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Immunology and Infection

एक का विकास doi: 10.3791/52222 Published: November 1, 2014

Introduction

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एलर्जी सदियों के लिए जाना जाता रहा है. अस्थमा के उपचार Ebers Papyrus (~ 1550 ईसा पूर्व) के रूप में जाना जाता है प्राचीन मिस्र के चिकित्सा पाठ में वर्णित है और यह 7 के इलाज के लिए हर्बल उपचार पर चर्चा की गई.

आज एलर्जी टी सहायक सेल टाइप 2 (वीं 2) प्रतिरक्षा प्रणाली के हाथ एलर्जी कहा जाता पर्यावरण एंटीजन के जवाब में इम्युनोग्लोबुलिन ई (आईजीई) एंटीबॉडी के उत्पादन steers जहां एक प्रकार मैं अतिसंवेदनशीलता प्रतिक्रिया, के रूप में वर्गीकृत किया जाता है. ये आमतौर प्रतिरक्षा प्रणाली में कोशिकाओं के साथ बातचीत और आईजीई संश्लेषण सिगरेट का धुआँ या डीजल निकास कण कण में बढ़ाने के जो रूप में इंटरल्यूकिन -4 और इंटरल्यूकिन 13 8, 9 सहित संश्लेषण और समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स के स्राव को उत्तेजित कि विविध पदार्थ हैं 10.

पिछले 50 वर्षों में औद्योगिक देशों में एलर्जी अभिव्यक्तियों में वृद्धि के प्रभाव के संयोजन के लिए जिम्मेदार ठहराया गया है'स्वच्छता परिकल्पना' 11 द्वारा प्रस्तावित वें 2 साइटोकिन्स द्वारा predominated एक प्रोफाइल की ओर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया शिफ्ट करने के लिए गठबंधन जो पर्यावरण प्रदूषण और एक अधिक साफ पर्यावरण के लिए एक प्रवृत्ति,.

जैसा कि ऊपर कहा, मनुष्य एलर्जी से पीड़ित केवल स्तनधारियों नहीं हैं. उल्लेखनीय है कि घोड़े और कुत्ते भी क्लासिक एलर्जी प्रतिक्रियाओं विकसित कर सकते हैं और, घोड़े एलर्जी आनुवांशिक और पर्यावरणीय कारकों को जिम्मेदार ठहराया है मनुष्य के रूप में 12 के एक अध्ययन, पता चला है कि. एक परिणाम के रूप में, इन जानवरों के एक बार नैदानिक ​​अभिव्यक्तियाँ में निर्धारित किया है एलर्जी की आनुवांशिक और पर्यावरणीय कारणों, बीमारी को संवेदनशील बनाने से इसकी प्रगति, और संभव हस्तक्षेप रणनीतियों के बीच परस्पर क्रिया के अध्ययन के लिए अच्छा मॉडल पेश

1887 में, Stömmer, घोड़े का हृदय प्रणाली पर हिस्टामिन का प्रभाव है मानव और घोड़े अस्थमा 13 के बीच समानता का वर्णन करने के पहले व्यक्ति थेमनुष्यों 14 की है कि बहुत समान. घोड़े भी 15 सालाना $ 115000000000 अमेरिका की एक शर्त के कारोबार के साथ लायक अमेरिका $ 72000000000 है जो घुड़दौड़ उद्योग की आधारशिला हैं.

सबसे समकालीन racehorses के बाद 1878 से लेडी ऐनी ब्लंट द्वारा नस्ल अरब घोड़ों की छोटी संख्या के वंशज हैं. आधुनिक racehorses सामान्यतः प्रदर्शन क्षमताओं के लिए चयन करने के लिए सहज रहे. वे एलर्जी प्रतिक्रियाओं माउंट करने के लिए अपनी संवेदनशीलता है, जिनमें से एक आनुवंशिक विकार, से ग्रस्त हैं. उन्होंने यह भी भी सबसे गंभीर एलर्जी मनुष्य के 16 की तुलना में 1000 गुना अधिक है सीरम आईजीई स्तर है. हार्स एलर्जी प्रतिक्रियाओं आमतौर पर कीड़े के काटने अतिसंवेदनशीलता (IBH) 17, 18 के रूप में प्रकट होते हैं. कारण काटने के लिए जिल्द की सूजन में IBH परिणाम जीनस Culicoides में कीड़ों के रूप में. घोड़े एलर्जी रोग का दूसरा रूप आवर्तक वायु-मार्ग अवरोधों (राव), यह फेफड़ों और वायुमार्ग में प्रकट होता है है. यह घरघराहट और प्रयोगशाला की विशेषता हैored साँस लेने में. राव सामान्यतः बीजाणुओं मोल्ड करने के लिए प्रतिक्रिया में होता है, और किसी अन्य जांच इस 20 पुष्टि नहीं की है, हालांकि उच्च allergen के-विशिष्ट IgE का स्तर एक अध्ययन 19 में राव से पीड़ित घोड़ों में दर्ज किया गया है.

घोड़े एलर्जी पर अध्ययन प्रयास निगरानी में और विरोधी घोड़े का आईजीई मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (Mabs) 21, 22 के विकास के द्वारा घोड़े का आईजीई को निष्क्रिय करने के चारों ओर घूमती है. इसके अलावा 23 से अध्ययन घोड़े का उच्च आत्मीयता एफसी रिसेप्टर के α की बाह्य डोमेन के उत्पादन की चर्चा घोड़े सीरम आईजीई का पता लगाने और quantitate करने की कोशिश में श्रृंखला (FcεRIα) रिसेप्टर. Ledin 24 से संबंधित एक अध्ययन में एक आत्म / गैर आत्म immunogen का उपयोग प्रतिरक्षा प्रणाली को भड़काना द्वारा सीरम आईजीई को निष्क्रिय करने के उद्देश्य से एक नया दृष्टिकोण पर चर्चा. इन सभी अध्ययनों, हालांकि, उनके प्रोटोकॉल की सुरक्षा और प्रभावकारिता परीक्षण करने के लिए एक प्रभावी परख का अभाव है. इस अनुच्छेद में, हम अब इस तरह के एक परख व्यवस्था पेशβ-hexosaminidase रिहाई, सेल मध्यस्थ degranulation का एक संकेतक के रूप में, घोड़े FcεRIα व्यक्त आरबीएल-2H3.1 कोशिकाओं पर मूल्यांकन किया गया था जहां घोड़े प्रणाली, के लिए प्रासंगिक नैदानिक ​​और चिकित्सीय रणनीतियों के अध्ययन के लिए लागू मंदिर. इस प्रोटोकॉल विभिन्न प्रजातियों से आईजीई के लिए उच्च आत्मीयता रिसेप्टर की आईजीई बाध्यकारी डोमेन एन्कोडिंग जीन के साथ ट्रांसफ़ेक्ट आरबीएल कोशिकाओं के इंजीनियरिंग वर्णन पिछले प्रकाशनों 25, 4, 5, 2, 3 पर आधारित है. प्रोटोकॉल, जिनमें से परिणाम तीन प्रतियों प्रयोगों का मानक विचलन ± मतलब के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं एक β-hexosaminidase रिहाई परख प्रदर्शन करने के लिए कैसे करें.

रिहाई परख पहले Siraganian द्वारा विकसित की है और मानव एलर्जी के अध्ययन के लिए 25 हुक गया था. डॉ रूबेन Siraganian के नेतृत्व में प्रयोगशाला समूह भी आरबीएल सेल लाइन विकसित की है. ये आरबीएल कोशिकाओं मानव FcεRIα व्यक्त करने के लिए विकसित किए गए और प्रोटोकॉल 4 द्वारा प्रकाशित किया गया था. अंतिम टुकड़ापरख 4--हाइड्रोक्सी 3 hapten कि लक्ष्य एक आईजीई चर क्षेत्र के लिए एक माउस जीन के बहाव इसकी भारी श्रृंखला जीन क्लोनिंग से एक IgE एंटीबॉडी का उत्पादन वर्णित जो Neuberger 26 से अखबार में पीएसवी प्लाज्मिड के विकास के साथ आया की नाइट्रो-phenacetyl (एनपी), जिसके परिणामस्वरूप काइमेरिक एंटीबॉडी पूरी तरह कार्यात्मक था. भी यह बेसोफिल कोशिकाओं के degranulation को मापने के लिए एक उपयोगी प्रोटोकॉल बना परख के मानकीकरण में हुई आरबीएल कोशिकाओं की सतह पर अपने रिसेप्टर क्लोनिंग जबकि क्षमता, वही hapten को लक्षित किसी भी आईजीई विकसित करने के लिए.

परख भला और बुरा है. परख के पेशेवरों, हमारी प्रयोगशाला इस प्रकार मानव, कुत्ते और घोड़े प्रणालियों में degranulation के लिए परीक्षण करने के लिए इसका इस्तेमाल किया गया है किसी भी स्तनधारी प्रणाली में इस्तेमाल किया जा करने के लिए अपने अनुकूलन क्षमता है, और यह बस जीव के आईजीई synthesizing और इसके रिसेप्टर क्लोनिंग द्वारा प्राप्त है आरबीएल कोशिकाओं की सतह पर.

दूसरी ओर,परख का बुरा आरबीएल कोशिकाओं उन्हें एक ही परख भीतर degranulation स्तरों के विभिन्नता दे, जिससे थर्मल, यांत्रिक और पीएच परिवर्तन के प्रति बहुत संवेदनशील हैं. यह इस प्रकार दृढ़ता से assays के हमेशा triplicates में दोहराया जाता है और फिर एक औसत उन लोगों से लिया जाता है कि सलाह दी है. इसके अलावा, आरबीएल कोशिकाओं वे उनके रखरखाव बोझिल बना रही है, एक विस्तारित टाइम्स (> 10 सप्ताह) 27 के लिए टिशू कल्चर में छोड़ दिया जाता है अगर एक गैर रिहा फेनोटाइप की ओर शिफ्ट करने के लिए करते हैं. उन्होंने यह भी एक प्रकाश माइक्रोस्कोप से दिखाई नहीं हैं और सेल की आकृति विज्ञान बदल नहीं है जो माइकोप्लाज्मा बैक्टीरिया से संक्रमण, से ग्रस्त हैं, लेकिन काफी उनके degranulation का स्तर बदल जाएगा. इस प्रकार नियमित माइकोप्लाज्मा परीक्षण की जरूरत है.

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Protocol

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सेल लाइन के 1) तैयारी:

  1. घोड़े FcεRI α व्यक्त आरबीएल-2H3.1 सेल लाइन का विकास:
    1. 28: monolayer सेल लाइनों के लिए बुनियादी टिशू कल्चर तकनीक का उपयोग करना, घोड़े FcεRIα जीन (Y18204.1 GenBank) ले जाने, pEE6 प्लाज्मिड का उपयोग पैतृक आरबीएल-2H3.1 कोशिकाओं transfect. 1.2 X10 7 कोशिकाओं मिलीलीटर -1 के घनत्व पर कोशिकाओं के 0.8 मिलीलीटर प्लास्मिड डीएनए के 2 माइक्रोग्राम प्रति μl -1 जोड़ें. तो तुरंत 10 मिनट के लिए बर्फ पर सेते एक 0.4 सेमी electrocuvette का उपयोग कर 250 वी 960 μF में कोशिकाओं Electroporate.
    2. Geneticin G418 सल्फेट का 0.4 जी युक्त मीडिया का उपयोग बदल कोशिकाओं का चयन करें, तो एक फ्लोरोसेंट IgE एंटीबॉडी के साथ उन्हें टैगिंग द्वारा FACS के माध्यम से शेष जीवित कोशिकाओं को सॉर्ट. जांच 2, 3 के लिए घोड़े का FcεRIα सेल लाइन व्यक्त परिणामस्वरूप आरबीएल-2H3.1 का प्रयोग करें.
  2. प्री-परख एंटीबॉडी संवेदीकरण:
      5 सेल मिलीलीटर -1 के एक सेल घनत्व के लिए संस्कृति मीडिया में कोशिकाओं को फिर से निलंबित फिर धो लें.
    1. 1 एनजी मिलीलीटर -1 के अंतिम एकाग्रता के लिए निलंबित कोशिकाओं के लिए ब्याज की आईजीई जोड़ें तो कॉलम 1-6 पर एक 96 अच्छी तरह से थाली पर कोशिकाओं के 100 μl प्लेट और 37 डिग्री सेल्सियस 5% सीओ 2 के 90% पर सेते 16 घंटे के लिए सापेक्ष आर्द्रता. ऊष्मायन समय के बाद, और रिलीज परख प्रदर्शन से पहले, अच्छी तरह से confluency और सेल पालन के लिए एक खुर्दबीन के नीचे कुओं की जाँच करें.

2) रिलीज परख:

  1. कोशिकाओं वॉशिंग:
    1. गर्म रिलीज बफर 37 डिग्री सेल्सियस (25 मिमी पाइप, 120 मिमी सोडियम क्लोराइड, 5 मिमी पोटेशियम क्लोराइड, 0.04 मिमी मैग्नीशियम क्लोराइड, और 1 मिमी कैल्शियम क्लोराइड) कोमल सेल धोने के लिए अनुमति देने के लिए.
    2. , सेल मीडिया को दूर करने के लिए थाली flicking और गर्म 100 μl जोड़कर 3 कोशिकाओं को धो लें7 डिग्री सेल्सियस, रिहाई बफर. दो बार दोहराएँ.
  2. एंटीजन चुनौती:
    1. प्रतिजन के एक धारावाहिक कमजोर पड़ने 0 एनजी मिलीलीटर -1, 0.1 एनजी मिलीलीटर -1, 1 एनजी मिलीलीटर -1, 10 एनजी मिलीलीटर -1, 100 एनजी मिलीलीटर -1 के (जापानी-एचएसए या DNP-एचएसए), 1000 एनजी मिलीलीटर की तैयारी -1, 10,000 एनजी रिहाई बफर में मिलीलीटर -1 और 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म.
    2. दूसरा सेल धोने के बाद, मीडिया त्यागें और प्रतिजन समाधान के 100 μl के साथ बदल दिया. एक ही पंक्ति में कुओं (उदाहरण के लिए A1-6) उन से जोड़ा ही प्रतिजन एकाग्रता है कि सुनिश्चित करें.
    3. 0 एनजी मिलीलीटर -1 प्रतिजन जोड़कर पंक्ति में एक नकारात्मक नियंत्रण स्थापित करें. ट्राइटन एक्स बफर (5% ट्राइटन X-100) पंक्ति एच कोशिकाओं में कोशिकाओं lyse करने के द्वारा पीछा पंक्तियों (बीजी) नीचे बढ़ती प्रतिजन एकाग्रता जोड़ें एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा. 20 मिनट कोशिकाओं अपने मध्यस्थों जारी करने की अनुमति देने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  3. व्यक्तिगत अच्छी तरह से नियंत्रण की स्थापना:
    1. ऊष्मायन के बाद, थाली के अन्य आधा (कुओं A1-6 कुओं A7-12 करने, आदि) के लिए सेल सतह पर तैरनेवाला के 50 μl हस्तांतरण. सतह पर तैरनेवाला के शेष 50 μl त्यागें और स्तंभ 1-6 में कोशिकाओं के अंदर कुल मध्यस्थों के प्रतिशत के रूप में अच्छी तरह से कॉलम 7-12 में प्रत्येक में जारी मध्यस्थों की मात्रा का माप अनुमति देने के लिए ट्राइटन एक्स बफर के 50 μl के साथ की जगह .
  4. एनजाइम सब्सट्रेट:
  5. Β-hexosaminidase सब्सट्रेट (50 मिमी 4-nitrophenyl एन एसिटाइल-β-डी-glucosaminide साइट्रेट बफर के लिए 0.2 एम साइट्रिक एसिड और 0.2 एम सोडियम एसीटेट जोड़कर 2 मिमी नीचे पतला DMSO में तैयार, पीएच 4.5) के 50 μl जोड़ें सभी कुओं को β-hexosaminidase एंजाइम द्वारा 4-nitrophenol को सब्सट्रेट के रूपांतरण में मदद की है. 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते हैं.

चित्रा 2.4.1

  1. प्रतिक्रिया समाप्त:
    1. प्रत्येक को जोड़कर 150 μl Tris बफर (1 एम Tris-एचसीएल, पीएच 9) और साथ ही बफर के उच्च पीएच द्वारा प्रतिक्रिया बंद करो प्रतिक्रिया बंद हो जाता है और एक पीले रंग में 4-nitrophenol बदल जाता है.
  2. परिणाम पढ़ना और विश्लेषण:
    1. पीले रंग के absorbance को मापने के लिए 405 एनएम पर एक प्लेट स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग थाली पढ़ें. निम्न सूत्र का उपयोग जारी β-hexosaminidase के प्रतिशत की गणना:

चित्रा 2.6.1

  1. एक औसत प्रत्येक पंक्ति के लिए लिया जाता है, जिसके बाद प्रत्येक अच्छी तरह से, करने के लिए इस फार्मूले को लागू करें. A1 और उ 7 96 अच्छी तरह से थाली में कुओं के स्थान का प्रतिनिधित्व करते हैं. Agai (कुल मध्यस्थ रिलीज से मेल खाती है) β-hexosaminidase रिहाई के प्रतिशत के ग्राफ साजिशNST प्रतिजन एकाग्रता 2, 3.

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Representative Results

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पैतृक आरबीएल-2H3.1 कोशिकाओं और घोड़े का FcεRIα रिसेप्टर जीन के साथ ट्रांसफ़ेक्ट उन पहले माउस आईजीई विरोधी DNP-एचएसए के साथ अवगत और DNP-एचएसए प्रतिजन के साथ चुनौती दी थी. माउस आईजीई दोनों सेल लाइनों में अंतर्जात चूहे रिसेप्टर को बांधता है और इस प्रकार मध्यस्थों (चित्रा 1 ए) जारी करने के लिए दोनों सेल लाइनों की रिहाई व्यवहार्यता का परीक्षण करने के लिए एक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है. यह एक महत्वपूर्ण जांच है और सेल संस्कृति में विस्तारित (> 10 सप्ताह) पारित होने पर नियमित के बाद से बाहर किया जाना चाहिए, आरबीएल-2H3.1 कोशिकाओं गैर स्रावित फेनोटाइप 27 की ओर बहाव. घोड़े FcεRIα रिसेप्टर व्यक्त कोशिकाओं 5.76% ± 45.99% की एक चोटी मध्यस्थ जारी किया था, जबकि माता-पिता की कोशिकाओं, 4.79% ± 51.54% की एक चोटी मध्यस्थ रिहाई का समर्थन किया. फिर घोड़े आईजीई विरोधी जापानी-एचएसए के साथ अवगत और जापानी-एचएसए प्रतिजन (चित्रा 1 बी) के साथ चुनौती दी जहां ये एक ही सेल लाइनों. पैतृक कोशिकाओं के बाद से, मध्यस्थ रिलीज नहीं गुजरना थाघोड़े आईजीई अंतर्जात चूहे रिसेप्टर के लिए बाध्य नहीं है. उम्मीद के रूप में 4.88% ± 36.68% की एक चोटी पर रिहाई दे, घोड़े आईजीई विरोधी जापानी-एचएसए के साथ अवगत और जापानी-एचएसए प्रतिजन के साथ चुनौती दी जब दूसरी ओर, घोड़े FcεRIα रिसेप्टर व्यक्त आरबीएल-2H3.1 कोशिकाओं मध्यस्थ रिलीज कराना पड़ा .

इन परिणामों के घोड़े का आईजीई रिसेप्टर के माध्यम से मध्यस्थ रिहाई की जांच में इस रिलीज परख प्रोटोकॉल की दक्षता की पुष्टि. यह इस सेल लाइन पशु प्रयोगों के लिए आवश्यकता को कम करने के लिए इन विट्रो में घोड़े एलर्जी में गधे उपन्यास चिकित्सकीय हस्तक्षेप रणनीतियों के लिए खोज में एक उपयोगी नैदानिक ​​उपकरण है कि पता चलता है. एक ही प्रोटोकॉल भी मानव और कुत्ते FcεRIα रिसेप्टर्स के साथ ट्रांसफ़ेक्ट आरबीएल-2H3.1 कोशिकाओं के लिए लागू है.

इस प्रोटोकॉल भी आईजीई 30 एंटीबॉडी कुत्ते सीरम बेअसर करने के लिए प्रयास करता है कि एक संभावित प्रतिरक्षण रणनीति की सुरक्षा का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. परिणामों से(चित्रा 2) में यह प्रतिरक्षण रणनीति सुरक्षित नहीं है कि निर्धारित किया जा सकता है. मूल रूप से सीरम आईजीई बेअसर और इसके रिसेप्टर पर बाध्यकारी से रोकने के क्रम में इरादा था के रूप में विरोधी कुत्ते-आईजीई सीरम सफलतापूर्वक कुत्ते आईजीई के लिए बाध्य. लेकिन इस unspecific था बंधन, और इस प्रकार विरोधी आईजीई सीरम पार इस प्रतिरक्षण रणनीति एक विरोधी एलर्जी टीके के रूप में इस्तेमाल किया गया था अगर संभवतः एक सदमे में है, जिसके परिणामस्वरूप मध्यस्थ रिहाई, जिसके परिणामस्वरूप कोशिकाओं की सतह पर रिसेप्टर जुड़े.

आरबीएल-2H3.1 इक्वाइन FcεRIα जताते - - प्रयोगशाला में उत्पादित
इक्वाइन आईजीई विरोधी जापानी-एचएसए - - प्रयोगशाला में उत्पादित
96 अच्छी तरह से थाली सिग्मा CLS3595 -
मल्टी चैनल पिपेट Anachem - -
अण्डे सेने की मशीन गैलेक्सी आर - -
4Hydroxy-5-iodo-3-nitrophenylacetic एसिड कैंब्रिज रिसर्च बायोकेमिकल्स एन-1070-1 जापानी-ओह प्रयोगशाला में जापानी-एचएसए बनाने के लिए मानव सीरम albumin के साथ संयुग्मित किया गया था
मानव सीरम albumin को Dinitrophenyl संयुग्मित सिग्मा A6661 संक्षिप्त DNP-एचएसए
प्लेट स्पेक्ट्रोफोटोमीटर Anthos LABTEC HT2 - -
पाइप्स सिग्मा P1851 -
सोडियम क्लोराइड सिग्मा S7653 -
पोटेशियम क्लोराइड सिग्मा P9333 -
मैग्नेशियम क्लोराइड सिग्मा M2670 -
कैल्शियम क्लोराइड सिग्मा C1016 -
ट्राइटन X100 सिग्मा X100 -
4-nitrophenyl एन एसिटाइल-β-डी-glucosaminide सिग्मा N9376 स्टॉक समाधान बुलाया β-hexosaminidase सब्सट्रेट 50mm DMSO में तैयार किया गया था
डाइमिथाइल sulfoxide सिग्मा D2650 -
साइट्रिक एसिड सिग्मा 251275 -
सोडियम एसीटेट सिग्मा S7670 -
Tris सिग्मा T5941 -

तालिका 1: सामग्री और उपकरण की तालिका:

चित्रा 1
चित्रा 1: एक नहीं घोड़े का FcεRIα व्यक्त और माउस आईजीई विरोधी DNP-एचएसए का उपयोग रिसेप्टर व्यक्त आरबीएल-2H3.1 कोशिकाओं पर preformed रिहाई परख से पता चलता है. इस प्रकार दोनों सेल लाइनों व्यवहार्य हैं और समर्थन करने वाले, पुष्टि DNP-एचएसए प्रतिजन के साथ चुनौती दी प्रतिजन प्रेरित मध्यस्थ रिलीज 2, 3 आईजीई की मध्यस्थता. ग्राफ बी preformed रिहाई परख से पता चलता है जब माउस आईजीई मध्यस्थ रिहाई में जिसके परिणामस्वरूप अंतर्जात चूहे रिसेप्टर को बांधता सेल संवेदीकरण के लिए घोड़े का आईजीई विरोधी जापानी-एचएसए का उपयोग, FcεRIα और उन व्यक्त घोड़े का FcεRIα घोड़े व्यक्त नहीं जो आरबीएल-2H3.1 पैतृक कोशिकाओं पर. घोड़े आईजीई मध्यस्थ रिहाई में परिणाम, अंतर्जात चूहे रिसेप्टर घोड़े रिसेप्टर को बांधता है, लेकिन नहीं, कोशिकाओं घोड़े रिसेप्टर समर्थन व्यक्त करते हुए यह मध्यस्थ मध्यस्थों जारी नहीं किया पैतृक कोशिकाओं के बाद से इसकी पुष्टि की है घोड़े आईजीई की मध्यस्थता, प्रतिजन प्रेरित , मध्यस्थ 3, 2 रिलीज.

चित्रा 2
चित्रा 2: प्रतिरक्षण रिहाई परख परिणाम: ग्राफ सेल संवेदीकरण के लिए कुत्ते आईजीई विरोधी जापानी-एचएसए का उपयोग, कुत्ते FcεRIα व्यक्त आरबीएल-2H3.1 कोशिकाओं पर preformed रिहाई परख से पता चलता है, और प्रतिजन के रूप में प्रतिरक्षित चूहा विरोधी कुत्ते-आईजीई सीरम. इस्तेमाल किया नियंत्रण सीरम पूर्व प्रतिरक्षित किया गया था, और सकारात्मक नियंत्रण जापानी-एचएसए प्रतिजन था. कुत्ते आईजीई कुत्ते रिसेप्टर को बांधता है. इसके अलावा, विरोधी आईजीई सीरम मध्यस्थ रिहाई में जिसके परिणामस्वरूप कोशिकाओं की सतह पर, रिसेप्टर बाध्य कुत्ते आईजीई और पार लिंक यह, और रिसेप्टर को बांधता है. यह प्रभाव में, इस विशेष टीकाकरण रणनीति एक सदमे की प्रतिक्रिया का कारण करने की क्षमता है, और इस प्रकार 30 सुरक्षित नहीं माना जाता है कि साबित होता है.

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Discussion

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सारांश में इस जांच के परिणाम घोड़े का FcεRIα व्यक्त आरबीएल-2H3.1 कोशिकाओं एक प्रतिजन द्वारा घोड़े का आईजीई के साथ अवगत और चुनौती दी है, वे अंदर मध्यस्थ की कुल राशि का 4.88% ± 36.68% की एक चोटी मध्यस्थ रिहाई दे कि पता चला कोशिकाओं, आरबीएल-2H3.1 की तुलना में माता-पिता की कोशिकाओं घोड़े का FcεRIα व्यक्त नहीं.

इस प्रकार इस परख की जांच और इन विट्रो में घोड़े एलर्जी प्रतिक्रियाओं के अध्ययन के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करता है. इसके मस्तूल सेल / बेसोफिल वंश की कोशिकाओं द्वारा जारी मध्यस्थ की मात्रा का निर्धारण करने की अनुमति देता है और इस प्रकार, घोड़े एलर्जी में अनुसंधान अग्रिम की उम्मीद एजेंटों के कारण एलर्जी का आकलन करने, या एजेंटों को अवरुद्ध आईजीई / रिसेप्टर शोध है कि क्या किया जा सकता है.

इस परख ही उद्देश्यों के लिए मानव और कुत्ते एलर्जी 4529 का अध्ययन करने के लिए इसका इस्तेमाल किया है कि पिछले प्रकाशनों से घोड़े एलर्जी अध्ययन करने के लिए संशोधित किया गया था. इंजीनियर सेल लाइनमानव व्यक्त किया है और कुत्ते FcεRIα ऐसे आईजीई / रिसेप्टर बातचीत 30 के निषेध को लक्षित टीके के रूप में एलर्जी अवरुद्ध एजेंटों की प्रभावकारिता और सुरक्षा का अध्ययन करने के लिए कार्यरत थे. जांच भी कुत्तों 24 में आईजीई की मध्यस्थता एलर्जी प्रतिक्रियाओं attenuating के लिए एक टीके के रूप में दूसरों के द्वारा प्रस्तावित किया गया था, जो पूरे Cε3 डोमेन, जिसमें immunogens की एक anaphylactogenic पक्ष प्रभाव का पता चला. हमारी जांच के आधार पर, इस संभावित गंभीर जटिलता के लिए आणविक आधार आईजीई जब छिप नहीं रहे Cε3 में epitopes लक्ष्य और जो विरोधी IgE एंटीबॉडी युक्त विरोधी आईजीई प्रतिरक्षा सीरम द्वारा IgE एंटीबॉडी में epitopes की मान्यता के आधार पर युक्तिसंगत बनाया जा सकता है इसके रिसेप्टर को complexed है. इस अवलोकन इस परख प्रणाली के अभाव में बनाया और भी इन विवो immuni पर आधारित विरोधी एलर्जी हस्तक्षेप रणनीति की जांच की है जो 24 से जांच करने के लिए हड़ताली इसके विपरीत है किया गया है नहीं कर सकाCε3 डोमेन के साथ zation, लेकिन कारण इस तरह के एक परख की अनुपस्थिति को रणनीति की सुरक्षा पर विचार-विमर्श नहीं किया है.

इस प्रोटोकॉल का महत्वपूर्ण कदम आरबीएल-2H3.1 कोशिकाओं के बहुमत स्रावित phenotype की हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए है; अधिक से अधिक से अधिक 10 सप्ताह उन कारणों संस्कृति में कोशिकाओं होने की परवाह किए बिना वे ब्याज की क्लोन FcεRIα व्यक्त या नहीं की गैर स्रावित फेनोटाइप 27 की ओर बहाव के लिए शुरू करने के लिए. इसलिए यह प्रयोग (चित्रा 1) के साथ माउस आईजीई सकारात्मक नियंत्रण चलाने के लिए, और कोशिकाओं स्रावित की एक बड़ी जमे हुए शेयर को बनाए रखने के लिए हमेशा आवश्यक है.

इसके अलावा, सभी buffers की पीएच सही होने चाहिए या वे झूठी नकारात्मक परिणाम देने का जोखिम; बफ़र्स की शेल्फ जीवन का विस्तार उनके पीएच बदल, और इस तरह किसी भी 2 महीने से अधिक पुराने खारिज किए जाने की आवश्यकता बफर.

तकनीक आरबीएल-2H3.1 सीई के साथ एक रसायन की बातचीत से पता चलता हैLLS, यह, या दबा, इन विट्रो में उनके मध्यस्थ रिहाई को बढ़ावा देता है और कैसे. इस संभावित विरोधी एलर्जी चिकित्सीय रणनीतियों शोध जब विवो में क्या हो सकता है की एक अच्छा संकेत है, इस प्रकार इस प्रोटोकॉल एक आवश्यक कदम है. तकनीक, हालांकि, ब्याज की अणु के साथ सूचना का आदान प्रदान एंटीबॉडी / रिसेप्टर परिसर का हिस्सा है जो संकेत नहीं है.

कुछ विसंगति ऐसे से मोरन एट अल. 31 सीए को परीक्षण करने के लिए कुल घोड़े सीरम का उपयोग करते समय 2 + बाढ़ के रूप में अन्य प्रकाशकों के साथ देखा जा सकता है यही वजह है कि घोड़े राव आईजीई मध्यस्थता से संबंधित नहीं है संकेत दिया है कि इस तरह के रूप में 20 अन्य शोध कार्य, राव अलग एंटीबॉडी सेलुलर सीए 2 + बाढ़ के लिए जिम्मेदार होगा, जिसके लिए unspecific reaginic एंटीबॉडी का उपयोग कर घोड़ों पीड़ित.

इस परख ऐसे मनुष्यों और के रूप में भी अन्य जीवों के लिए लागू किया जा सकता है जो आईजीई मध्यस्थता hypersensitivities, के लिए विशिष्ट है29 कुत्तों, और विशेष रूप से इस तरह के सिंथेटिक / काइमेरिक विरोधी एलर्जी एंटीबॉडी के रूप में 30 विरोधी एलर्जी हस्तक्षेप रणनीतियों, की सुरक्षा का परीक्षण करने के लिए प्रयोग किया जाता है.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
RBL-2H3.1 Expressing Equine FcεRIα - - Produced in the lab
Equine IgE anti NIP-HSA - - Produced in the lab
96 Well Plate Sigma CLS3595 -
Multi Channel Pipette Anachem - -
Incubator Galaxy R - -
4Hydroxy-5-iodo-3-nitrophenylacetic acid Cambridge Research Biochemicals N-1070-1 NIP-OH was conjugated with Human Serum Albumin to make NIP-HSA in the lab
Dinitrophenyl Conjugated to Human Serum Albumin Sigma A6661 Abbreviated DNP-HSA
Plate Spectrophotometer Anthos Labtec HT2 - -
Pipes Sigma P1851 -
Sodium Chloride Sigma S7653 -
Potassium Chloride Sigma P9333 -
Magnesium Chloride Sigma M2670 -
Calcium Chloride Sigma C1016 -
Triton x100 Sigma X100 -
4-nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide Sigma N9376 Stock solution called β-hexosaminidase substrate was 50mM prepared in DMSO
Dimethyl Sulfoxide Sigma D2650 -
Citric Acid Sigma 251275 -
Sodium Acetate Sigma S7670 -
Tris Sigma T5941 -

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References

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Sabban, S., Ye, H., Helm, B. Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor FcεRI. J. Vis. Exp. (93), e52222, doi:10.3791/52222 (2014).More

Sabban, S., Ye, H., Helm, B. Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor FcεRI. J. Vis. Exp. (93), e52222, doi:10.3791/52222 (2014).

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