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Immunology and Infection

Desarrollo de una doi: 10.3791/52222 Published: November 1, 2014

Introduction

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Alergia se conoce desde hace milenios. Un tratamiento del asma se describe en el texto médico egipcio antiguo conocido como el Papiro de Ebers (~ 1550 aC) y discutió los remedios herbales para tratarla 7.

Hoy en día la alergia se clasifica como una respuesta de hipersensibilidad de tipo I, donde el tipo de células T helper 2 (TH 2) el brazo del sistema inmunitario dirige la producción de inmunoglobulina E (IgE) anticuerpos en respuesta a antígenos ambientales llamadas alérgenos. Estos son diversas sustancias que comúnmente interactúan con las células del sistema inmunológico y estimulan la síntesis y secreción de citoquinas pro-inflamatorias, incluyendo la interleucina-4 e interleucina-13 8, 9 como lo hacen las partículas en partículas de humo del cigarrillo o de escape diesel que potencian la síntesis de IgE 10.

El aumento de las manifestaciones alérgicas en los países industrializados en los últimos 50 años se ha atribuido a una combinación del efecto decontaminantes del medio ambiente y una tendencia a un ambiente más saneado, que se combinan para cambiar la respuesta inmune hacia un perfil predominado por Th 2 citoquinas, tal como propone la "hipótesis de la higiene" 11.

Como se mencionó anteriormente, los seres humanos no son los únicos mamíferos afectados por la alergia. Cabe destacar que los caballos y los perros también pueden desarrollar respuestas alérgicas clásicas y un estudio de 12 ha demostrado que, al igual que en los seres humanos, la alergia equina se atribuye a factores genéticos y ambientales. Como consecuencia, estos animales presentan buenos modelos para el estudio de la interacción entre las causas genéticas y ambientales de la alergia, su progresión desde la sensibilización a la enfermedad, y las posibles estrategias de intervención una vez que las manifestaciones clínicas se han fijado en

En 1887, Stömmer fue la primera persona en describir la similitud entre el ser humano y el asma equina 13, el efecto de la histamina sobre el sistema cardiovascular equina esmuy similar a la de los seres humanos 14. Los caballos son también la piedra angular de la industria de las carreras de caballos, que vale US $ 72 mil millones con un volumen de apuestas de US $ 115 mil millones al año 15.

La mayoría de los caballos de carreras contemporáneos son descendientes del pequeño número de caballos árabes criados por Lady Anne Blunt a partir de 1878 en adelante. Caballos de carreras modernos están endogámicas comúnmente para seleccionar para capacidades de rendimiento. Son propensos a trastornos genéticos, uno de los cuales es su susceptibilidad a montar respuestas alérgicas. También tienen 1.000 veces más altos niveles de IgE en suero que incluso los seres humanos más gravemente alérgica 16. Caballos en las respuestas alérgicas se manifiestan generalmente como hipersensibilidad a la picadura de insectos (IBH) 17, 18. Resultados de IBH en la dermatitis debido a las picaduras de insectos forman en el género Culicoides. Otra forma de enfermedad alérgica de las vías respiratorias equina es obstrucciones recurrentes (RAO), esto se manifiesta en los pulmones y las vías respiratorias. Se caracteriza por sibilancias y laboratoriorespiración ORed. RAO ocurre comúnmente en respuesta a las esporas de moho, y los altos niveles de IgE alergeno-específica se han registrado en los caballos que sufren de RAO en un estudio de 19 aunque otra investigación no ha confirmado 20.

Estudios sobre la alergia equina giraban alrededor del intento de seguimiento y la neutralización de IgE equina mediante el desarrollo de anticuerpos monoclonales anti-IgE equina (mAbs) 21, 22. Además, el estudio de 23 discute la producción de los dominios extracelulares de α equino de alta afinidad Fc de receptor cadena (FcεRIα) receptor en un intento de detectar y cuantificar suero equino IgE. Un estudio relacionado por Ledin 24 discute un nuevo enfoque destinado a neutralizar la IgE sérica cebando el sistema inmune utilizando un inmunógeno sí / no-yo. Todos estos estudios, sin embargo, carecían de un ensayo eficaz para probar la seguridad y eficacia de sus protocolos. En este artículo, presentamos ahora una sys tales ensayotem aplicable al estudio de las estrategias de diagnóstico y terapéuticas relevantes para el sistema equino, donde la liberación β-hexosaminidasa, como un indicador de la desgranulación de mediador celular, se evaluó en células RBL-2H3.1 que expresan equina FcεRIα. Este protocolo se basa en publicaciones anteriores 25, 4, 5, 2, 3 que describen la ingeniería de células RBL transfectadas con el gen que codifica el dominio de unión a IgE del receptor de alta afinidad para IgE de diferentes especies. El protocolo explica cómo realizar un ensayo de liberación de β-hexosaminidasa, cuyos resultados se presentan como la media ± desviación estándar de tres experimentos.

El ensayo de liberación se desarrolló por primera vez por Siraganian y el gancho 25 para estudiar la alergia humana. El grupo de laboratorio dirigido por el Dr. Rubén Siraganian también desarrolló la línea celular RBL. Estas células RBL se desarrollaron para expresar la FcεRIα humana y el protocolo se publicó por 4. La pieza finalel ensayo de vino con el desarrollo del plásmido pSV en el documento de Neuberger 26 que describe la producción de un anticuerpos IgE mediante la clonación de su gen de la cadena pesada aguas abajo de un gen de ratón para una región variable de IgE que se dirige el hapteno 4-hidroxi-3 nitro-fenacetilo (NP), el anticuerpo quimérico resultante era completamente funcional. La capacidad para desarrollar cualquier IgE focalización el mismo hapteno, mientras que también la clonación de su receptor en la superficie de las células RBL dado lugar a la normalización del ensayo de lo que es un protocolo útil para medir la desgranulación de basófilos.

El ensayo tiene pros y contras. Los pros del ensayo es su adaptabilidad para ser utilizado en cualquier sistema de mamífero, nuestro laboratorio así lo ha utilizado para probar la degranulación en los sistemas humanos, caninos y equinos, y esto se puede lograr simplemente mediante la síntesis de IgE del organismo y la clonación de su receptor sobre la superficie de las células RBL.

Por otra parte,los contras del ensayo es que las células RBL son muy sensibles a los cambios térmicos, mecánicos y de pH, lo que les dan una variación de los niveles de desgranulación dentro del mismo ensayo. Por tanto, se recomienda encarecidamente que los ensayos siempre se repiten por triplicado y luego se toma una media de ellos. Además, las células RBL tienden a cambiar hacia un fenotipo no liberar si se dejan en cultivo de tejidos durante tiempos prolongados (> 10 semanas) 27, por lo que su mantenimiento engorroso. También son propensos a las infecciones por bacterias de micoplasma, que no son visibles desde un microscopio de luz y no cambian la morfología de la célula, sino que cambiar drásticamente sus niveles de desgranulación. Por lo tanto se necesitan pruebas de micoplasma regulares.

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Protocol

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1) Preparación de la línea celular:

  1. El desarrollo de la línea de células RBL-2H3.1 expresar equinos α Fc RI:
    1. El uso de las técnicas básicas de cultivo de tejidos para las líneas celulares en monocapa, transfectar células RBL-2H3.1 parentales utilizando el plásmido pEE6, que lleva el gen equino FcεRIα (GenBank: Y18204.1) 28. Añadir 2 g l -1 del ADN del plásmido a 0,8 ml de células a una densidad de 1,2 x10 7 células ml -1. Electroporar las células a 250 V 960 mF usando un electrocuvette 0,4 cm luego incubar inmediatamente en hielo durante 10 min.
    2. Seleccione las células transformadas utilizando medios que contienen 0,4 g de sulfato de geneticina G418, a continuación, ordenar las células vivas restantes mediante FACS etiquetándolos con un anticuerpo IgE fluorescente. Utilice la RBL-2H3.1 resultante expresar equina línea celular FcεRIα para la investigación 2, 3.
  2. Pre-ensayo de sensibilización de anticuerpos:
      -1 5 células.
    1. Añadir la IgE de interés para las células suspendidas a una concentración final de 1 ng ml -1, a continuación, la placa 100 l de células en una placa de 96 pocillos en las columnas 1-6 y se incuba a 37 ° C + 5% de CO 2 + 90% de humedad relativa durante 16 horas. Después del tiempo de incubación, y antes de realizar el ensayo de liberación, compruebe los pozos bajo un microscopio para confluencia bien y la adhesión celular.

2) Ensayo de lanzamiento:

  1. Lavar las células:
    1. Tampón de liberación de calentamiento (tubos de 25 mM, cloruro de sodio 120 mM, cloruro de potasio 5 mM, 0,04 mM de cloruro de magnesio y cloruro de calcio 1 mM) a 37 ° C para permitir el lavado de células suave.
    2. Lavar las células con un movimiento rápido de la placa para eliminar los medios de comunicación de células y añadiendo 100 l tibia, 37 ° C, tampón de liberación. Repita dos veces.
  2. Desafío Antígeno:
    1. Preparar una serie de dilución de antígeno (NIP-HSA o DNP-HSA) de 0 ng ml -1, 0,1 ng ml -1, 1 ng ml -1, 10 ng ml -1, 100 ng ml -1, 1.000 ng ml -1, 10.000 ng ml -1 en tampón de liberación y caliente a 37 ° C.
    2. Después del segundo lavado celular, descartar los medios de comunicación y reemplazado con 100 l de las soluciones de antígeno. Asegúrese de que los pozos en la misma fila (A1-6 por ejemplo) tienen la misma concentración de antígeno añadido a ellos.
    3. Establecer un control negativo en la fila A, añadiendo 0 ng antígeno -1 ml. Añadir aumento de la concentración de antígeno por las filas (BG), seguido de triton-x tampón (5% de Triton X-100) en células H fila para lisar las células para ser utilizado como un control positivo. Se incuba a 37 ° C durante 20 minutos para permitir que las células liberen sus mediadores.
  3. Configuración de los controles individuales así:
    1. Después de la incubación, transferir 50 l de sobrenadante celular a la otra mitad de la placa (pozos A1-6 a A7-12 pozos, etc.). Desechar los 50 l restantes de sobrenadante y reemplazar con 50 l de tampón de Triton-X para permitir la medición de la cantidad de mediadores liberados en cada pocillo en las columnas 7-12 como un porcentaje del total de los mediadores dentro de las células en la columna de 1-6 .
  4. Sustrato de la enzima:
  5. Añadir 50 l de sustrato β-hexosaminidasa (50 mM 4-nitrofenil N-acetil-β-D-glucosaminida preparado en DMSO diluido a 2 mM mediante la adición a tampón citrato 0,2 M de ácido cítrico y acetato de sodio 0,2 M, pH 4,5) a todos los pocillos a facilitado la conversión del sustrato a 4-nitrofenol por la enzima β-hexosaminidasa. Las placas se incuban a 37 ° C durante 2 horas.

Figura 2.4.1

  1. Terminación de la reacción:
    1. Detener la reacción por la adición de 150 l de tampón Tris (1 M Tris-HCl, pH 9) a cada pocillo como el alto pH del tampón se detiene la reacción y se convierte en la 4-nitrofenol en un color amarillo.
  2. La lectura y el análisis de los resultados:
    1. Leer la placa usando un espectrofotómetro de placas a 405 nm para medir la absorbancia del color amarillo. Calculó el porcentaje de β-hexosaminidasa liberada usando la siguiente fórmula:

Figura 2.6.1

  1. Aplicar esta fórmula para cada pozo, después de lo cual se toma un promedio para cada fila. A1 y A7 representan la ubicación de los pozos de la placa de 96 pocillos. Trazar la curva de porcentaje de liberación β-hexosaminidasa (que corresponde a la liberación total de mediador) against antígeno concentración 2, 3.

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Representative Results

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Los parentales células RBL-2H3.1 y las transfectadas con el gen del receptor FcεRIα equina fueron sensibilizados primero con IgE de ratón anti- DNP-HSA y desafiados con el antígeno DNP-HSA. IgE de ratón se une al receptor endógeno de rata en ambas líneas celulares y por lo tanto actúa como un control para comprobar la viabilidad liberación de ambas líneas celulares para liberar mediadores (Figura 1 A). Este es un control importante y debe llevarse a cabo desde rutinariamente sobre extendido (> 10 semanas) pasaje en cultivo celular, las células RBL-2H3.1 deriva hacia el fenotipo no secretor 27. Las células de los padres con el apoyo de un mediador de la liberación pico de 51,54% ± 4,79%, mientras que las células que expresan el receptor FcεRIα equina tuvieron un pico de liberación de mediador de 45.99% ± 5.76%. Estas mismas líneas celulares donde luego sensibilizados con IgE equina contra NIP-HSA y desafiados con el antígeno NIP-HSA (Figura 1 B). Las células de los padres no se sometieron a la liberación de mediadores, ya que elIgE equina no se une al receptor endógeno de rata. Por otro lado, como se esperaba, las células RBL-2H3.1 que expresan el receptor FcεRIα equina se sometieron a la liberación de mediadores cuando sensibilizadas con IgE equina contra NIP-HSA y desafiados con el antígeno NIP-HSA, dando un pico de liberación de 36,68% ± 4,88% .

Estos resultados confirman la eficacia de este protocolo de ensayo de liberación en la investigación de la liberación de mediadores a través de los receptores de IgE equina. Esto demuestra que esta línea celular es una herramienta de diagnóstico útil en la búsqueda de nuevas estrategias de intervención asnos terapéuticas en alergia equina in vitro reduciendo la necesidad de la experimentación con animales. El mismo protocolo se aplica también a las células RBL-2H3.1 transfectadas con los receptores FcεRIα humanos y caninos.

Este protocolo también se utilizó para probar la seguridad de una estrategia de inmunización potencial que intenta neutralizar los anticuerpos de suero IgE canina 30. De los resultadosen la (Figura 2) se puede determinar que la estrategia de inmunización no es seguro. El suero anti-canino-IgE unido con éxito a la IgE canina como se pretendía originalmente con el fin de neutralizar la IgE sérica y prevenir su unión a su receptor. Pero esta unión era inespecífica, y por lo tanto la cruz de suero anti-IgE ligada al receptor en la superficie de las células, lo que resulta en la liberación de mediadores, potencialmente resultando en un shock anafiláctico si esta estrategia de inmunización fue utilizado como una vacuna contra la alergia.

RBL-2H3.1 Expresando Equina FcεRIα - - Producido en el laboratorio
Equinos IgE contra NIP-HSA - - Producido en el laboratorio
Placa de 96 pocillos Sigma CLS3595 -
Multicanal pipeta Anachem - -
Incubadora Galaxy R - -
Ácido 4Hydroxy-5-yodo-3-nitrofenilacético Cambridge Research Biochemicals N-1070-1 NIP-OH se conjugó con albúmina de suero humano para hacer NIP-HSA en el laboratorio
Dinitrofenilo conjugado con albúmina de suero humano Sigma A6661 Abreviada DNP-HSA
Espectrofotómetro de placas Anthos Labtec HT2 - -
Tubería Sigma P1851 -
Cloruro de Sodio Sigma S7653 -
Cloruro de Potasio Sigma P9333 -
Cloruro de Magnesio Sigma M2670 -
Cloruro de calcio Sigma C1016 -
Triton x100 Sigma X100 -
4-nitrofenil N-acetil-β-D-glucosaminida Sigma N9376 Solución de sustrato de la llamada β-hexosaminidasa se preparó 50 mM en DMSO
Dimetil sulfóxido Sigma D2650 -
Ácido cítrico Sigma 251275 -
Acetato de Sodio Sigma S7670 -
Tris Sigma T5941 -

Tabla 1: Tabla de Material y Equipo:

Figura 1
Figura 1: A muestra el ensayo de liberación de preformado en células RBL-2H3.1 no expresan equina FcεRIα y que expresan el receptor a través del ratón IgE contra DNP-HSA. El ratón IgE se une al receptor endógeno de rata que resulta en la liberación de mediadores cuando desafiados con el antígeno DNP-HSA, lo que confirma que ambas líneas celulares son viables y apoyan mediada por IgE inducida por antígeno liberación de mediadores 2, 3. El gráfico B muestra el ensayo de liberación de preformado en células parentales RBL-2H3.1 que no expresan equina FcεRIα y los que expresan equina FcεRIα, utilizando IgE equina contra NIP-HSA para la sensibilización de células. La IgE equina se une al receptor equino, pero no el receptor endógeno de rata, para dar lugar a la liberación de mediadores, esto se confirmó ya que las células parentales no liberar mediadores mediador, mientras que las células que expresan el receptor de apoyo equina equina mediada por IgE, el antígeno inducida , mediador release 2, 3.

Figura 2
Figura 2: Resultados de ensayo de liberación de Inmunización: El gráfico muestra el ensayo de liberación de preformado sobre las células RBL-2H3.1 que expresan FcεRIα canino, usando la IgE canina contra NIP-HSA para la sensibilización de células, y rata inmunizada anti-canino-IgE en suero como el antígeno. El control utilizado fue suero pre-inmunizado, y el control positivo era antígeno NIP-HSA. La IgE canina se une al receptor canino. Por otra parte, el anti-IgE en suero se une al receptor unido IgE canina y enlaces cruzados, y el receptor, en la superficie de las células que resulta en la liberación de mediadores. Esto, en efecto, demuestra que esta estrategia de inmunización en particular tiene el potencial de causar una reacción shock anafiláctico, y por lo tanto no se considera seguro 30.

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Discussion

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En resumen, los resultados de esta investigación mostraron que cuando las células RBL-2H3.1 expresan FcεRIα equinos están sensibilizados con IgE equina y desafiados por un antígeno, que dan una liberación pico mediador de 36.68% ± 4.88% de la cantidad total de mediador dentro de la células, en comparación con el RBL-2H3.1 células parentales no expresan equina FcεRIα.

Así, este ensayo proporciona una herramienta útil para la investigación y el estudio de las respuestas alérgicas equinos in vitro. Su permite la determinación de la cantidad de mediador liberado por las células de las células cebadas / basófilos linaje y por lo tanto se puede esperar a avanzar en la investigación en alergia equina, si la evaluación de los agentes causantes de la alergia, o la investigación de los agentes bloqueadores de IgE / receptor.

Este ensayo se modificó para estudiar la alergia equina de las publicaciones anteriores que utilizaron para estudiar humanos y caninos alergias 4529 para los mismos fines. La línea celular de ingenierías humana que expresa y se emplea FcεRIα caninos para estudiar la eficacia y seguridad de los agentes de bloqueo de la alergia, tales como vacunas dirigidas a la inhibición de la interacción IgE / receptor 30. La investigación reveló un efecto secundario anaphylactogenic de inmunógenos que comprende todo el dominio Cε3, que también fue propuesto por otros como una vacuna para la atenuación de las respuestas alérgicas mediadas por IgE en perros 24. Sobre la base de nuestra investigación, la base molecular de esta complicación potencialmente grave podría ser racionalizada sobre la base de reconocimiento de epítopos en el anticuerpo IgE por el suero inmune anti-IgE que contiene anticuerpos anti-IgE que se dirigen a epítopos en Cε3 y no queden ocultas cuando IgE está complejado con su receptor. Esta observación no se podría haber hecho en ausencia de este sistema de ensayo y está en fuerte contraste con la investigación por 24 años, que también investigó la estrategia de intervención contra la alergia basada en in vivo inmunidadesción con dominios Cε3, pero no han discutido la seguridad de la estrategia debido a la ausencia de un ensayo de este tipo.

Los pasos críticos de este protocolo es asegurar que la mayoría de las células RBL-2H3.1 son del fenotipo secretor; que tiene las células en cultivo mayor que 10 semanas hace que se inicia a la deriva hacia el fenotipo no secretor 27 independientemente de que expresaron la FcεRIα clonado de interés o no. Por lo tanto, es siempre esencial para ejecutar los controles positivos de IgE de ratón junto con el experimento (Figura 1), y para mantener un gran stock congelado de células secretoras.

Además, el pH de todos los tampones debe ser precisa o correr el riesgo de dar resultados falsos negativos; la ampliación de la vida útil de los buffers altera su pH, y por lo tanto cualquier tampón mayores de 2 meses tiene que ser desechada.

La técnica muestra la interacción de un producto químico con el ce RBL-2H3.1LLS, y cómo se promueve o suprime, su liberación de mediadores in vitro. Esta es una buena indicación de lo que podría suceder en vivo, por lo que este protocolo es un paso esencial cuando la investigación de estrategias terapéuticas contra la alergia potenciales. La técnica no, sin embargo, indicar que parte del complejo de anticuerpo / receptor de la molécula de interés interactúa con.

Otros trabajos de investigación, tales como 20 han indicado que equina RAO no está relacionado con la mediación de IgE, que es por qué algunos discrepancia puede ser visto con otros editores como Moran et al. 31, cuando el uso de suero total equina para probar a Ca 2 + afluencia de RAO sufrimiento caballos utilizando anticuerpos reagínicos inespecíficos, por lo que diferentes anticuerpos podrían ser responsables de la celular de Ca 2 + afluencia.

Este ensayo es específico para la hipersensibilidad mediadas por IgE, que también se pueden aplicar a otros organismos, tales como seres humanos yperros de 29 años, y se utiliza específicamente para probar la seguridad de las estrategias de intervención contra la alergia, tales como sintéticos / anticuerpos anti-alergia quiméricos 30.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
RBL-2H3.1 Expressing Equine FcεRIα - - Produced in the lab
Equine IgE anti NIP-HSA - - Produced in the lab
96 Well Plate Sigma CLS3595 -
Multi Channel Pipette Anachem - -
Incubator Galaxy R - -
4Hydroxy-5-iodo-3-nitrophenylacetic acid Cambridge Research Biochemicals N-1070-1 NIP-OH was conjugated with Human Serum Albumin to make NIP-HSA in the lab
Dinitrophenyl Conjugated to Human Serum Albumin Sigma A6661 Abbreviated DNP-HSA
Plate Spectrophotometer Anthos Labtec HT2 - -
Pipes Sigma P1851 -
Sodium Chloride Sigma S7653 -
Potassium Chloride Sigma P9333 -
Magnesium Chloride Sigma M2670 -
Calcium Chloride Sigma C1016 -
Triton x100 Sigma X100 -
4-nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide Sigma N9376 Stock solution called β-hexosaminidase substrate was 50mM prepared in DMSO
Dimethyl Sulfoxide Sigma D2650 -
Citric Acid Sigma 251275 -
Sodium Acetate Sigma S7670 -
Tris Sigma T5941 -

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References

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Sabban, S., Ye, H., Helm, B. Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor FcεRI. J. Vis. Exp. (93), e52222, doi:10.3791/52222 (2014).More

Sabban, S., Ye, H., Helm, B. Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor FcεRI. J. Vis. Exp. (93), e52222, doi:10.3791/52222 (2014).

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