Introduction
Allergi har været kendt i årtusinder. En astma behandling blev beskrevet i den gamle egyptiske medicinsk tekst kendt som Ebers Papyrus (~ 1550 fvt) og drøftet naturlægemidler at behandle det 7.
Dag allergi er klassificeret som en type I overfølsomhedsreaktion, hvor T hjælper celle type 2 (TH 2) arm af immunsystemet styrer produktionen af immunoglobulin E (IgE) antistoffer som reaktion på miljømæssige antigener kaldes allergener. Disse er forskellige stoffer, der almindeligvis interagerer med celler i immunsystemet og stimulere syntesen og sekretionen af pro-inflammatoriske cytokiner, herunder interleukin-4 og interleukin-13 8, 9, som har partikler i cigaretrøg eller diesel udstødning partikler, der kan forbedre IgE-syntese 10.
Stigningen i allergiske manifestationer i de industrialiserede lande i de sidste 50 år er blevet tilskrevet en kombination af effekten afmiljøforurening og en tendens til en mere sminket miljø, der kombinerer at flytte immunrespons over en profil domineret af TH 2 cytokiner, som foreslået af "Hygiejne Hypotese« 11.
Som nævnt ovenfor, mennesker ikke er de eneste pattedyr, der lider af allergi. Navnlig heste og hunde kan også udvikle klassiske allergiske reaktioner og en undersøgelse af 12 har vist, at som hos mennesker, heste allergi tilskrives genetiske og miljømæssige faktorer. Som en konsekvens, præsentere gode modeller for at studere samspillet mellem genetiske og miljømæssige årsager til allergi, dens progression fra overfølsomhed over for sygdom, og mulige interventionsstrategier engang kliniske manifestationer har sat i disse dyr
I 1887 Stömmer var den første person til at beskrive ligheden mellem menneske og equin astma 13, virkningen af histamin på heste kardiovaskulære system ermeget ligner mennesker 14. Heste er også hjørnestenen i hestevæddeløb industrien, som er værd US 72 milliarder dollar med en betting omsætning på US 115 milliarder dollar årligt 15.
De fleste nutidige væddeløbsheste er efterkommere af det lille antal af araberheste opdrættet af Lady Anne Blunt fra 1878 og fremefter. Moderne væddeløbsheste er almindeligt indavlet til at vælge for ydeevne evner. De er tilbøjelige til genetiske sygdomme, hvoraf den ene er deres modtagelighed at montere allergiske reaktioner. De har også 1000 gange højere serum-IgE-niveauer end selv de hårdest allergiske mennesker 16. Horse allergiske reaktioner er normalt manifesterer sig som insektbid overfølsomhed (IBH) 17, 18. IBH resultater i dermatitis på grund af bid danner insekter i slægten Culicoides. En anden form for equin allergisk sygdom er tilbagevendende luftvejsobstruktioner (RAO), er dette udtryk i lunger og luftveje. Det er karakteriseret ved hvæsen og labORed vejrtrækning. RAO almindeligvis sker som reaktion på svampesporer, og er blevet registreret høje allergenspecifikke IgE-niveauer hos heste, der lider af RAO i en undersøgelse 19 selv om en anden undersøgelse har ikke bekræftet denne 20.
Undersøgelser equin allergi drejet omkring forsøg på overvågning og neutralisere heste IgE ved at udvikle anti-heste IgE monoklonale antistoffer (mAb'er) 21, 22. Endvidere undersøgelsen med 23 diskuterer fremstillingen af de ekstracellulære domæner af heste- høj affinitet Fc receptors α kæde (FcERla) receptoren i et forsøg på at detektere og kvantificere equin serum IgE. En beslægtet undersøgelse af Ledin 24 diskuterer en ny tilgang med henblik på at neutralisere serum IgE ved priming immunforsvaret ved hjælp af en selv / ikke-selv immunogen. Alle disse undersøgelser har imidlertid manglet en effektiv assay til at teste sikkerheden og effektiviteten af deres protokoller. I denne artikel præsenterer vi nu sådan analyse system, der gælder for studiet af diagnostiske og terapeutiske strategier er relevante for heste-systemet, hvor β-hexosaminidase release, som en indikator for celle mediator degranulation, blev vurderet på RBL-2H3.1 celler, der udtrykker equin FcERla. Denne protokol er baseret på tidligere publikationer 25, 4, 5, 2, 3 beskriver konstruktionen af RBL-celler transficeret med det gen, der koder for det IgE-bindende domæne af højaffinitetsreceptoren for IgE fra forskellige arter. Protokollen forklarer, hvordan man udfører en β-hexosaminidase release assay, hvis resultater er præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse af tredobbelte eksperimenter.
Frigivelsen assay blev først udviklet af Siraganian og Hook 25 for at studere menneskelig allergi. Laboratoriet gruppe ledet af Dr. Reuben Siraganian også udviklet RBL cellelinje. Disse RBL-celler blev udviklet til at udtrykke den menneskelige FcERla og protokollen blev offentliggjort af 4. Den sidste brikaf assayet kom med udviklingen af pSV plasmid i papiret ved Neuberger 26, som beskrev fremstillingen af en IgE-antistoffer ved kloning af sin tunge kæde gen nedstrøms for en mus gen for en IgE variabel region, der er rettet mod haptenet 4-hydroxy-3 nitro-phenacetyl (NP), den resulterende kimære antistof var fuldt funktionsdygtig. Evnen til at udvikle nogen IgE rettet mod samme hapten, samtidig kloning dens receptor på overfladen af RBL-celler resulterede i standardisering af analysen gør det til et nyttigt protokol til måling af degranulering af basofile celler.
Assayet ikke har fordele og ulemper. Professionelle af analysen er dets tilpasningsevne, der skal anvendes i en hvilken som helst pattedyr-systemet har vores laboratorium således anvendes det til at teste for degranulering i mennesker, hunde og heste systemer, og det er muligt blot ved at syntetisere organismens IgE og kloning dets receptor på overfladen af RBL-celler.
På den anden side,ulemper ved assayet er, at RBL-celler er meget følsomme over for termisk, mekanisk og pH-ændringer, hvilket gør dem give en variation af degranulering niveauer inden for samme assay. Det er således anbefales, at analyserne altid gentages i tre eksemplarer, og derefter et gennemsnit er taget fra dem. Endvidere RBL-celler tendens til at flytte mod en ikke-frigørende fænotype, hvis de efterlades i vævskultur i en længere tid (> 10 uger) 27, hvilket gør deres vedligeholdelse besværlig. De er også udsat for infektioner med Mycoplasma bakterier, som ikke er synlige fra et lysmikroskop og ikke ændrer cellens morfologi, men ville drastisk ændre deres degranulering niveauer. Således er der behov for regelmæssig mycoplasma tests.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1) Fremstilling af cellelinie:
- Udvikling af RBL-2H3.1 cellelinie, der udtrykker equine FceRI α:
- Brug af grundlæggende vævsdyrkningsteknikker for monolag cellelinjer, transficere forældrenes RBL-2H3.1 celler under anvendelse af pEE6 plasmid, der transporterer heste FcERla genet (GenBank: Y18204.1) 28. Tilsæt 2 ug pi -1 af plasmid-DNA'et til 0,8 ml celler ved en densitet på 1,2 x10 7 celler ml-1. Elektroporere cellerne ved 250 V 960 uF anvendelse af en 0,4 cm electrocuvette derefter straks inkuberes på is i 10 min.
- Vælg de transformerede celler ved hjælp af medier, der indeholder 0,4 g af geneticin G418 sulfat, derefter sortere resterende levende celler gennem FACS ved at mærke dem med et fluorescerende IgE antistof. Brug den resulterende RBL-2H3.1 udtrykker equin FcERla cellelinie for undersøgelsen 2, 3.
- Pre-assay antistof sensibilisering:
- Tilsæt IgE af interesse for de suspenderede celler til en slutkoncentration på 1 ng ml-1, så pladen 100 pi celler på en plade med 96 brønde i kolonne 1-6 og inkuberes ved 37 ° C + 5% CO 2 + 90% relativ fugtighed i 16 timer. Efter inkubationstiden, og før udførelse af frigivelsesassayet, tjek brøndene under et mikroskop for godt sammenløb og cellevedhæftning.
2) Slip-assay:
- Vask af cellerne:
- Varm release buffer (25 mM PIPES, 120 mM natriumchlorid, 5 mM kaliumchlorid, 0,04 mM magnesiumchlorid og 1 mM calciumchlorid) ved 37 ° C for at tillade til skånsom cellevask.
- Vask cellerne ved at stille pladen for at fjerne celle medier og tilsætning af 100 pi varm, 37 ° C, release buffer. Gentag to gange.
- Antigen udfordring:
- Forberede en seriel fortynding af antigen (NIP-HSA eller DNP-HSA) fra 0 ng ml-1, 0,1 ng ml-1, 1 ng ml-1, 10 ng ml-1, 100 ng ml-1, 1.000 ng ml -1, 10.000 ng ml-1 i frigivelsesbuffer og varme ved 37 ° C.
- Efter den anden celle vask, kassere medierne og erstattet med 100 pi af antigen løsninger. Sikre, at brønde i den samme række (A1-6 for eksempel) har samme antigenkoncentration føjet til dem.
- Opsæt en negativ kontrol i række A ved tilsætning af 0 ng ml -1 antigen. Tilføj stigende antigenkoncentration ned rækkerne (BG) efterfulgt af triton-x buffer (5% Triton X-100) i række H-celler til at lysere cellerne, der skal anvendes som en positiv kontrol. Der inkuberes ved 37 ° C i 20 minutter for at tillade cellerne at frigive de mediatorer.
- Opsætning individuel brønd kontrol:
- Efter inkubationen overføres 50 pi cellesupernatant til den anden halvdel af pladen (brønde A1-6 til brønde A7-12, etc.). Kassere de resterende 50 pi supernatant og erstatte med 50 pi af triton-x buffer for at tillade måling af den mængde af frigivne mediatorer i hver brønd i kolonne 7-12 som en procentdel af de samlede mediatorer inde i cellerne i kolonne 1-6 .
- Enzym substrat:
- Der tilsættes 50 pi β-hexosaminidase substrat (50 mM 4-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid fremstillet i DMSO fortyndes ned til 2 mM ved at tilføje det citratpuffer 0,2 M citronsyre og 0,2 M natriumacetat, pH 4,5) til alle brønde for at lettes omdannelsen af substrat til 4-nitrophenol ved β-hexosaminidase enzym. Pladerne inkuberes ved 37 ° C i 2 timer.
- Afslutning af reaktionen:
- Reaktionen standses ved tilsætning af 150 pi Tris-puffer (1 M Tris-HCI, pH 9) til hver brønd som den høje pH af bufferen stopper reaktionen og fik 4-nitrophenol i en gul farve.
- Læsning og analyse af resultaterne:
- Aflæs pladen ved hjælp af en plade spektrofotometer ved 405 nm til måling af absorbansen af den gule farve. Beregnes procentdelen af frigivet β-hexosaminidase hjælp af følgende formel:
- Anvende denne formel til hver brønd, hvorefter et gennemsnit tages for hver række. A1 og A7 repræsenterer placeringen af brøndene i 96-brønds plade. Plotte en graf af procentdelen af β-hexosaminidase frigivelse (der svarer til den samlede mediatorfrigivelse) agaiNST antigenkoncentration 2, 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De parentale RBL-2H3.1 og celler transficeret med heste FcERla receptor-genet blev først sensibiliseret med muse-IgE anti DNP-HSA og udfordret med DNP-HSA antigen. Mus IgE binder til endogene rotte-receptoren i begge cellelinier og virker således som en kontrol for at teste frigivelse levedygtighed begge cellelinier til at frigive mediatorer (figur 1 A). Dette er en vigtig kontrol og bør udføres rutinemæssigt siden på forlænget (> 10 uger) passage i cellekultur, RBL-2H3.1 celler tendens i retning af ikke-secernerende fænotype 27. De parentale celler støttede en top mediator frigivelse af 51,54% ± 4,79%, mens de celler, der udtrykker heste FcERla receptor havde en top mediator frigivelse af 45,99% ± 5,76%. Disse samme cellelinier hvor derefter sensibiliseret med equin IgE anti NIP-HSA og udfordret med NIP-HSA antigen (figur 1 B). Parentale celler undergik ikke mediatorfrigivelse, eftersomheste IgE binder ikke til det endogene rotte-receptoren. På den anden side, som forventet, RBL-2H3.1 celler, der udtrykker heste FcERla receptor undergik mediatorfrigivelse når sensibiliseret med heste IgE anti NIP-HSA og udfordret med NIP-HSA antigen, hvilket giver en maksimal frigivelse af 36,68% ± 4,88% .
Disse resultater bekræfter effektiviteten af denne udgivelse assayprotokol i efterforskningen af mediatorfrigivelse via equin IgE receptor. Det viser, at denne cellelinie er et nyttigt diagnostisk redskab i bestræbelserne på at vurdere nye terapeutiske interventionsstrategier på heste- allergi in vitro reducere behovet for dyreforsøg. Den samme protokol gælder også for RBL-2H3.1 celler transficeret med de menneskelige og hunde FcERla receptorer.
Denne protokol blev også anvendt til at teste sikkerheden for en potentiel immunisering strategi, der forsøger at neutralisere hunde IgE antistoffer 30. Ud fra resultaternei (figur 2) kan det bestemmes, at immunisering strategi er ikke sikker. Anti-hunde-IgE serum held bundet til hunde IgE, som oprindeligt blev beregnet for at neutralisere serum IgE og forhindre det i at binde på dens receptor. Men denne binding var uspecifikt og dermed anti-IgE serum tværbundet receptoren på cellernes overflade, hvilket resulterer i frigivelse af mediatorer, hvilket potentielt kan medføre en anafylaktisk chok, hvis denne immunisering strategi blev anvendt som et anti-allergi vaccine.
| RBL-2H3.1 udtrykker Equine FcERla | - | - | Produceret i laboratoriet |
| Equine IgE anti NIP-HSA | - | - | Produceret i laboratoriet |
| 96 Well Plate | Sigma | CLS3595 | - |
| Multi Channel Pipette | Anachem | - - | |
| Inkubator | Galaxy R | - | - |
| 4-hydroxy-5-iod-3-nitrophenyleddikesyre | Cambridge Research Biochemicals | N-1070-1 | NIP-OH blev konjugeret med humant serumalbumin at NIP-HSA i laboratoriet |
| Dinitrophenyl konjugeret til humant serumalbumin | Sigma | A6661 | Forkortet DNP-HSA |
| Plate Spektrofotometer | Anthos Labtec HT2 | - | - |
| Rør | Sigma | P1851 | - |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | - |
| Kaliumchlorid | Sigma | P9333 | - |
| Magnesium Chloride | Sigma | M2670 | - |
| Calcium Chloride | Sigma C1016 | - | |
| Triton X100 | Sigma | X100 | - |
| 4-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid | Sigma | N9376 | Stamopløsning kaldes β-hexosaminidase substrat blev 50 mM fremstillet i DMSO |
| Dimethylsulfoxid | Sigma | D2650 | - |
| Citronsyre | Sigma | 251.275 | - |
| Natriumacetat | Sigma | S7670 | - |
| Tris | Sigma | T5941 | - |
Tabel 1: Tabel over materiel og udstyr:
Figur 1: A viser frigivelsesassayet preformed på RBL-2H3.1 celler ikke udtrykker equin FcERla og udtrykker receptoren ved hjælp af musen IgE anti DNP-HSA. Musen IgE binder til endogene rotte-receptoren resulterer i mediatorfrigivelse når udfordret med DNP-HSA antigen, hvilket således bekræfter, at begge cellelinier er levedygtige og støtte IgE-medieret antigen-induceret mediatorfrigivelse 2, 3. Graph B viser frigivelsen assay præformede på RBL-2H3.1 parentale celler, som ikke udtrykker equin FcERla og de udtrykker equin FcERla, ved hjælp af heste IgE anti NIP-HSA for cellesensibilisering. Heste IgE binder til heste receptor, men ikke det endogene rotte-receptoren, til at resultere i mediatorfrigivelse, dette bekræftes, da stamcellerne ikke frigive mæglerens mediatorer, mens celler, der udtrykker heste receptor støtte heste IgE-medieret antigen-induceret , mediatorfrigivelse 2, 3.
Figur 2: Immunisering frigivelse analyseresultater: Grafen viser frigivelsesassayet præformet på RBL-2H3.1 celler, der udtrykker hunde FcERla, ved hjælp af hunde IgE anti NIP-HSA for cellesensibilisering og immuniseret rotte-anti-hunde-IgE serum som antigenet. Kontrol anvendte blev præ-immuniseret serum, og den positive kontrol var NIP-HSA antigen. Hunde IgE binder til hunde receptor. Endvidere anti-IgE serum binder til receptoren bundet hunde IgE og tværbindinger den, og receptoren på cellernes overflade resulterer i mediatorfrigivelse. Dette i realiteten viser, at denne særlige immunisering strategi har potentiale til at forårsage en anafylaktisk chok reaktion, og betragtes således ikke sikkert 30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sammenfattende resultaterne af denne undersøgelse viste, at når RBL-2H3.1 celler, der udtrykker hestefamilien FcERla er sensibiliseret med equin IgE og udfordret af et antigen, de giver et højdepunkt mediatorfrigivelse på 36,68% ± 4,88% af den samlede mængde af mediator indeni celler, sammenlignet med RBL-2H3.1 parentale celler som ikke udtrykker equin FcERla.
Således denne analyse giver et nyttigt redskab til at undersøge og studere hestesygdomme allergiske reaktioner in vitro. Dens muliggør bestemmelse af den mængde mediator af celler af mastcelle / basofil afstamning og således kan forventes at fremme forskning i heste allergi, uanset vurdere allergifremkaldende stoffer eller forske IgE / receptor-blokerende midler.
Dette assay blev modificeret til at studere equin allergi fra tidligere publikationer, der brugte det til at studere menneskelige og hunde allergi 4529 til samme formål. Det manipulerede cellelinjer udtrykker human og hunde FcERla var ansat til at undersøge effekten og sikkerheden af allergi blokerende midler såsom vacciner rettet mod hæmning af IgE / receptor interaktion 30. Undersøgelsen afslørede en anaphylactogenic bivirkning af immunogener omfatter hele Cε3 domæne, som også blev foreslået af andre som en vaccine til svækkelse af IgE-medierede allergiske reaktioner hos hunde 24. Baseret på vores undersøgelse, kan den molekylære basis for denne potentielt alvorlig komplikation rationaliseres på grundlag af anerkendelse af epitoper i IgE-antistof af anti-IgE immune serum, der indeholder anti-IgE antistoffer, som er rettet mod epitoper i Cε3 og ikke dækkes, når IgE er kompleksbundet til dets receptor. Denne observation kunne ikke er blevet gjort i fravær af denne analyse, og er i slående kontrast til undersøgelsen ved 24, som også undersøgte anti-allergi indgriben strategi baseret på in vivo immunining med Cε3 domæner, men har ikke diskuteret sikkerheden af strategien på grund af fraværet af en sådan analyse.
De kritiske trin i denne protokol er at sikre, at hovedparten af RBL-2H3.1 celler er af hemmelig fænotype; har de celler i kultur er større end 10 uger får dem til at begynde at glide i retning af den ikke-secernerende fænotype 27, uanset om de udtrykte klonede FcERla af interesse eller ej. Derfor er det altid vigtigt at køre muse IgE positive kontroller sammen eksperimentet (figur 1), og til at opretholde en stor frossen stamopløsning af secernerende celler.
Desuden skal pH-værdien af alle buffere være korrekte, eller de risikerer at give falske negative resultater; forlængelse af holdbarheden af buffere ændrer deres pH, og en eventuel buffer ældre end 2 måneder skal kasseres.
Teknikken viser interaktionen af et kemikalie med RBL-2H3.1 ceLLS, og hvordan det fremmer eller udelader, deres mediatorfrigivelse in vitro. Det er en god indikation af, hvad der kan ske in vivo, og dermed denne protokol er et vigtigt skridt, når forske potentielle anti-allergi terapeutiske strategier. Teknikken er imidlertid ikke angive, hvilken del af antistof / receptor-komplekset molekylet af interesse vekselvirker med.
Anden forskning arbejde, såsom 20 har tilkendegivet, at equin RAO ikke er relateret til IgE mægling, hvilket er hvorfor nogle uoverensstemmelse kan ses med andre udgivere såsom Moran et al. 31, når du bruger den samlede equine serum for at teste til Ca 2+ tilstrømning fra RAO lider heste ved hjælp af uspecifikke reaginic antistoffer, for hvilke forskellige antistoffer vil være ansvarlig for den cellulære Ca 2+ tilstrømning.
Dette assay er specifik for IgE medieret overfølsomhed, som også kan anvendes til andre organismer, såsom mennesker oghunde 29 og specifikt anvendes til at teste sikkerheden af anti-allergi interventionsstrategier, såsom syntetiske / kimære anti-allergi-antistoffer 30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RBL-2H3.1 Expressing Equine FcεRIα | - | - | Produced in the lab |
| Equine IgE anti NIP-HSA | - | - | Produced in the lab |
| 96 Well Plate | Sigma | CLS3595 | - |
| Multi Channel Pipette | Anachem | - | - |
| Incubator | Galaxy R | - | - |
| 4Hydroxy-5-iodo-3-nitrophenylacetic acid | Cambridge Research Biochemicals | N-1070-1 | NIP-OH was conjugated with Human Serum Albumin to make NIP-HSA in the lab |
| Dinitrophenyl Conjugated to Human Serum Albumin | Sigma | A6661 | Abbreviated DNP-HSA |
| Plate Spectrophotometer | Anthos Labtec HT2 | - | - |
| Pipes | Sigma | P1851 | - |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | - |
| Potassium Chloride | Sigma | P9333 | - |
| Magnesium Chloride | Sigma | M2670 | - |
| Calcium Chloride | Sigma | C1016 | - |
| Triton x100 | Sigma | X100 | - |
| 4-nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide | Sigma | N9376 | Stock solution called β-hexosaminidase substrate was 50mM prepared in DMSO |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D2650 | - |
| Citric Acid | Sigma | 251275 | - |
| Sodium Acetate | Sigma | S7670 | - |
| Tris | Sigma | T5941 | - |
References
- Taudou, G., et al. Expression of the Alpha Chain of Human FcεRI in Transfected Rat Basophilic Leukemia Cells: Functional Activation after Sensitization with Human Mite-Specific IgE. Int Arch Allergy Immunol. 100 (4), 344-350 (1993).
- Sabban, S. Development of an in Vitro Model System for Studying the Interaction of EquuscaballusIgE with Its High-Affinity FcεRI Receptor. , The University of Sheffield. Sheffield. (2011).
- Sabban, S., Ye, H., Helm, B. A. Development of an in Vitro Model System for Studying the Interaction of EquuscaballusIgE with Its High-Affinity Receptor FcεRI. Vet ImmunolImmunopathol. 153 (1-2), 6-10 (2013).
- Wilson, A. P. M., Pullar, C. E., Camp, A. M., Helm, B. A. Human IgE mediates stimulus secretion coupling in rat basophilic leukemia cells transfected with the a chain of the human high-affinity receptor. Eur J Immunol. 23, 240-244 (1993).
- Hunter, M. J., Vratimos, A. P., Housden, J. E. M., Helm, B. A. Generation of canine-human Fc IgE chimeric antibodies for the determination of the canine IgE domain of interaction with FcεRIα. MolImmunol. 45 (8), 2262-2268 (2008).
- Rashid, A., et al. Review: Diagnostic and therapeutic applications of rat basophilic leukemia cells. MolImmunol. 52 (3-4), 224-228 (2012).
- Cohen, S. G. Asthma in antiquity: the Ebers Papyrus. Allergy Proc. 13 (3), 147-154 (1992).
- Dudler, T., et al. A link between catalytic activity, IgE-independent mast cell activation, and allergenicity of bee venom phospholipase A2. J. Immunol. 155, 2605-2613 (1995).
- Machado, D. C., Horton, D., Harrop, R., Peachell, P. T., Helm, B. A. Potential allergens stimulate the release of mediators of the allergic response from cells of mast cell lineage in the absence of sensitization with antigen-specific IgE. Eur J Immunol. 26 (12), 2972-2980 (1996).
- Smyth, L. J., et al. Assessment of the molecular basis of pro-allergenic effects of cigarette smoke. Environ Sci Technol. 34 (7), 1370-1374 (2000).
- Okada, H., Kuhn, C., Feillet, H., Bach, J. F. The 'hygiene hypothesis' for autoimmune and allergic diseases: an update. ClinExpImmunol. 160 (1), 1-9 (2010).
- Eder, C., et al. Influence of environmental and genetic factors on allergen-specific immunoglobulin-E levels in sera from Lipizzan horses. Equine Vet J. 33 (7), 714-720 (2001).
- Cook, W. R., Rossdale, P. D. The syndrome of 'Broken Wind' in the horse. Proceedings of the Royal Society of Medicine. 56, 972-977 (1963).
- Eyre, P., Lewis, A. J. Acute systemic anaphylaxis in the horse. Br. J. Pharmacol. 48 (3), 426-437 (1973).
- Bruggink, M. Global betting stable, but some countries suffer recession. , International Federation of Horseracing Authorities. Available from: http://www.horseracingintfed.com/Default.asp?section=Resources&area=0&story=664 (2009).
- Wagner, B. IgE in horses: occurrence in health and disease. Vet ImmunolImmunopathol. 132 (1), 21-23 (2009).
- Hellberg, W., et al. Equine insect bite hypersensitivity: immunoblot analysis of IgE and IgG subclass responses to Culicoidesnubeculosus salivary gland extract. Vet. Immunol. Immunopathol. 113 (1-2), 99-112 (2006).
- Schaffartzik, A., et al. Equine insect bite hypersensitivity: what do we know. Vet ImmunolImmunopathol. 147 (3-4), 113-126 (2012).
- Künzle, F., et al. IgE-bearing cells in bronchoalveolar lavage fluid and allergen-specific IgE levels in sera from RAO-affected horses. J Vet Med A PhysiolPatholClin Med. 54 (1), 40-47 (2007).
- Tahon, L., et al. In vitro allergy tests compared to intradermal testing in horses with recurrent airway obstruction. Vet ImmunolImmunopathol. (1-2), 85-93 (2009).
- Wagner, B., Radbruch, A., Rohwer, J., Leibold, W. Monoclonal anti-equine IgE antibodies with specificity for different epitopes on the immunoglobulin heavy chain of native IgE. Vet ImmunolImmunopathol. 92 (1-2), 45-60 (2003).
- Wilson, A. D., Harwood, L., Torsteinsdottir, S., Marti, E. Production of monoclonal antibodies specific for native equine IgE and their application to monitor total serum IgE responses in Icelandic and non-Icelandic horses with insect bite dermal hypersensitivity. Vet ImmunolImmunopathol. 112 (3-4), 156-170 (2006).
- McAleese, S. M., et al. Cloning and expression of the extra-cellular part of the alpha chain of the equine high-affinity IgE receptor and its use in the detection of IgE. Vet ImmunolImmunopathol. 110 (1-2), 187-191 (2006).
- Ledin, A., et al. Generation of therapeutic antibody responses against IgE in dogs, an animal species with exceptionally high plasma IgE levels. Vaccine. 24 (1), 66-74 (2006).
- Siraganian, R. P., Hook, W. A. Histamine release and assay methods for the study of human allergy. Manual of Clinical Immunology. , American Society for Microbiology. Washington, D. C. (1980).
- Neuberger, M. S., et al. A hapten-specific chimaericIgE antibody with human physiological effector function. Nature. 314 (6008), 268-270 (1985).
- Bingham, B. R., Monk, P. N., Helm, B. A. Defective Protein Phosphorylation and Ca2+ Mobilization in a low secreting variant of the rat basophilic leukemia cell line. The Journal of Biological Chemistry. 269 (30), 19300-19306 (1994).
- McAleese, S. M., Halliwell, R. E., Miller, H. R. Cloning and sequencing of the horse and sheep high-affinity IgE receptor alpha chain cDNA. Immunogenetics. 1 (51), 878-881 (2000).
- Hongtu, Y. Study of the structure/function relationship in canine and human IgE as the basis for the development of rational therapeutic intervention strategies in allergic disease. , The University of Sheffield. (2010).
- Sabban, S., et al. Towards a pan-anti-allergy vaccine. JIBTVA. 2 (2), 15-27 (2013).
- Moran, G., Burgos, R., Araya, O., Folch, H. In vitro bioassay to detect reaginic antibodies from the serum of horses affected with recurrent airway obstruction. Vet Res Commun. 34, 91-99 (2010).
