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Immunology and Infection

Desenvolvimento de um doi: 10.3791/52222 Published: November 1, 2014

Introduction

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Alergia é conhecida há milênios. Um tratamento da asma foi descrita no texto médico egípcio antigo conhecido como o Papiro de Ebers (~ 1.550 aC) e discutido ervas remédios para tratá-la 7.

Hoje alergia é classificada como uma resposta de hipersensibilidade do tipo I, em que o tipo de célula T helper 2 (TH 2) o braço do sistema imunitário dirige a produção de (IgE) anticorpos imunoglobulina E em resposta a antigénios ambientais chamados alérgenos. Estes são diversas substâncias que normalmente interagem com as células do sistema imunológico e estimular a síntese e secreção de citocinas pró-inflamatórias, incluindo a interleucina-4 e interleucina-13 8, 9, conforme se em partículas do fumo do cigarro ou do escape de diesel de partículas que aumentam a síntese de IgE 10.

O aumento nas manifestações alérgicas em países industrializados nos últimos 50 anos, tem sido atribuída a uma combinação do efeito depoluentes ambientais e uma tendência para um ambiente mais higienizado, que combinam a mudar a resposta imunológica para um perfil predominou por TH duas citocinas, tal como proposto pelo "Hipótese da Higiene" 11.

Como mencionado acima, os seres humanos não são os únicos mamíferos afetados por alergia. Notavelmente cavalos e cães também podem desenvolver reações alérgicas clássicos e um estudo de 12 mostrou que, como nos seres humanos, a alergia eqüina é atribuída a fatores genéticos e ambientais. Como consequência, esses animais apresentam bons modelos para o estudo da interação entre causas genéticas e ambientais de alergia, a sua progressão de sensibilização para a doença, e as possíveis estratégias de intervenção uma vez que as manifestações clínicas definidas em

Em 1887, Stömmer foi a primeira pessoa a descrever a semelhança entre o ser humano e asma equina 13, o efeito da histamina sobre o sistema cardiovascular é equinamuito semelhante à dos seres humanos 14. Cavalos também são a pedra angular da indústria de corridas a cavalo, que vale US $ 72 bilhões, com um volume de apostas de US $ 115 bilhões por ano 15.

A maioria dos cavalos de corrida contemporâneos são descendentes do pequeno número de cavalos árabes criados por Lady Anne Blunt de 1878 em diante. Cavalos de corrida modernos são comumente pura a escolha de habilidades de desempenho. Eles são propensas a doenças genéticas, uma das quais é a sua susceptibilidade para montar respostas alérgicas. Eles também têm mil vezes mais altos níveis séricos de IgE do que até mesmo os mais severamente alérgica seres humanos 16. Respostas alérgicas cavalo são geralmente se manifesta como hipersensibilidade picada de inseto (IBH) 17, 18. Resultados IBH na dermatite devido a picadas de insetos formam no gênero Culicoides. Outra forma de doença alérgica eqüina é obstruções das vias respiratórias recorrentes (RAO), isso se manifesta nos pulmões e vias respiratórias. É caracterizada por chiado e laboratóriorespiração ORed. RAO comumente ocorre em resposta a esporos, e altos níveis de IgE alérgeno-específicos foram registrados em cavalos que sofrem de RAO em um estudo de 19, embora outra investigação não confirmou esta 20.

Estudos sobre alergia equina girado em torno da tentativa de controlar e neutralizar equina IgE através do desenvolvimento de anticorpos monoclonais anti-IgE equino (mAbs) 21, 22. Além disso, o estudo de 23 discute a produção dos domínios extracelulares de α o de elevada afinidade do receptor de Fc equina cadeia (FceRIa) receptor, na tentativa de detectar e quantificar soro eqüino IgE. Um estudo relacionado por Ledin 24 discute uma nova abordagem visando neutralizar IgE soro por priming do sistema imunológico através de um auto / não-auto imunógeno. Todos estes estudos, no entanto, faltava um ensaio eficaz para testar a segurança e eficácia dos seus protocolos. Neste artigo, vamos agora apresentar tal sys ensaiotempe aplicável ao estudo de estratégias de diagnóstico e terapêuticos relevantes para o sistema equina, onde libertação β-hexosaminidase, como um indicador de mediador de células desgranulação, foi avaliada em células RBL-2H3.1 expressam equina FceRIa. Este protocolo baseia-se em publicações anteriores 25, 4, 5, 2, 3 descrevem a engenharia de células RBL transfectadas com o gene que codifica o domínio de ligação do receptor de IgE de alta afinidade para IgE a partir de espécies diferentes. O protocolo explica como realizar um ensaio de libertação de β-hexosaminidase, cujos resultados são apresentados como a média ± desvio padrão de experiências em triplicado.

O ensaio de liberação foi desenvolvido pela primeira vez por Siraganian e Gancho 25 para estudar alergia humano. O grupo de laboratório liderado pelo Dr. Reuben Siraganian também desenvolveu a linha de células RBL. Estas células RBL foram desenvolvidos para expressar o FceRIa humana e o protocolo foi publicada por 4. A peça finaldo ensaio de veio com o desenvolvimento do plasmídeo pSV no papel por Neuberger 26, que descreveu a produção de anticorpos IgE por uma clonagem do seu gene de cadeia pesada a jusante de um gene de rato para uma região variável de IgE que tem como alvo o hapteno 4-hidroxi-3 -nitro-fenacetilo (NP), o anticorpo quimérico resultante era totalmente funcional. A capacidade de desenvolver qualquer IgE direccionamento do mesmo hapteno, ao mesmo tempo, a clonagem do seu receptor na superfície das células RBL resultaram na padronização do ensaio tornando-se um protocolo útil para medir a desgranulação de basófilos.

O ensaio tem prós e contras. As vantagens do ensaio é a sua adaptabilidade para ser utilizado em qualquer sistema de mamífero, o nosso laboratório tem, assim, usou-o para testar para a desgranulação nos sistemas humanos, caninos e equinos, e isso pode ser conseguido simplesmente através da síntese de IgE do organismo e a clonagem do seu receptor sobre a superfície das células RBL.

Por outro lado,os contras do ensaio é que as células RBL são muito sensíveis a alterações térmicas, mecânicas e de PH, tornando-os dão uma variação de níveis de degranulação dentro do mesmo ensaio. É, portanto, altamente recomendável que os ensaios são sempre repetidas em triplicata e, em seguida, uma média é tomada a partir delas. Além disso, as células RBL tendem a deslocar para um fenótipo de não desprendimento, se forem deixados em cultura de tecidos durante tempos prolongados (> 10 semanas) 27, tornando complicada a sua manutenção. Eles também são propensos a infecções por micoplasma, bactérias que não são visíveis a partir de um microscópio de luz e não modificam a morfologia da célula, mas iria alterar drasticamente os seus níveis de degranulação. Assim, são necessários testes de micoplasma regulares.

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Protocol

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1) Preparação de Linha de Células:

  1. O desenvolvimento da linha celular RBL-2H3.1 expressando α FcsRI eqüinos:
    1. Usando técnicas básicas de cultura de tecidos para linhas de células em monocamada, transfectar células RBL-2H3.1 parental usando o plasmídeo pEE6, que transporta o gene equina FceRIa (GenBank: Y18204.1) 28. Adicionar 2 ug -1 ul do DNA de plasmídeo a 0,8 ml de células a uma densidade de 1,2 x 10 7 células mL @ 1. Electroporate as células a 250 V, 960 uF utilizando um 0,4 centímetros electrocuvette depois incubar imediatamente em gelo durante 10 min.
    2. Selecione as células transformadas utilizando meios contendo 0,4 g de sulfato de geneticina G418, em seguida, classificar as restantes células vivas através FACS por marcá-los com um anticorpo IgE fluorescente. Use o RBL-2H3.1 resultando expressar eqüinos linha celular FceRIa para a investigação 2, 3.
  2. Pré-ensaio de anticorpo de sensibilização:
      5 células ml -1.
    1. Adicionar a IgE de interesse para as células suspensas a uma concentração final de 1 ng mL-1, em seguida, a placa 100 ul de células numa placa de 96 poços em colunas 1-6 e incubar a 37 ° C + 5% de CO 2 + 90% humidade relativa durante 16 horas. Após o tempo de incubação, e antes de realizar o ensaio de libertação, verificar os poços sob um microscópio para o bem de confluência e aderência celular.

2) Lançamento de Ensaio:

  1. Lavar as células:
    1. Tampão de libertação Quente (PIPES 25 mM, cloreto de sódio 120 mM, cloreto de potássio 5 mM, cloreto de magnésio 0,04 mM e 1 mM de cloreto de cálcio) a 37 ° C para permitir uma lavagem das células suavemente.
    2. Lave as células sacudindo a placa para remover a mídia de células e adicionar 100 ml quente, 37 ° C, tampão de libertação. Repita duas vezes.
  2. Desafio Antígeno:
    1. Prepara-se uma diluição em série do antigénio (NIP-HSA ou DNP-HSA) de 0 ng ml -1, 0,1 ng ml -1, 1 ng ml-1, 10 ng mL-1, 100 ng ml -1, 1.000 ng ml -1, 10.000 ng ml-1 em tampão de liberação e quente a 37 ° C.
    2. Após a segunda lavagem das células, os meios de descarte e substituído por 100 ul das soluções de antigénio. Certifique-se de que os poços de uma mesma fila (A1-6 por exemplo) têm a mesma concentração de antigénio adicionados a eles.
    3. Configurar um controle negativo na linha A, adicionando 0 ng antígeno -1 ml. Adicionar o aumento da concentração de antigénio para baixo as linhas (BG), seguido de triton x-tampão (5% de Triton X-100) H em células de linha para lisar as células a serem utilizadas como um controlo positivo. Incubar a 37 ° C durante 20 minutos para permitir que as células de libertar os seus mediadores.
  3. Configurar controles bem individuais:
    1. Após a incubação, transferir 50 ul de sobrenadante de célula para a outra metade dos poços (placa de poços A1-6 A7-12, etc). Descartar as restantes 50 ul de sobrenadante e substituir com 50 ul de Triton-x tampão para permitir a medição da quantidade de mediadores libertados em cada cavidade nas colunas 7-12 como uma percentagem do total de mediadores no interior das células na coluna 1-6 .
  4. O substrato enzimático:
  5. Adicionar 50 ul de substrato β-hexosaminidase (50 mM de 4-nitrofenilo N-acetil-β-D-glucosaminida preparado em DMSO diluídos até 2 mM, adicionando-o ao tampão de citrato ácido cítrico 0,2 M e 0,2 M de acetato de sódio, pH 4,5) a todos os poços para facilitar a conversão do substrato a 4-nitrofenol pela enzima β-hexosaminidase. Incubar as placas a 37 ° C durante 2 horas.

Figura 2.4.1

  1. Encerrando a reação:
    1. Parar a reacção pela adição de 150 ul de tampão Tris (1 M Tris-HCl, pH 9) a cada poço como o elevado pH do tampão de pára a reacção e transforma o 4-nitrofenol em uma cor amarela.
  2. Lendo e analisando os resultados:
    1. Ler a placa utilizando uma placa espectrofotómetro a 405 nm para medir a absorvência da cor amarela. Calculado a percentagem de β-hexosaminidase libertada utilizando a seguinte fórmula:

Figura 2.6.1

  1. Aplicar esta fórmula para cada poço, após o que é feita uma média para cada linha. A1 e A7 representam a localização dos poços da placa de 96 poços. Traçar uma curva de porcentagem de liberação β-hexosaminidase (o que corresponde a total liberação de mediador) açaíantígeno nst concentração 2, 3.

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Representative Results

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As células RBL-2H3.1 parentais e as transfectadas com o gene do receptor de FceRIa equino foram sensibilizados primeiro com IgE de murganho anti DNP-HSA e desafiados com o antigénio DNP-HSA. Rato IgE se liga ao receptor endógeno de rato em ambas as linhas de células e, assim, actua como um controlo para testar a viabilidade de libertação de ambas as linhas celulares para libertar mediadores (Figura 1 A). Esta é uma verificação importante e deve ser levada a cabo rotineiramente desde cima prolongadas (> 10 semanas) a passagem em cultura de células, as células RBL-2H3.1 deriva para o fenótipo não-secretor de 27. As células parentais suportado um pico de libertação mediador de 51,54% ± 4,79%, enquanto que as células que expressam o receptor FceRIa equina teve um pico de libertação mediador de 45,99% ± 5,76%. Estas linhas celulares mesmos onde então sensibilizadas com eqüinos IgE anti NIP-HSA e desafiados com o antígeno NIP-HSA (Figura 1 B). Células parentais não foram submetidos a liberação do mediador, uma vez que oA IgE equino não se ligar ao receptor endógeno de rato. Por outro lado, como era esperado, as células RBL-2H3.1 que expressam o receptor FceRIa equino foram submetidos a libertação de mediador quando sensibilizados com IgE equino anti-NIP HSA e desafiados com o antigénio NIP-HSA, dando um pico de libertação de 36,68% ± 4,88% .

Estes resultados confirmam a eficiência deste protocolo ensaio de liberação na investigação da liberação do mediador via receptor IgE eqüinos. Isso mostra que esta linha celular é uma ferramenta de diagnóstico útil na busca de jumentos Novas estratégias de intervenção terapêutica em alergia eqüinos in vitro, reduzindo a necessidade de experimentação animal. O mesmo protocolo é também aplicável a células RBL-2H3.1 transfectadas com o FceRIa receptores humanos e caninos.

Este protocolo foi também utilizado para testar a segurança de uma estratégia de imunização potencial que tenta neutralizar soro canino anticorpos IgE 30. A partir dos resultadosna (Figura 2) pode ser determinado que a estratégia de imunização não é seguro. O soro anti-canino-IgE ligada com sucesso para a IgE canina como foi originalmente destinado a fim de neutralizar a IgE do soro e de impedi-lo de ligação para o seu receptor. Mas esta ligação foi inespecífico, e, assim, a cruz de soro anti-IgE ligada ao receptor na superfície das células, resultando na libertação de mediadores, potencialmente resultando em choque anafiláctico se esta estratégia de imunização foi utilizado como uma vacina anti-alergia.

RBL-2H3.1 Expressando Equine FceRIa - - Produzido no laboratório
Equine IgE anti NIP-HSA - - Produzido no laboratório
Placa de 96 poços Sigma CLS3595 -
Multi Channel Pipeta Anachem - -
Incubadora Galaxy R - -
4-hidroxi-5-iodo-3-nitrofenilacético ácido Cambridge Research Bioquímicos N-1070-1 NIP-OH foi conjugado com albumina sérica humana para fazer NIP-HSA no laboratório
Dinitrofenil conjugado com Albumina de Soro Humano Sigma A6661 Abreviada DNP-HSA
Placa espectrofotômetro Anthos Labtec HT2 - -
Pipes Sigma P1851 -
Cloreto de Sódio Sigma S7653 -
Cloreto de Potássio Sigma P9333 -
Cloreto de Magnésio Sigma M2670 -
Cloreto de cálcio Sigma C1016 -
Triton x100 Sigma X100 -
4-nitrofenilo N-acetil-β-D-glucosaminida Sigma N9376 Da solução de substrato chamado β-hexosaminidase foi preparado a 50 mM em DMSO
Dimetilsulfóxido Sigma D2650 -
Ácido cítrico Sigma 251275 -
Acetato de sódio Sigma S7670 -
Tris Sigma T5941 -

Tabela 1: Tabela de Materiais e Equipamentos:

A Figura 1
Figura 1: A mostra o ensaio de liberação de pré-formados em células RBL-2H3.1 não expressam eqüinos FceRIa e que expressam o receptor usando o mouse IgE anti DNP-HSA. O rato de IgE se liga ao receptor endógeno de rato, resultando em libertação de mediador quando desafiados com o antigénio DNP-HSA, confirmando assim que ambas as linhas de células são viáveis ​​e suporta mediada por IgE induzida por antigénio a libertação de mediadores 2, 3. O gráfico B mostra o ensaio de libertação pré-formado em RBL-2H3.1 células parentais que não expressam equina FceRIa e os que expressam equina FceRIa, utilizando equina IgE anti-NIP de HSA para a sensibilização da célula. A IgE equino se liga ao receptor de equino, mas não o receptor endógeno de rato, para resultar na libertação de mediadores, isto é confirmado, uma vez que as células parentais não libertar mediadores mediador, enquanto que as células que expressam o receptor de apoio equina equina mediada por IgE, antigénio induzido , mediador release 2, 3.

A Figura 2
Figura 2: resultados do ensaio de libertação de Imunização: O gráfico mostra o ensaio de libertação de pré-formada sobre células RBL-2H3.1 expressam canino FceRIa, utilizando canino IgE anti-NIP de HSA para a sensibilização da célula, e de ratos imunizados anti-canino-IgE do soro como antigénio. O controlo foi utilizado o soro pré-imunizado, e o controlo positivo foi o antigénio NIP-HSA. O canino IgE se liga ao receptor canino. Além disso, o soro anti-IgE se liga ao receptor de IgE ligado canino e ligações cruzadas ele, e o receptor, na superfície das células, resultando na libertação de mediadores. Isto, com efeito, comprova que esta estratégia de imunização especial, tem o potencial de provocar uma reacção de choque anafilático, e é, assim, considerada não segura 30.

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Discussion

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Em resumo, os resultados desta investigação mostraram que, quando as células RBL-2H3.1 expressando FceRIa eqüinos são sensibilizados com IgE eqüinos e desafiado por um antígeno, eles dão um pico de liberação mediador de 36,68% ± 4,88% do montante total de mediador dentro do As células, em comparação com o RBL-2H3.1 células parentais não expressam eqüinos FceRIa.

Assim, este ensaio fornece uma ferramenta útil para investigar e estudar respostas alérgicas eqüinos in vitro. Sua permite a determinação da quantidade de mediador libertado pelas células de mastócitos / basófilos linhagem e, assim, pode ser esperado para o avanço da pesquisa na alergia equina, se avaliar agentes que causam a alergia, ou pesquisando a IgE / receptor de agentes de bloqueio.

Este ensaio foi modificado para estudar alergia eqüinos de publicações anteriores que utilizaram para estudar alergias humanos e caninos 4529 para os mesmos fins. A linha de células de engenharias expressando humana e FceRIa caninas foram utilizados para estudar a eficácia e segurança de agentes de bloqueio de alergia, tais como vacinas que visam a inibição da interacção de IgE / receptor 30. A investigação revelou um efeito colateral anafilactogénico de imunogénios compreendendo todo o domínio Ce3, que também foi proposto por outros como uma vacina para atenuar as respostas alérgicas mediadas por IgE, em 24 cães. Com base na nossa investigação, a base molecular para esta complicação potencialmente grave poderia ser racionalizado com base no reconhecimento de epitopos no anticorpo IgE pelo soro imune anti-IgE contendo anticorpos anti-IgE que têm como alvo epitopos em Ce3 e não são obscurecidos, quando a IgE é complexado com o seu receptor. Esta observação não poderia ter sido feita na ausência do presente sistema de ensaio e é, em contraste marcante com a investigação por 24, que também investigou a estratégia de intervenção anti-alergia com base em in vivo immunização com domínios Ce3, mas não têm discutido a segurança da estratégia devido à ausência de um tal ensaio.

Os passos críticos do presente protocolo é o de assegurar que a maioria das células RBL-2H3.1 são do fenótipo secretor; Tendo as células em cultura superior a 10 semanas faz com que eles começam a deriva para o fenótipo não-secretoras de 27, independentemente de eles manifestaram a FceRIa clonado de interesse ou não. Por isso, é sempre essencial para executar controlos positivos de IgE de rato juntamente com a experiência (Figura 1), e para manter uma grande massa congelada de células secretoras.

Além disso, o pH de todos os buffers devem ser precisos ou arriscam-se a dar resultados falso-negativos; prolongamento do tempo de vida de tampões altera o seu pH, e, assim, qualquer tampão com idade superior a dois meses tem de ser descartado.

A técnica mostra a interacção de um produto químico com o ce RBL-2H3.1lls, e como ele promove ou suprime, a sua liberação do mediador in vitro. Esta é uma boa indicação do que pode acontecer in vivo, portanto, este protocolo é um passo essencial quando pesquisando estratégias terapêuticas anti-alérgicos potenciais. A técnica não significa, no entanto, indicam que parte do complexo anticorpo / receptor de a molécula de interesse interage com.

Outro trabalho de pesquisa, tais como 20 indicaram que equinos RAO não está relacionado com IgE mediação, razão pela qual alguma discrepância pode ser visto com outros editores, como Moran 31 et al. Ao usar soro eqüino total a testar a influxo de Ca2 + a partir de RAO sofrendo cavalos utilizando anticorpos reaginic inespecíficos, para que diferentes anticorpos seriam responsáveis ​​pelo celular influxo de Ca2 +.

Este ensaio é específico para hypersensitivities mediadas por IgE, o que também pode ser aplicado a outros microorganismos, tais como os seres humanos edogs 29, e especificamente utilizado para testar a segurança de estratégias de intervenção anti-alérgicos, tais como anticorpos quiméricos sintéticos / anti-alérgicos 30.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
RBL-2H3.1 Expressing Equine FcεRIα - - Produced in the lab
Equine IgE anti NIP-HSA - - Produced in the lab
96 Well Plate Sigma CLS3595 -
Multi Channel Pipette Anachem - -
Incubator Galaxy R - -
4Hydroxy-5-iodo-3-nitrophenylacetic acid Cambridge Research Biochemicals N-1070-1 NIP-OH was conjugated with Human Serum Albumin to make NIP-HSA in the lab
Dinitrophenyl Conjugated to Human Serum Albumin Sigma A6661 Abbreviated DNP-HSA
Plate Spectrophotometer Anthos Labtec HT2 - -
Pipes Sigma P1851 -
Sodium Chloride Sigma S7653 -
Potassium Chloride Sigma P9333 -
Magnesium Chloride Sigma M2670 -
Calcium Chloride Sigma C1016 -
Triton x100 Sigma X100 -
4-nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide Sigma N9376 Stock solution called β-hexosaminidase substrate was 50mM prepared in DMSO
Dimethyl Sulfoxide Sigma D2650 -
Citric Acid Sigma 251275 -
Sodium Acetate Sigma S7670 -
Tris Sigma T5941 -

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References

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Desenvolvimento de um<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema modelo para estudar a interacção de<em&gt; Equus</em&gt;<em&gt; Caballus</em&gt; IgE ao seu receptor de elevada afinidade FceRI
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Sabban, S., Ye, H., Helm, B. Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor FcεRI. J. Vis. Exp. (93), e52222, doi:10.3791/52222 (2014).More

Sabban, S., Ye, H., Helm, B. Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor FcεRI. J. Vis. Exp. (93), e52222, doi:10.3791/52222 (2014).

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