Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

تطوير doi: 10.3791/52222 Published: November 1, 2014

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وقد عرفت الحساسية لآلاف السنين. ووصف علاج الربو في النص الطبية المصرية القديمة المعروفة باسم بردية إبيرس (~ 1550 قبل الميلاد) وناقش العلاجات العشبية لعلاج النتيجة 7.

وتصنف الحساسية اليوم كرد فعل فرط الحساسية من النوع الأول، حيث T نوع من الخلايا المساعد 2 (TH 2) ذراع الجهاز المناعي يرسم إنتاج الغلوبولين المناعي E (IgE و) الأضداد استجابة لمستضدات البيئية تسمى المواد المسببة للحساسية. هذه هي المواد المتنوعة التي تتفاعل عادة مع الخلايا في جهاز المناعة، وتحفيز تخليق وإفراز السيتوكينات الموالية للالتهابات، بما في ذلك انترلوكين 4 وانترلوكين 13 8، 9 كما لم الجسيمات في دخان السجائر أو جزيئات عادم الديزل التي تعزز إيج التوليف 10.

ويعزى الارتفاع في مظاهر الحساسية في البلدان الصناعية في السنوات ال 50 الماضية لمزيج من تأثيرالملوثات البيئية والاتجاه إلى بيئة أكثر مطهرة، والتي تتضافر لتحول الاستجابة المناعية تجاه لمحة سادت قبل TH 2 السيتوكينات، على النحو الذي اقترحه "فرضية النظافة" 11.

كما ذكر أعلاه، والبشر ليسوا الثدييات الوحيدة التي تعاني من الحساسية. وخاصة الخيول والكلاب ويمكن أيضا تطوير استجابات حساسية الكلاسيكية وأظهرت دراسة أجرتها أن 12، كما هو الحال في البشر، ويعزى الحساسية الخيول إلى العوامل الوراثية والبيئية. ونتيجة لذلك، فإن هذه الحيوانات تمثل نماذج جيدة لدراسة التفاعل بين الأسباب الوراثية والبيئية للحساسية، تقدمه من توعية لمرض، واستراتيجيات التدخل الممكنة مرة واحدة وضعت في المظاهر السريرية

في عام 1887، كان أول شخص Stömmer لوصف التشابه بين الإنسان والربو الخيلي 13، وتأثير الهستامين على نظام القلب والأوعية الدموية الخيول هومشابهة جدا لتلك التي للبشر 14. الخيول هي أيضا حجر الزاوية في صناعة سباقات الخيل، الذي يستحق 72 مليار دولار مع الرهان دوران من 115 مليار دولار سنويا 15.

معظم خيول السباق المعاصرة هي من نسل عدد قليل من الخيول العربية ولدت من قبل السيدة آن بلنت من عام 1878 فصاعدا. والفطرية السباق الحديثة عادة لتحديد لقدرات الأداء. هم عرضة للاضطرابات وراثية، واحدة منها هي قابليتها لتركيب استجابات حساسية. لديهم أيضا 1000 مرة أعلى من المصل مستويات إيج حتى الأكثر حساسية شديدة البشر 16. وعادة ما تتجلى الحصان استجابات حساسية مثل فرط الحساسية لدغة حشرة (IBH) 17، 18. IBH النتائج في التهاب الجلد بسبب لدغات الحشرات تشكل في جنس البعضوضيات. شكل آخر من أمراض الحساسية الخيول هو انسداد لمجرى الهواء المتكررة (راو)، وهذا يتجلى في الرئتين والشعب الهوائية. ويتميز هذا الصفير ومختبرored التنفس. راو يحدث عادة استجابة لجراثيم العفن، وسجلت حساسية عالية خاصة بمستويات IgE في الخيول التي تعاني من راو في دراسة واحدة 19 على الرغم من تحقيق آخر لم يؤكد هذا 20.

تدور دراسات عن حساسية الخيول حول محاولة لرصد وتحييد الخيول إيج من خلال تطوير إيج الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المضادة للالفروسية (MABS) 21، 22. وعلاوة على ذلك الدراسة بنسبة 23 تناقش إنتاج المجالات خارج الخلية من α من الخيول عالية تقارب-FC مستقبلات ل سلسلة (FcεRIα) مستقبلات في محاولة لكشف وquantitate مصل الخيول إيج. تناقش دراسة ذلك من قبل لدين 24 نهج جديد يهدف إلى تحييد إيج المصل بواسطة فتيلة الجهاز المناعي باستخدام مستمنع الذات / غير المتمتعة بالحكم الذاتي. كل هذه الدراسات، ومع ذلك، تفتقر مقايسة فعالة لاختبار سلامة وفعالية بروتوكولاتها. في هذه المقالة، ونحن الآن تقديم مثل هذا الفحص SYSتيم ينطبق على دراسة الاستراتيجيات التشخيصية والعلاجية ذات الصلة لنظام الفروسية، حيث الإفراج β-هيكسوزامينيداز، كمؤشر الوسيط خلية تحبب، تم تقييمها على الخلايا ربل-2H3.1 معربا عن فرسي FcεRIα. ويعتمد هذا البروتوكول على المنشورات السابقة 25، 4، 5، 2، 3 اصفا الهندسة خلايا RBL transfected مع الجينات ترميز المجال الجلوبيولين ملزمة لمستقبلات عالية تقارب لفريق الخبراء الحكومي الدولي من مختلف الأنواع. ويوضح البروتوكول كيفية تنفيذ بيان فحص β-هيكسوزامينيداز، وتعرض نتائج التي كما يعني ± الانحراف المعياري للتجارب ثلاث نسخ.

وقد تم تطوير هذا الفحص من خلال إطلاق أول Siraganian وهوك 25 لدراسة الحساسية الإنسان. كما وضعت المجموعة المختبر بقيادة الدكتور روبن Siraganian خط الخلية ربل. وقد وضعت هذه الخلايا ربل للتعبير عن FcεRIα البشرية ونشر بروتوكول بنسبة 4. الجزء الاخيروجاء الفحص مع وضع البلازميد ايندهوفن في الورقة التي نويبيرغر 26 التي وصفت إنتاج من الأجسام المضادة عن طريق الاستنساخ في سلسلة الجينات الثقيلة الخارجة من الجين الماوس لمنطقة متغيرة إيج التي تستهدف ناشبة 4-هيدروكسي-3 -nitro-phenacetyl (NP)، فإن الأجسام المضادة الناتجة خيالية وظيفية بالكامل. القدرة على تطوير أي فريق الخبراء الحكومي الدولي التي تستهدف نفس ناشبة، بينما الاستنساخ أيضا مستقبلات على سطح الخلايا ربل أدى إلى توحيد الفحص مما يجعل من بروتوكول مفيد لقياس تحبب الخلايا قعدة.

مقايسة لديه إيجابيات وسلبيات. الايجابيات من الفحص هو قدرتها على التكيف لاستخدامها في أي نظام الثدييات، وبالتالي تستخدم المختبر لاختبار للتحبب في النظم البشرية والكلاب والخيول، وهذا أمر يمكن تحقيقه ببساطة عن طريق تجميع فريق الخبراء الحكومي الدولي الكائن الحي واستنساخ مستقبله على سطح الخلايا ربل.

من ناحية أخرى،سلبيات الفحص هو أن خلايا RBL حساسة جدا للتغيرات الحرارية والميكانيكية ودرجة الحموضة، مما يجعلها تعطي تباين مستويات تحبب داخل نفس الفحص. وبالتالي ينصح بشدة أن المقايسات وتتكرر دائما في يثلث ثم يؤخذ بمعدل منها. وعلاوة على ذلك، فإن الخلايا ربل تميل إلى التحول نحو النمط الظاهري غير الإفراج إذا ما تركت في زراعة الأنسجة لمرات طويلة (> 10 أسبوعا) 27، مما يجعل صيانتها مرهقة. هم أيضا عرضة للعدوى من البكتيريا الميكوبلازما، والتي هي غير مرئية من الضوء والمجهر لا تغيير مورفولوجيا الخلية، ولكن من شأنه أن يغير بشكل جذري مستويات تحبب لهم. وبالتالي هناك حاجة إلى اختبارات الميكوبلازما العادية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1) إعداد الخط الخلوي:

  1. تطوير خط الخلية ربل-2H3.1 معربا عن α FcεRI الفروسية:
    1. باستخدام تقنيات زراعة الأنسجة الأساسية للخطوط الخلايا أحادي الطبقة، بالنقل خلايا RBL-2H3.1 الأبوية استخدام البلازميد pEE6، تحمل الجين FcεRIα الخيول (بنك الجينات: Y18204.1) 28. إضافة 2 ميكروغرام ميكرولتر -1 من DNA البلازميد إلى 0.8 مل من الخلايا في مناطق ذات كثافة من 1.2 X10 7 خلايا مل -1. Electroporate الخلايا في 250 V 960 μF باستخدام 0.4 سم electrocuvette ثم احتضان فورا على الجليد لمدة 10 دقيقة.
    2. تحديد الخلايا تحولت باستخدام وسائل الإعلام التي تحتوي على 0.4 غرام من كبريتات geneticin G418، ثم فرز ما تبقى الخلايا الحية من خلال نظام مراقبة الأصول الميدانية من خلال وضع علامات عليها مع فريق الخبراء الحكومي الدولي الأجسام المضادة الفلورسنت. استخدام الناتج ربل-2H3.1 معربا عن الخيول خط الخلية FcεRIα للتحقيق 2، 3.
  2. قبل فحص الأجسام المضادة للتوعية:
      5 مل -1.
    1. إضافة إيج تهم الخلايا علقت لتركيز النهائي من 1 نانوغرام مل -1، ثم لوحة 100 ميكرولتر من الخلايا على 96 لوحة جيدا في الأعمدة 1-6 واحتضان عند 37 درجة مئوية + 5٪ CO 2 + 90٪ الرطوبة النسبية لمدة 16 ساعة. بعد فترة الحضانة، وقبل إجراء الفحص الإفراج، والتحقق من الآبار تحت المجهر لconfluency جيدا والتقيد الخلية.

2) بيان الفحص:

  1. غسل الخلايا:
    1. الإفراج الدافئ عازلة (25 ملم أنابيب، 120 ملي كلوريد الصوديوم، كلوريد البوتاسيوم 5 ملم، 0.04 ملم كلوريد المغنيسيوم وكلوريد الكالسيوم 1 ملم) عند 37 درجة مئوية للسماح للغسيل خلية لطيف.
    2. غسل الخلايا عن طريق التحريك لوحة لإزالة خلية الإعلام وإضافة 100 ميكرولتر الحارة 37 درجة مئوية، عازلة الإصدار. كرر مرتين.
  2. التحدي مستضد:
    1. إعداد التخفيف التسلسلي للمستضد (NIP-HSA أو إدارة التخطيط الوطني-HSA) 0 نانوغرام مل -1، 0.1 نانوغرام مل -1، 1 نانوغرام مل -1، 10 نانوغرام مل -1، 100 نانوغرام مل -1، 1000 نانوغرام مل -1، 10000 نانوغرام مل -1 في المخزن الإفراج ودافئة عند 37 درجة مئوية.
    2. بعد غسل الخلية الثانية، تجاهل وسائل الإعلام واستبدالها مع 100 ميكرولتر من الحلول مستضد. ضمان آبار في نفس الصف (A1-6 على سبيل المثال) لديها تركيز المستضد نفسه إضافتها.
    3. إنشاء سيطرة سلبية في الصف وذلك بإضافة 0 نانوغرام مستضد -1 مل. إضافة زيادة تركيز المستضد أسفل الصفوف (BG)، يليه تريتون X-عازلة (5٪ تريتون X-100) في H خلايا الصف لليز الخلايا لاستخدامها كعنصر تحكم إيجابية. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة للسماح للخلايا لاطلاق سراح الوسطاء لها.
  3. وضع الضوابط جيدا الفردية:
    1. بعد الحضانة، ونقل 50 ميكرولتر من طاف الخلية إلى النصف الآخر من لوحة (الآبار A1-6 A7-12 إلى الآبار، وغيرها). تجاهل 50 ميكرولتر المتبقية من طاف واستبدالها مع 50 ميكرولتر من تريتون X-عازلة للسماح بقياس كمية من الوسطاء أفرج عنه في كل بئر في الأعمدة 7-12 كنسبة مئوية من إجمالي الوسطاء داخل الخلايا في العمود 1-6 .
  4. الركيزة انزيم:
  5. إضافة 50 ميكرولتر من الركيزة β-هيكسوزامينيداز (50 ملي 4-nitrophenyl N-أسيتيل-β-D-glucosaminide أعد DMSO المخفف الى 2 مم عن طريق إضافته إلى عازلة سترات 0.2 M حمض الستريك و 0.2 M خلات الصوديوم، ودرجة الحموضة 4.5) لجميع الآبار لتسهيل تحويل الركيزة ل4-نيتروفينول بواسطة انزيم β-هيكسوزامينيداز. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.

الرقم 2.4.1

  1. إنهاء رد فعل:
    1. وقف رد فعل من قبل مضيفا 150 ميكرولتر تريس العازلة (1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 9) إلى كل جانب من درجة الحموضة العالية العازلة يتوقف رد الفعل، ويحول نيتروفينول 4 إلى اللون الأصفر.
  2. قراءة وتحليل النتائج:
    1. قراءة لوحة باستخدام لوحة معمل في 405 نانومتر لقياس الامتصاصية من اللون الأصفر. تحسب النسبة المئوية للصدر β-هيكسوزامينيداز باستخدام الصيغة التالية:

الرقم 2.6.1

  1. تطبيق هذه الصيغة على كل بئر، وبعد ذلك يؤخذ في المتوسط ​​لكل صف. A1 و A7 يمثل الموقع من الآبار في 96 لوحة جيدا. رسم بياني لنسبة الإفراج β-هيكسوزامينيداز (وهو ما يعادل إجمالي الإفراج الوسيط) ضد هبوطNST تركيز المستضد 2، 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تمت توعية الخلايا ربل-2H3.1 الأبوية وتلك transfected مع والخيول FcεRIα مستقبلات الجينات أولا مع الماوس فريق الخبراء الحكومي الدولي لمكافحة DNP-HSA وتحدى مع المستضد إدارة التخطيط الوطني، هائل سعيد أنعم. الماوس إيج تربط لمستقبلات الفئران الذاتية في كل من خطوط الخلايا وبالتالي تقوم بدور الرقابة لاختبار جدوى إطلاق سراح كل من خطوط الخلايا لاطلاق سراح الوسطاء (الشكل 1). هذا هو الاختيار مهم ويجب أن تنفذ منذ روتيني على الموسعة (> 10 أسبوعا) مرور في زراعة الخلايا، وخلايا RBL-2H3.1 الانجراف نحو النمط الظاهري غير إفراز-27. الخلايا الأبوية دعمت بيان الذروة سيط 51.54٪ ± 4.79٪، في حين أن الخلايا معربا عن FcεRIα مستقبلات الخيول بيان الذروة سيط 45.99٪ ± 5.76٪. هذه خطوط الخلايا نفسها حيث ثم توعية مع الخيول إيج المضادة خطة التنفيذ الوطنية، هائل سعيد أنعم وتحدى مع المستضد NIP-HSA (الشكل 1 ب). لم خلايا الأبوية لا يخضع الإفراج الوسيط، منذفرسي إيج لا تربط لمستقبلات الفئران الذاتية. من ناحية أخرى، كما هو متوقع، خضعت خلايا RBL-2H3.1 معربا عن FcεRIα مستقبلات الخيول الإفراج الوسيط عندما توعية مع الخيول فريق الخبراء الحكومي الدولي لمكافحة NIP-HSA وتحدى مع المستضد خطة التنفيذ الوطنية، هائل سعيد أنعم، وإعطاء الإفراج ذروة 36.68٪ ± 4.88٪ .

هذه النتائج تؤكد فعالية هذا البروتوكول فحص الإفراج في التحقيق في إطلاق الوسيط عبر مستقبلات IgE والخيول. فإنه يدل على أن هذا خط الخلية هو أداة تشخيصية مفيدة في السعي لتقويم استراتيجيات التدخل العلاجية الجديدة في الحساسية الخيول في المختبر مما يقلل من الحاجة لإجراء التجارب على الحيوانات. بروتوكول نفسه ينطبق على خلايا RBL-2H3.1 transfected مع مستقبلات FcεRIα الكلاب البشرية وأيضا.

وقد استخدم هذا البروتوكول أيضا لاختبار سلامة استراتيجية التحصين المحتملة التي تحاول تحييد الأجسام المضادة في مصل الدم الكلاب إيج 30. من النتائجفي (الشكل 2) أنه يمكن تحديد أن استراتيجية التحصين ليست آمنة. مصل لمكافحة الكلاب-إيج بنجاح منضمة إلى إيج الكلاب كما كان المقصود أصلا من أجل تحييد إيج المصل ومنعها من الملزم على مستقبله. ولكن هذا كان غير محددة ملزمة، وبالتالي ربط الصليب مصل مضاد للإيج مستقبلات على سطح الخلايا، مما يؤدي إلى إطلاق سراح الوسيط، مما قد يؤدي إلى حدوث صدمة الحساسية إذا تم استخدام هذه الاستراتيجية التحصين بمثابة لقاح مضاد للحساسية.

ربل-2H3.1 التعبير عن فرسي FcεRIα - - المنتجة في المختبر
فرسي فريق الخبراء الحكومي الدولي لمكافحة NIP-HSA - - المنتجة في المختبر
96 لوحة جيدا سيغما CLS3595 -
متعدد القنوات ماصة Anachem - -
حاضنة مجرة R - -
4Hydroxy-5-iodo-3-حمض nitrophenylacetic كامبردج للبحوث الكيميائية الحيوية N-1070-1 كان مترافق مع خطة التنفيذ الوطنية-OH الإنسان مصل الزلال لجعل خطة التنفيذ الوطنية-HSA في المختبر
Dinitrophenyl مترافق الإنسان إلى مصل الزلال سيغما A6661 مختصر DNP-HSA
لوحة الطيف Anthos LABTEC HT2 - -
أنابيب سيغما P1851 -
كلوريد الصوديوم سيغما S7653 -
كلوريد البوتاسيوم سيغما P9333 -
كلوريد المغنيسيوم سيغما M2670 -
كلوريد الكالسيوم سيغما C1016 -
تريتون X100 سيغما X100 -
4-nitrophenyl N-أسيتيل-β-D-glucosaminide سيغما N9376 تم حل سهم يسمى β-هيكسوزامينيداز الركيزة 50MM أعد DMSO
ثنائي ميثيل سلفوكسيد سيغما D2650 -
حامض الستريك سيغما 251275 -
خلات الصوديوم سيغما S7670 -
تريس سيغما T5941 -

الجدول 1: جدول المواد والمعدات:

الشكل 1
الرقم 1: ليظهر الفحص الإفراج بريفورميد على خلايا RBL-2H3.1 لا تعبر عن فرسي FcεRIα والتعبير عن مستقبلات باستخدام الماوس فريق الخبراء الحكومي الدولي لمكافحة DNP-HSA. الماوس إيج يربط لمستقبلات الفئران الذاتية مما أدى إلى الإفراج الوسيط عندما تحدى مع المستضد إدارة التخطيط الوطني، هائل سعيد أنعم، مما يؤكد أن كلا من خطوط الخلايا قابلة للبقاء ودعم فريق الخبراء الحكومي الدولي بوساطة المستضد الناجم عن الوسيط الإصدار 2، 3. ويبين الرسم البياني ب الفحص الإفراج بريفورميد على ربل-2H3.1 الخلايا الأبوية التي لا تعبر عن فرسي FcεRIα والتعبير عن تلك الخيول FcεRIα، وذلك باستخدام الخيول فريق الخبراء الحكومي الدولي لمكافحة NIP-HSA للتوعية الخلية. وإيج الخيول تربط لمستقبلات الخيول، ولكن ليس مستقبلات الفئران الذاتية، أن يؤدي إلى الإفراج الوسيط، ويؤكد هذا منذ الخلايا الأبوية لم تفرج عن وسطاء الوسيط، في حين أن الخلايا معربا عن دعم مستقبلات فرسي فرسي إيج بوساطة، مستضد يسببها ، الوسيط الإصدار 2، 3.

الرقم 2
الشكل 2: نتائج فحص الإفراج التحصين: يظهر الرسم البياني للمقايسة الافراج بريفورميد على خلايا RBL-2H3.1 معربا عن الكلاب FcεRIα، وذلك باستخدام الكلاب فريق الخبراء الحكومي الدولي لمكافحة NIP-HSA لتوعية خلية، وتحصين الفئران مكافحة الكلاب-إيج المصل باسم المستضد. السيطرة كانت تستخدم قبل تحصين مصل، وكانت السيطرة الإيجابية NIP-HSA مستضد. وإيج الكلاب تربط لمستقبلات الكلاب. وعلاوة على ذلك، يربط مكافحة إيج المصل لمستقبلات ملزمة الجلوبيولين الكلاب وصلات عبوره، ومستقبلات على سطح الخلايا مما يؤدي إلى الإفراج الوسيط. هذا، في الواقع، يثبت أن هذه الاستراتيجية التحصين معينة لها القدرة على التسبب في رد فعل صدمة الحساسية، وبالتالي تعتبر غير آمنة 30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

في ملخص أظهرت نتائج هذا التحقيق أنه عندما يتم توعية خلايا RBL-2H3.1 معربا عن FcεRIα مع فرسي فرسي إيج وتحدى من قبل المستضد، فإنها تعطي بيان الذروة سيط 36.68٪ ± 4.88٪ من المبلغ الإجمالي الوسيط داخل الخلايا، مقارنة مع ربل-2H3.1 الخلايا الأبوية لا تعبر عن فرسي FcεRIα.

وبالتالي يوفر هذا الاختبار أداة مفيدة للتحقيق ودراسة استجابات حساسية الخيول في المختبر. يسمح لها تحديد كمية الوسيط الصادرة عن خلايا الخلايا البدينة / قعدة النسب، وبالتالي يمكن أن نتوقع لدفع البحوث في الحساسية الفروسية، سواء تقييم العوامل المسببة للحساسية، أو البحث إيج / مستقبلات منع وكلاء.

تم تعديل هذا الاختبار لدراسة الحساسية الخيول من المنشورات السابقة التي تستخدم لدراسة الإنسان والكلاب الحساسية 4529 لنفس الأغراض. خط خلية هندسياليالي معربا البشرية وكانوا يعملون FcεRIα الكلاب لدراسة فعالية وسلامة الحساسية منع وكلاء مثل اللقاحات التي تستهدف تثبيط إيج / مستقبلات التفاعل 30. وكشف التحقيق عن الآثار الجانبية متئق من immunogens يضم المجال Cε3 بأكمله، الذي اقترح أيضا من قبل الآخرين مثل لقاح لتخفيف الاستجابات التحسسية إيج بوساطة في الكلاب 24. بناء على تحقيقاتنا، يمكن ترشيد الأساس الجزيئي لهذه المضاعفات الخطيرة المحتملة على أساس الاعتراف الحواتم في الضد من قبل إيج المصل المناعي لمكافحة إيج التي تحتوي على أجسام مضادة للإيج التي تستهدف الحواتم في Cε3 ولا تحجب عندما إيج والمعقد لمستقبله. لم يكن من الممكن جعل هذه الملاحظة في حالة عدم وجود هذا النظام والفحص في تناقض صارخ للتحقيق من قبل 24 عاما، الذي حقق أيضا استراتيجية التدخل المضادة للحساسية على أساس المجراة immuniوقد zation مع مجالات Cε3، ولكن لم تناقش سلامة استراتيجية نظرا لعدم وجود مثل هذا الفحص.

الخطوات الحاسمة من هذا البروتوكول هو التأكد من أن الغالبية العظمى من خلايا RBL-2H3.1 هي من إفراز النمط الظاهري. وجود الخلايا في الثقافة أكبر من 10 أسابيع لأسباب منها أن تبدأ في الانجراف نحو النمط الظاهري غير إفراز-27 بغض النظر عما إذا كانوا أعرب FcεRIα المستنسخة من الفائدة أم لا. ولذلك فمن الضروري دائما لتشغيل الضوابط الإيجابية الماوس إيج جنبا إلى جنب مع تجربة (الشكل 1)، والحفاظ على المخزون المجمد كبير من إفراز الخلايا.

وعلاوة على ذلك، يجب أن يكون الرقم الهيدروجيني للجميع مخازن الدقيق أو أنها مخاطرة إعطاء نتائج سلبية كاذبة. تمديد العمر الافتراضي للمخازن يغير من درجة الحموضة، وبالتالي أي العازلة مضى عليها أكثر من 2 أشهر بد من التخلص منها.

معارض تقنية تفاعل المواد الكيميائية مع CE-ربل 2H3.1LLS، وكيف أنها تعزز، أو منع، والإفراج عن الوسيط في المختبر. وهذا مؤشر جيد على ما يمكن أن يحدث في الجسم الحي، وبالتالي هذا البروتوكول هو خطوة أساسية عند البحث الاستراتيجيات العلاجية المضادة للحساسية المحتملة. هذه التقنية لا، ومع ذلك، تشير أي جزء من الجسم المضاد / مجمع مستقبلات الجزيء الاهتمام يتفاعل معها.

عمل بحوث أخرى، فقد أشار 20 مثل أن الخيول راو لا علاقة للوساطة إيج، ولهذا السبب يمكن رؤية بعض التباين مع الناشرين الآخرين مثل موران 31 عند استخدام المصل الكلي الخيول لاختبار كاليفورنيا لوآخرون. 2+ تدفق من راو يعاني الخيول باستخدام الأجسام المضادة راجن غير محددة، والتي أجسام مختلفة ستكون مسؤولة عن الخلوي تدفق الكالسيوم 2+.

هذا الاختبار هو محدد لفريق الخبراء الحكومي الدولي بوساطة الحساسية المفرطة، والتي يمكن أيضا أن تطبق على الكائنات الحية الأخرى، مثل البشر والكلاب 29، وتستخدم خصيصا لاختبار سلامة استراتيجيات التدخل المضادة للحساسية، مثل الاصطناعية / خيالية الأجسام المضادة للحساسية 30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RBL-2H3.1 Expressing Equine FcεRIα - - Produced in the lab
Equine IgE anti NIP-HSA - - Produced in the lab
96 Well Plate Sigma CLS3595 -
Multi Channel Pipette Anachem - -
Incubator Galaxy R - -
4Hydroxy-5-iodo-3-nitrophenylacetic acid Cambridge Research Biochemicals N-1070-1 NIP-OH was conjugated with Human Serum Albumin to make NIP-HSA in the lab
Dinitrophenyl Conjugated to Human Serum Albumin Sigma A6661 Abbreviated DNP-HSA
Plate Spectrophotometer Anthos Labtec HT2 - -
Pipes Sigma P1851 -
Sodium Chloride Sigma S7653 -
Potassium Chloride Sigma P9333 -
Magnesium Chloride Sigma M2670 -
Calcium Chloride Sigma C1016 -
Triton x100 Sigma X100 -
4-nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide Sigma N9376 Stock solution called β-hexosaminidase substrate was 50mM prepared in DMSO
Dimethyl Sulfoxide Sigma D2650 -
Citric Acid Sigma 251275 -
Sodium Acetate Sigma S7670 -
Tris Sigma T5941 -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Taudou, G., et al. Expression of the Alpha Chain of Human FcεRI in Transfected Rat Basophilic Leukemia Cells: Functional Activation after Sensitization with Human Mite-Specific IgE. Int Arch Allergy Immunol. 100, (4), 344-350 (1993).
  2. Sabban, S. Development of an in Vitro Model System for Studying the Interaction of EquuscaballusIgE with Its High-Affinity FcεRI Receptor. The University of Sheffield. Sheffield. (2011).
  3. Sabban, S., Ye, H., Helm, B. A. Development of an in Vitro Model System for Studying the Interaction of EquuscaballusIgE with Its High-Affinity Receptor FcεRI. Vet ImmunolImmunopathol. 153, (1-2), 6-10 (2013).
  4. Wilson, A. P. M., Pullar, C. E., Camp, A. M., Helm, B. A. Human IgE mediates stimulus secretion coupling in rat basophilic leukemia cells transfected with the a chain of the human high-affinity receptor. Eur J Immunol. 23, 240-244 (1993).
  5. Hunter, M. J., Vratimos, A. P., Housden, J. E. M., Helm, B. A. Generation of canine-human Fc IgE chimeric antibodies for the determination of the canine IgE domain of interaction with FcεRIα. MolImmunol. 45, (8), 2262-2268 (2008).
  6. Rashid, A., et al. Review: Diagnostic and therapeutic applications of rat basophilic leukemia cells. MolImmunol. 52, (3-4), 224-228 (2012).
  7. Cohen, S. G. Asthma in antiquity: the Ebers Papyrus. Allergy Proc. 13, (3), 147-154 (1992).
  8. Dudler, T., et al. A link between catalytic activity, IgE-independent mast cell activation, and allergenicity of bee venom phospholipase A2. J. Immunol. 155, 2605-2613 (1995).
  9. Machado, D. C., Horton, D., Harrop, R., Peachell, P. T., Helm, B. A. Potential allergens stimulate the release of mediators of the allergic response from cells of mast cell lineage in the absence of sensitization with antigen-specific IgE. Eur J Immunol. 26, (12), 2972-2980 (1996).
  10. Smyth, L. J., et al. Assessment of the molecular basis of pro-allergenic effects of cigarette smoke. Environ Sci Technol. 34, (7), 1370-1374 (2000).
  11. Okada, H., Kuhn, C., Feillet, H., Bach, J. F. The 'hygiene hypothesis' for autoimmune and allergic diseases: an update. ClinExpImmunol. 160, (1), 1-9 (2010).
  12. Eder, C., et al. Influence of environmental and genetic factors on allergen-specific immunoglobulin-E levels in sera from Lipizzan horses. Equine Vet J. 33, (7), 714-720 (2001).
  13. Cook, W. R., Rossdale, P. D. The syndrome of 'Broken Wind' in the horse. Proceedings of the Royal Society of Medicine. 56, 972-977 (1963).
  14. Eyre, P., Lewis, A. J. Acute systemic anaphylaxis in the horse. Br. J. Pharmacol. 48, (3), 426-437 (1973).
  15. Bruggink, M. Global betting stable, but some countries suffer recession. International Federation of Horseracing Authorities. Available from: http://www.horseracingintfed.com/Default.asp?section=Resources&area=0&story=664 (2009).
  16. Wagner, B. IgE in horses: occurrence in health and disease. Vet ImmunolImmunopathol. 132, (1), 21-23 (2009).
  17. Hellberg, W., et al. Equine insect bite hypersensitivity: immunoblot analysis of IgE and IgG subclass responses to Culicoidesnubeculosus salivary gland extract. Vet. Immunol. Immunopathol. 113, (1-2), 99-112 (2006).
  18. Schaffartzik, A., et al. Equine insect bite hypersensitivity: what do we know. Vet ImmunolImmunopathol. 147, (3-4), 113-126 (2012).
  19. Künzle, F., et al. IgE-bearing cells in bronchoalveolar lavage fluid and allergen-specific IgE levels in sera from RAO-affected horses. J Vet Med A PhysiolPatholClin Med. 54, (1), 40-47 (2007).
  20. Tahon, L., et al. In vitro allergy tests compared to intradermal testing in horses with recurrent airway obstruction. Vet ImmunolImmunopathol. (1-2), 85-93 (2009).
  21. Wagner, B., Radbruch, A., Rohwer, J., Leibold, W. Monoclonal anti-equine IgE antibodies with specificity for different epitopes on the immunoglobulin heavy chain of native IgE. Vet ImmunolImmunopathol. 92, (1-2), 45-60 (2003).
  22. Wilson, A. D., Harwood, L., Torsteinsdottir, S., Marti, E. Production of monoclonal antibodies specific for native equine IgE and their application to monitor total serum IgE responses in Icelandic and non-Icelandic horses with insect bite dermal hypersensitivity. Vet ImmunolImmunopathol. 112, (3-4), 156-170 (2006).
  23. McAleese, S. M., et al. Cloning and expression of the extra-cellular part of the alpha chain of the equine high-affinity IgE receptor and its use in the detection of IgE. Vet ImmunolImmunopathol. 110, (1-2), 187-191 (2006).
  24. Ledin, A., et al. Generation of therapeutic antibody responses against IgE in dogs, an animal species with exceptionally high plasma IgE levels. Vaccine. 24, (1), 66-74 (2006).
  25. Siraganian, R. P., Hook, W. A. Histamine release and assay methods for the study of human allergy. Manual of Clinical Immunology. American Society for Microbiology. Washington, D. C. (1980).
  26. Neuberger, M. S., et al. A hapten-specific chimaericIgE antibody with human physiological effector function. Nature. 314, (6008), 268-270 (1985).
  27. Bingham, B. R., Monk, P. N., Helm, B. A. Defective Protein Phosphorylation and Ca2+ Mobilization in a low secreting variant of the rat basophilic leukemia cell line. The Journal of Biological Chemistry. 269, (30), 19300-19306 (1994).
  28. McAleese, S. M., Halliwell, R. E., Miller, H. R. Cloning and sequencing of the horse and sheep high-affinity IgE receptor alpha chain cDNA. Immunogenetics. 1, (51), 878-881 (2000).
  29. Hongtu, Y. Study of the structure/function relationship in canine and human IgE as the basis for the development of rational therapeutic intervention strategies in allergic disease. The University of Sheffield. (2010).
  30. Sabban, S., et al. Towards a pan-anti-allergy vaccine. JIBTVA. 2, (2), 15-27 (2013).
  31. Moran, G., Burgos, R., Araya, O., Folch, H. In vitro bioassay to detect reaginic antibodies from the serum of horses affected with recurrent airway obstruction. Vet Res Commun. 34, 91-99 (2010).
تطوير<em&gt; في المختبر</em&gt; نظام نموذجي لدراسة تفاعل<em&gt; ايكوس</em&gt;<em&gt; الحصانية</em&gt; إيج مع مستقبلات لها عالية تقارب FcεRI
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sabban, S., Ye, H., Helm, B. Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor FcεRI. J. Vis. Exp. (93), e52222, doi:10.3791/52222 (2014).More

Sabban, S., Ye, H., Helm, B. Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor FcεRI. J. Vis. Exp. (93), e52222, doi:10.3791/52222 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter