670nm의 빛 요법 시험 플루 언스의에서 관찰되었다. 마찬가지로, H 2 O 2를 평가할 때 / NIR-LT는 4.9 × 10 (14) 광자에 전달 R / cm 2 / s의 또는 1.3 × 10 15 광자 / cm ROS 생산에 2 / s의, 파장을 변화의 유의 한 효과가 없었다 또는 DCF 형광 (P> 0.05, 데이터는 도시하지 않음). 반응 종의 변화를 감지 할 수있는 능력은 10 mM이 글루타메이트에서 22.10 ± 2.10 13.44 ± 0.67 mM의 글루타메이트의 DCFH-DA 반응성 염료의 형광의 증가에 의해 확인된다. 우리의 데이터는 선택한 모델 시스템에서 ROS 생산에 우리의 빛 전달 장치를 사용하여 전달 R / NIR-LT의 긍정적 인 효과를 공개하지, 어느 쪽이 세포 문화에 지속적인 단백질 함량으로 표시, 손상되지 않은으로 부정적인 영향했다 없지만빛 치료 (그림 2) 다음 우물. 이와 같이, 상술 한 방법은 파장의 범위에서 광자의 정의 투여 량이 세포 또는 미토콘드리아를 치료하기위한 프로토콜을 제공하며, 더 높은 투여 량 및 R / NIR-LT 파라미터의 최적화를 가능하게 할 수있는 대안적인 결과 측정을 평가하는데 사용될 수있다.
그림 3 : PC12 (A, D)에 H 2 O 2 (AC) 및 DCF (DF) 형광의 정량, RMC1 (B, E) 또는 혼합 망막 세포 (C, F) 10 mM이 글루타메이트 스트레스의 존재에 문화, 0.38 J / cm 2 - 0에 이르기까지 플루 언스 용량에서 670nm 조사 치료를 다음과 같습니다. 히스토그램 막대는 SEM ± 평균 임의의 형광 단위 / μg의 단백질을 나타냅니다. 통계 학적으로 유의가 없었다그룹당 복제 ANOVA, p> 0.05, (6)에 의해 결정된 제어 및 처리 군 사이의 임의의 차이는, 실험은 3 회 반복 하였다.
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Discussion
우리는 성공적이 R / NIR-LT 시험관 최적화 연구기구를 제공하기 위해 정밀한 보정 광 전송 시스템을 채택했다. R의 파장 및 강도 파라미터 / NIR-LT는이 시스템을 이용하여 정확하고 효율적으로 조작 될 수있다. ROS 테스트 세포 유형에서 제공되는 파장과 투여 량 감소되지 않았다하더라도 우리는 세포 죽음으로 이어질하지 않은 세포의 빛 치료를 설립했다. 670nm (20.11W / m 2)에서 현재 시스템에 의해 달성의 최대 농도는 1.17 W / m 2 시신경과 0.3W의 복부 표면에 도달 쥐의 뇌에 조사의 투과도의 이전에 출판 된 조치의 초과에 / m 2 뇌 케이스의 복부 표면에 도달했다. 0.31 J / cm 2 - 30 분 동안 전달되는 경우, 생체 내에서의 시신경 세포에 의해 수신 된 투여 량은 0.054, 따라서이다. 현재의 연구에서 전달 670nm의 빛의 용량 (0.38J / ㎠)까지 그러므로 우리의 이전 연구에서 생체 내에서 세포에 의해 수신 된 것들을 포함한다.
R / NIR-LT 효능의 가장 널리 인정 이론에 따라서는 다양한 파장으로 처리 된 세포가 빛 (광자 / cm 2 / s의) 동일한 계량 적 플루 언스를받을 수 있도록하는 것이 필수적이며, photoacceptor 기반 시스템 (18)의 8. 또한, 빛의 특정 플루 언스를 제공하기 위해 사용되는 노광 시간은 증가하고 시간이 지남에 따라 전체 플루 언스를 줄일 변화 광의 강도 만, 처리에 일관된 유지되어야한다. 이전의 연구는, 노광 시간을 변경하는 결과 측정에서의 차이에 동일한 플루 언스의 결과를 제공하고 교란 요인으로 작용할 수도 있고, 특정 손상 모델 (22, 23)에 필요한 최적의 파장 / 플루 언스 파라미터의 식별을 방해하는 것으로 입증되었다. 이에 따라 복용량의주의 교정을 추천합니다각 시험 파장에서, R / NIR-LT의 유용한 최적화를 보장합니다.
설명 된 기술로 인해 세포 구조와 복잡한 간 세포 상호 작용의 보존에 더 의미있는 결과가 발생할 수 있습니다 Organotypic 슬라이스 문화를 포함한 체외 모델 시스템의 범위에 빛의 전달을 할 수 있습니다. 손상 모델에 변화는 R / NIR-LT의 치료 매개 변수의 차이를 요구할 수있다. 이 기술은 설명 된 계기로 달성 최대 전력 출력에 의해 제한된다. 높은 전력 출력은 생체 애플리케이션 관내 일부 가장 필요할 수있다. 광의 높은 출력이 필요한 경우, 상기 장치는 시료에 도달하는 빛의 세기를 증가시키기 위해 변경 될 수있다. 광 종단과 목표 셀 간의 거리를 단축하면 판에 도달하는 빛의 세기를 증가시킬 것이다. 대안 적으로, 광은 미러 오프와 같은 OPPO 셀에 반영 될 수있다액체 광 가이드를 통해 여과되고 나오지 그러나 대안 파장 및 감광 필터가 이것을 달성하기 위해 요구 될 것이다. 방법은 R의 전달을 위해 적용 할 것 인 경우에 더 강력한 광원을 사용하여 높은 출력도 필요한 것 / NIR-LT의에 의한 조사 8,20의 효과적인 투과도을 보장하기 위해 요구되는 증가 된 용량에 CNS 손상의 생체 모델, .
결론적으로, 현재의 연구는 효과적으로 R / NIR-LT 연구에서 빛의 세기 및 파장의 파라미터를 변경하는 수단을 제공 광 전달의 신규 한 방법을 설명한다. 이 방법론은 결과 측정의 범위를 사용하는 R / NIR-LT의 최적화 및 체외 부상 모델에 유용 할 것이다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OxiSelect Intracellular ROS Assay Kit (Green Fluorescence) | Cell Biolabs | STA-342 | |
| Amplex UltraRed Reagent | Molecular Probes | A36006 | |
| 300 Watt Xenon Arc Lamp | Newport Corporation | 6258 | Very intense light source, do not look directly into the lamp. Ensure there is sufficient cooling to the lamp whilst it is switched on |
| USB4000-FL Fluorescence Spectrometer | Ocean Optics | ||
| CC-3-UV Cosine Corrector for Emission Collection | Ocean Optics | ||
| 200μm diameter quartz fibre optic | Ocean Optics | ||
| SpectraSuite Spectroscopy Platform | Ocean Optics | ||
| 2300 EnSpire Multimode Plate Reader | Perkin Elmer | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | Acute toxicity, wear gloves when handling. |
| L-Glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | 142-47-2 (anhydrous) | |
| Pheochromocytoma rat adrenal medulla (PC12) cells | American Type Culture Collection | CRL-2522 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI1640) Media | Gibco | 11875-119 | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin | Gibco | 10082-147 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Horse Serum, New Zealand origin | Gibco | 16050-122 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-061 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| 100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140-050 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Retinal Muller (rMC1) cells | University of California, San Diego | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-118 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| 75 cm2 Flasks | BD Biosciences | B4-BE-353136 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | 25988-63-0 | Aliquot and store at -20 °C |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-134 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-049 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Gibco | 23017-015 | Aliquot and store at -20 °C |
| 1X Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| 165U Papain | Worthington | ||
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | W326305 | |
| Corning 96 well plates, clear bottom, black | Corning | CLS3603-48EA | |
| Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates Untreated; Well shape: Round; Sterile. | Costar | 07-200-103 | |
| Seesaw Rocker | Standard lab epuipment | ||
| Centrifuge | Standard lab epuipment | ||
| Neutral Density Filter Paper (0.3) | THORLABS | ||
| 442 nm Bandpass Filter | THORLABS | FL441.6-10 | |
| 550 nm Bandpass Filter | THORLABS | FB550-10 | |
| 670 nm Bandpass Filter | THORLABS | FB670-10 | |
| 810 nm Bandpass Filter | THORLABS | FB810-10e | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.1) | THORLABS | NE01B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.2) | THORLABS | NE02B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.3) | THORLABS | NE03B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.5) | THORLABS | NE05B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.6) | THORLABS | NE06B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (1.0) | THORLABS | NE10B |
References
- Gutterman, D. D. Mitochondria and reactive oxygen species an evolution in function. Circulation research. 97, 302-304 (2005).
- Camello-Almaraz, C., Gomez-Pinilla, P. J., Pozo, M. J., Camello, P. J. Mitochondrial reactive oxygen species and Ca2+ signaling. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 291, C1082-C1088 (2006).
- Kowaltowski, A. J., de Souza-Pinto, N. C., Castilho, R. F., Vercesi, A. E. Mitochondria and reactive oxygen species. Free Radical Biology and Medicine. 47, 333-343 (2009).
- Coyle, J. T., Puttfarcken, P. Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders. Science. 262, 689-695 (1993).
- Doble, A. The role of excitotoxicity in neurodegenerative disease: implications for therapy. Pharmacology & therapeutics. 81, 163-221 (1999).
- Hall, E. D. Antioxidant therapies for acute spinal cord injury. Neurotherapeutics. 8, 152-167 (2011).
- Jia, Z., et al. Oxidative stress in spinal cord injury and antioxidant-based intervention. Spinal Cord. 50, 264-274 (2012).
- Fitzgerald, M., et al. Red/near-infrared irradiation therapy for treatment of central nervous system injuries and disorders. Reviews in the Neurosciences. 24, 205-226 (2013).
- Rutar, M., Natoli, R., Albarracin, R., Valter, K., Provis, J. 670-nm light treatment reduces complement propagation following retinal degeneration. J Neuroinflammation. 9, 257 (2012).
- Eells, J. T., et al. Therapeutic photobiomodulation for methanol-induced retinal toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 3439-3444 (2003).
- Begum, R., Powner, M. B., Hudson, N., Hogg, C., Jeffery, G. Treatment with 670 nm light up regulates cytochrome C oxidase expression and reduces inflammation in an age-related macular degeneration model. PloS one. 8, e57828 (2013).
- Byrnes, K. R., et al. Light promotes regeneration and functional recovery and alters the immune response after spinal cord injury. Lasers in surgery and medicine. 36, 171-185 (2005).
- Liang, H. L., et al. Photobiomodulation partially rescues visual cortical neurons from cyanide-induced apoptosis. Neuroscience. 139, 639-649 (2006).
- Zivin, J. A., et al. Effectiveness and safety of transcranial laser therapy for acute ischemic stroke. Stroke. 40, 1359-1364 (2009).
- Lapchak, P. A. Transcranial near-infrared laser therapy applied to promote clinical recovery in acute and chronic neurodegenerative diseases. Expert review of medical devices. 9, 71-83 (2012).
- Chung, H., et al. The nuts and bolts of low-level laser (light) therapy. Annals of biomedical engineering. 40, 516-533 (2012).
- Wu, Q., et al. Low-Level Laser Therapy for Closed-Head Traumatic Brain Injury in Mice: Effect of Different Wavelengths. Lasers in surgery and medicine. 44, 218-226 (2012).
- Hashmi, J. T., et al. Role of low-level laser therapy in neurorehabilitation. PM&R. 2, S292-S305 (2010).
- Fitzgerald, M., et al. Metallothionein-IIA promotes neurite growth via the megalin receptor. Experimental Brain Research. 183, 171-180 (2007).
- Fitzgerald, M., et al. Near infrared light reduces oxidative stress and preserves function in CNS tissue vulnerable to secondary degeneration following partial transection of the optic nerve. Journal of neurotrauma. 27, 2107-2119 (2010).
- Ando, T., et al. Low-level laser therapy for spinal cord injury in rats: effects of polarization. Journal of biomedical. 18, 098002 (2013).
- Lanzafame, R. J., et al. Reciprocity of exposure time and irradiance on energy density during photoradiation on wound healing in a murine pressure ulcer model. Lasers in surgery and medicine. 39, 534-542 (2007).
- Castano, A. P., et al. Low-level laser therapy for zymosan induced arthritis in rats: Importance of illumination time. Lasers in surgery and medicine. 39, 543-550 (2007).
