Introduction
وهي نتيجة لا مفر منها لتقدم السن هي القدرة تقليل من الأنسجة والأعضاء على البقاء وظيفية. الخلايا الجذعية البالغة ضرورية للحفاظ على توازن الأنسجة وظائف الجهاز، ولكن كما من الكائنات العمر، والخلايا الجذعية أيضا تشهد انخفاضا في السلوك البيولوجية. هذا هو ضار بشكل خاص إلى الأنسجة التي لديها معدل دوران عالية، مثل ظهارة الأمعاء. وتشمل السمات المميزة للخلايا الجذعية الذين تتراوح أعمارهم بين الضرر الجيني، وآليات إصلاح المتضررة، وضعف تنظيم دورة الخلية ومسارات الإشارات misregulated، وكلها تؤثر على سلوك الخلايا الجذعية العادي (استعراضها في 1-3). عن طريق التلاعب مسارات إشارات محددة أو هدمت جينات معينة، لقد اكتسبت نظرة ثاقبة دورهم في تنظيم والحفاظ على سلوك الخلايا الجذعية العادي. لأن معظم هذه التجارب من النهج جزيء مرشح، لدينا القليل جدا من المعرفة حول التغييرات الجزيئية الداخلية التي تحدث في الخلايا الجذعية خلالالشيخوخة. طريقة واحدة لنهج هذا السؤال هو لمقارنة Transcriptome على من الشباب مقابل الخلايا الجذعية القديمة لتحديد الجزيئات التي تتغير بشكل ملحوظ خلال الشيخوخة الملف الشخصي التعبير. للأسف، أعاقت التحديات البيولوجية والتقنية تقدمنا بشأن هذا النهج حتى الآن.
ذبابة الفاكهة البطن هو كائن نموذج مناسب للغاية لدراسة الشيخوخة لأنه لديه لمدة قصيرة (حوالي 60-70 يوما) والمعارض الشيخوخة الظواهر (استعراضها في 4). وعلاوة على ذلك، يمكن تسريع عملية الشيخوخة في ذبابة الفاكهة في درجة الحرارة. عندما الحفاظ على الذباب في 29 ° C، وهو النمط الظاهري العمر في الأنسجة المعوية يمكن بالفعل لوحظ بعد 15 يوما 5. وعلاوة على ذلك، ذبابة الفاكهة غير قابلة لعدد كبير من التلاعب الجيني. على وجه الخصوص، برزت المعي المتوسط ذبابة الفاكهة كنظام نموذجا ممتازا لدراسة تأثير مسارات الإشارات المختلفة والتحديات البيئية علىبيولوجيا الخلايا الجذعية المعوية (ISCS) أثناء الشيخوخة (استعراضها في 6-10). ظهارة الأمعاء ذبابة الفاكهة لديها نسبة دوران عالية، وجددت كل أسبوعين في الإناث وعن مرة واحدة في الشهر في الذكور 11. ISCS المقيمين في المعي المتوسط ذبابة الفاكهة لديها القدرة على الانقسام وإنتاج ISC-متجدد النفس وخلية السلف ما بعد الإنقسامية يسمى enteroblast (EB) 12،13. وEB يفرق في إما خلية معوية الاستيعابية أو خلية enteroendocrine إفرازية. لهذا التاريخ، والجمع علامة الوحيدة التي تصف بشكل لا لبس فيه لتكاليف الدعم غير المباشر هو تعبير عن نزهة عامل النسخ (ESG) ويجند الشق دلتا (DL) 14. ومع ذلك، وهذا ينطبق على القناة الهضمية من الشباب والأصحاء فقط. أثناء الشيخوخة، يتميز ظهارة المعي المتوسط زيادة في انتشار ISC 15-17. بالإضافة إلى ذلك، يشير الشاذة الشق يعطل قرار مصير الخلايا الوليدة ISCويدفع misdifferentiation من EBS 15. وهذا يؤدي إلى تراكم الخلايا التي تنشط لإشارات الشق وشارك في التعبير عن ESG ودل، مما جعل دل التعبير غير كافية لتحديد بحسن نية الخلايا الجذعية في المعي المتوسط العمر. صعوبة في تحديد ISCS الحقيقية قد أعاق القدرة على دراسة التغيرات المحلية في ISCS الشيخوخة حتى الآن.
لقد تناولت هذه القضية من خلال الاستفادة من ESG -Gal4، UAS-GFP خط الطيران المعدلة وراثيا في أي مستوى من التعبير GFP في ISCS وEBS مختلفة بطبيعتها ويبقى مختلف أنحاء الشيخوخة. وقد وصفت نهج مماثل لعزل neuroblasts اليرقات والخلايا العصبية 18،19. تم تشريح Midguts من الشباب وESG -Gal4 القديمة، الذباب، UAS GFP وفصلها إلى خلايا واحدة. ثم تم فرز الخلايا لخلايا GFP إيجابية باستخدام مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS). ومن المثير للاهتمام، وفرز GFP إيجابية جells موزعة على اثنين من قمم مختلفة تعتمد على كثافة GFP مضان (GFP عالية ومنخفضة GFP). وعلاوة على ذلك، فإن توزيع الخلايا GFP إيجابية في اثنين من القمم المترابطة أيضا مع حجم الخلية: كانت الخلايا التي عرضت منخفضة الكثافة GFP صغير وكانت أقل الحبيبية في حين أن الخلايا مع كثافة عالية GFP أكبر وأكثر الحبيبية. وتشير هذه الملاحظة أن ISCS أصغر يمكن تمييزها عن EBS أكبر باستخدام FACS على أساس كثافة GFP واختيار المناسب مبعثر إلى الأمام (FSC) والجانب مبعثر (SSC) الإعدادات. يثير الاهتمام والفضول، ظلت قمم اثنين من فصل واضح أثناء الشيخوخة. وعلاوة على ذلك، تغيرت نسبة من قمم اثنين في الطريقة التي يعكس بصمات المذكورة أعلاه midguts الشيخوخة: وهي أن عدد كبير، misdifferentiated زيادات EBS مع مرور الوقت. من هذه النتائج فإننا نستنتج أنه من خلال الفرز للخلايا GFP إيجابية باستخدام إعدادات المعلمة FACS المناسبة يمكننا إثراء لISCS وEBS في أي وقت نقطة دخلال شهر الشيخوخة.
وخلاصة القول، ونحن نقدم استراتيجية FACS التي تمكن الباحثين لإثراء لمدة السكان الخلية مختلفة، ISCS وEBS، من midguts ذبابة الفاكهة في أي عمر وعزل هذه الخلايا لمزيد من التحليل، مثل الجيل القادم التسلسل. يسمح هذا سيلة قوية لدراسة الآليات الجزيئية الذاتية التي هي ملازمة لالشيخوخة في سكان المخصب من الخلايا الجذعية أو السلف. فإن البيانات التي تم الحصول عليها من هذه الدراسات تسهيل مما لا شك فيه تحديد جزيئات المحفوظة والتي تكون مهمة في الشيخوخة عبر الأنواع.
Protocol
ملاحظة: إذا تم استخدام هذا البروتوكول لأول مرة لعزل ISCS التي كتبها FAC الفرز، والضوابط التالية إلزامية من أجل وضع البداية المعلمات FACS بشكل صحيح: تنفصل الخلايا من النوع البري (على سبيل المثال ث 1118) midguts ذبابة الفاكهة دون Sytox. خلايا فصلها عن نوع البرية (على سبيل المثال ث 1118) midguts ذبابة الفاكهة مع Sytox (انظر الخطوة 3.6). تنفصل الخلايا من midguts من ESG -Gal4،-UAS GFP خط الطيران دون Sytox.
1. إعداد الحلول وأطباق لغوت تشريح
- إعداد 4-6 قارورة تحتوي كل منها على 40 أنثى الذباب من ESG -Gal4،-UAS GFP خط الطيران.
- من حل 10X PBS الأسهم إعداد 500 مل 1X PBS (1.8 ملي ناه 2 PO 4 · H 2 O، 8.4 ملي نا 2 هبو 4 · 2H 2 O، 175 مم كلوريد الصوديوم، وضبط درجة الحموضة إلى 7.4).
- إعداد 3.5٪ محلول الاغاروز في برنامج تلفزيوني 1X (3.5 غرام الكهربائي الصف الاغاروز في 100 مل 1X PBS). إعداد لوحات تشريح بصب هذا الحل في أطباق بتري (قطر 8.5 سم) لتغطية الجزء السفلي. طبقة الاغاروز يمنع تضر نصائح من ملقط أثناء إجراء تشريح. بعد أن طدت هلام تخزين لوحات تشريح في 4 درجات مئوية.
- إعداد 300 مل من برنامج تلفزيوني 1X + 1٪ BSA الطازجة قبل تشريح ووضع زجاجة على الجليد أو على 4 درجات مئوية.
- تشغيل أجهزة الطرد المركزي وندعه يبرد إلى 4 ° C.
- لهب نصائح من 2 الماصات الزجاج باستور لتنعيم الحواف.
- نظيفة اثنين من أزواج من ملقط وشفرة حلاقة واحدة مع 70٪ من الإيثانول.
- ضع 05:56 1.5 مل أنابيب microcentrifuge لجمع midguts تشريح على الجليد.
2. إعداد الجهاز الهضمي المسالك وتشريح المعي المتوسط
- تخدير الذباب من قارورة واحدة (40 الذباب) مع CO 2 على سرير ذبابة القياسية، وقطع رأس كلالذباب باستخدام شفرة حلاقة ونقلها إلى الطبق تشريح. صب الباردة 1X PBS الحل / 1٪ BSA في طبق تشريح لتغطية agarose هلام. سوف الذباب تطفو.
- الاستيلاء على البطن الطاير مع زوج واحد من ملقط، في حين الضغط على الصدر مع الزوج الآخر من الملقط. فصل القفص الصدري من البطن. والقناة الهضمية تكون واضحة وعلى الأرجح لا يزال يتم توصيل المعي الأمامي / المحاصيل إلى القفص الصدري.
- الاستيلاء على القناة الهضمية والخروج به من القفص الصدري. تتكشف القناة الهضمية، والاستيلاء على المحاصيل وسحب الأمعاء قليلا الأمامية بعيدا عن البطن.
- الاستيلاء على نهاية الخلفي من البطن مع زوج واحد من ملقط وحافة بشرة المفتوحة الأمامية مع الزوج الآخر من الملقط. يجب الحرص على عدم تدمير الأنسجة الأمعاء جاحظ. سحب نهاية الخلفي بعيدا لكسر بشرة ومواصلة سحب الخلف بلطف شديد حتى تم سحب الأمعاء بأكمله من تجويف البطن. قد يكون المحصول المراد إزالتها مسبقا إذا كانت كبيرة جدا لاحتوائهمن خلال تجويف الجسم.
- إزالة المعي الأمامي، الأنابيب مالبيغي، المعى المؤخر والمبايض وترك المعي المتوسط العارية.
- باستخدام الزجاج ماصة باستير، ونقل دفعة من midguts تشريح لmicrocentrifuge 1.5 مل أنبوب يحتوي الباردة برنامج تلفزيوني 1X / 1٪ محلول BSA والحفاظ على أنبوب على الجليد. يجب أن تتم معالجة العينات في غضون 2 ساعة.
- بعد تشريح دفعة كاملة كاملة، شطف طبق تشريح مع الماء المقطر المزدوج ليغسل اليسار على الحطام. بدء تشريح الدفعة التالية من midguts (تكرار الخطوات 2،1-2،7). تشريح العديد من دفعات ممكن في غضون 2 ساعة، ثم انتقل إلى الخطوة 3.1.
3. الهضم من الأنسجة غوت إلى خلايا الحصاد لFAC الفرز
- إزالة / 1٪ الحل BSA برنامج تلفزيوني 1X من midguts وإضافة 500 ميكرولتر من 0.5٪ التربسين-EDTA حل لكل عينة.
- دوامة جيدا لمدة 20 ثانية واحتضان العينات بواسطة هزاز لطيف / الدورية في 20 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة 25-30 دقيقة.
- دوامة مرة أخرى بعد حوالي 30 دقيقة، والسماح للسليما بالوعة الأنسجة المعي المتوسط إلى أسفل الأنبوب. بعناية إزالة الخلايا التي هي في تعليق مع ملتهب الزجاج ماصة باستير وتصفية لهم من خلال النايلون 35 ميكرومتر إلى شبكة الطازجة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge.
- تدور الخلايا في أسفل 100 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. من ملاحظة، عند البدء في هضم، وبيليه الخلية قد لا تكون مرئية في البداية ولكن سوف تصبح واضحة كما في الأنسجة هضم تقدم.
- نقل بعناية الحل التربسين إلى العينة أنبوب الأصلي تحتوي على ما تبقى من الأنسجة المعي المتوسط سليمة. تجنب نقل عدد كبير جدا من الخلايا من بيليه.
- بلطف اعادة تعليق بيليه خلية في 400 ميكرولتر من البرد برنامج تلفزيوني 1X / 1٪ BSA. الحفاظ على أنابيب microcentrifuge تحتوي على خلايا نأت على الجليد وتغطية الأنابيب مع رقائق الألومنيوم لحماية الخلايا من الضوء.
- دوامة الحل التربسين التي تحتوي على ما تبقى من الأنسجة المعي المتوسط سليمة مرة أخرى ووضع عيناتعلى الروك لمدة 30 دقيقة أخرى في درجة حرارة الغرفة.
- كرر الخطوات من 3.3 إلى 3.4.3 حتى كل من الأنسجة المعي المتوسط تم هضمها. الجمع بين الخلايا فصلها عن جميع أنابيب microcentrifuge في واحدة أنبوب microcentrifuge. قد تتطلب هذه خطوة الطرد المركزي كما هو الحال في 3.4، منذ حجم كل تعليق خلية مجتمعة قد يتجاوز 1.5 مل. الحفاظ على تعليق خلية على الجليد وحماية الخلايا من الضوء.
- تدور الخلايا نأت إلى أسفل في 100 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة بعناية أكبر قدر من طاف ممكن ترك حوالي 50-100 ميكرولتر من / 1٪ الحل BSA برنامج تلفزيوني 1X في أنبوب microcentrifuge. بلطف resuspend الخلايا فصل في 800 ميكرولتر برنامج تلفزيوني 1X / 1٪ BSA تحتوي على Sytox (1: 20،000).
- نقل تعليق خلية إلى 5 مل جولة أسفل أنبوب فالكون من خلال تصفية الخلايا من خلال قبعة مبكرة مصفاة الخلية (35 ميكرومتر شبكة النايلون). دائما الاحتفاظ بعينات خلية على الجليد ومحمية من الضوء. الخلايا هي الآن جاهزة ليتم فرزها.
- ماصة 600 ميكرولتر من حل RNAlater في كل أنبوب microcentrifuge إلى التي سيتم فرز الخلايا لاحقة العزلة RNA. لتطبيقات المصب الأخرى الخلايا يمكن جمعها في حل مختلف، على سبيل المثال في برنامج تلفزيوني العقيمة.
4. FAC الفرز لعزل الخلايا الجذعية المعوية
- التبديل على الصك التدفق الخلوي ساعة واحدة على الأقل قبل الفرز. تأكد من أن نظام فلويديك خال من فقاعات الهواء.
- اختيار 70 ميكرون حجم فوهة لحقن الخلايا في مجرى السائل غمد.
- ضبط السعة للتيار السائل الأساسية بحيث يتوافق مع قيمة الفجوة إلى القيمة المرجعية (6-7، وعند استخدام فوهة 70 ميكرون). السماح للتيار السائل الأساسية تستقر قبل البدء في فرز.
- اتباع هذا النظام عندما وضع في البداية المعلمات للفرز:
- تحميل الخلايا نأت تم الحصول عليها من الشجاعة نوع البرية. أولا، وضبط FSC وSSC الفولتيةلرسم الخلايا في وسط مؤامرة مبعثر. ثانيا، ضبط FITC (GFP) الجهد بحيث يتم رسم جميع الخلايا أقل من 10 2 على لوغاريتمي محور س. تعيين المعلمة FITC يحدد الحد الأقصى لتألق ذاتي.
- تحميل الخلايا نأت تم الحصول عليها من الشجاعة نوع البرية مع Sytox أضافت. ضبط قيمة الأزرق المحيط الهادئ الجهد وبوابة لتحديد وخلايا معيشة منفصلة من الخلايا الميتة Sytox إيجابية في الأزرق المحيط الهادئ مقابل FSC-A مؤامرة مبعثر.
- تحميل الخلايا نأت تم الحصول عليها من ESG -Gal4،-UAS GFP خط الطيران دون Sytox وضبط الجهد FITC للتأكد من أن كل الخلايا GFP إيجابية يتم رسم ضمن مؤامرة مبعثر.
- وأضاف خط الطيران UAS GFP مع Sytox تحميل الخلايا نأت تم الحصول عليها من ESG -Gal4. ضبط قيمة الأزرق المحيط الهادئ الجهد وبوابة لتحديد وخلايا معيشة منفصلة من القتلى، وخلايا Sytox إيجابية (بوابة P1).
- تعيين SSC-A وFSC-A بوابة للتعرف على GFP-خلايا إيجابية (على أساس المؤامرة الرسم البياني) على النحو الذي يحدده حجم وتحبب (بوابة P2).
- تعيين بوابة FSC-H وFSC-W لتحديد واستبعاد الحلل خلية GFP إيجابي على أساس حجمها (بوابة P3).
- تعيين SSC-H وبوابة SSC-W لتحديد واستبعاد الحلل خلية GFP إيجابية على أساس من تحبب (بوابة P4).
- استخدام البوابة P4 لتصوير الخلايا GFP إيجابية في مؤامرة رسم بياني يوضح عدد الخلايا (العدد) مقابل كثافة GFP. سوف قمتين متميزة من الخلايا GFP إيجابية تكون مرئية. إنشاء بوابة لكل الذروة (بوابات P5 وP6). يحتوي بوابة P5 السكان الخلية التي يتم تخصيبها للISCS ويمكن فرزها بشكل منفصل من الخلايا في بوابة P6.
- الخلفية البوابة في مؤامرة كفاف للتحقق من أن اثنين من السكان الخلية متميزة GFP إيجابية تحتوي على الخلايا الحية (قارن مع بوابة P1) والخلايا من الحجم الصحيح (مقارنة مع بوابة P2).
- فرز خلايا في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل يحتوي على 600 & #181؛ ل من حل RNAlater. ويتم الفرز في معدل تدفق منخفض (بحد أقصى 2.0، 70 ميكرون فوهة، 1،000 أحداث / ثانية، و 70 رطل) وتوظيف اتجاهين نقاء النوع.
- بعد اكتمال الفرز، دوامة فورا الخلايا مرتبة لفترة وجيزة والحفاظ على أنابيب microcentrifuge على الجليد حتى الشروع في العزلة RNA أو التطبيقات المصب الأخرى.
Representative Results
للحصول بين 50،000-100،000 الخلايا من FAC الفرز، بين 160 و 200 midguts تحتاج إلى تشريح. ومن الواضح أن هذا هو الأكثر تستغرق وقتا طويلا خطوة من الإجراء بأكمله. الرسوم المتحركة هو مبين في الشكل 1A يوضح الخطوات الرئيسية لتشريح امعاء، والتي وصفها بالتفصيل في بروتوكول المقدمة هنا. هذا الإجراء يمكن تعديلها بشكل فردي. ويرد تشريح والجهاز الهضمى كله في الشكل 1B.
عندما تكون كافة الأنسجة المعي المتوسط تم هضمها، والاستمرار على الفور مع FAC الفرز. بعد استراتيجية النابضة موضح في البروتوكول يسمح لتحديد نجاح والفرز من السكان الخلية المخصب لISCS وEBS من الشباب (الشكل 2) ومن midguts القديمة (الشكل 3). يتم تعيين بوابة P1 لتشمل الخلايا السليمة الحية وفقط لبوابة الخروج الخلايا الميتة. الخلايا التي رسم فوق 10 3 على وغاريتمي Y-الفأسوعند استخدام قناة الأزرق المحيط الهادئ والذي يعرف بأنه الخلايا الميتة. ويستثنى من النقاط التي مؤامرة أقل من 40 على محور س (FSC-A) هي في معظمها الحطام وبالتالي أيضا (الشكل 2A). في المؤامرة مبعثر من SSC-A مقابل FSC-A ويتم توزيع الخلايا على أساس حجمها وتحبب. للحصول على قرار الأمثل، ويتم وضع الخلايا في مؤامرة مبعثر كما هو مبين في الشكل 2B عن طريق ضبط أنبوب مضخم (PMT) الجهد. في المؤامرات مبعثر FSC-H مقابل FSC-W وSSC-H مقابل SSC-W يتم فصل الخلايا واحد من وحدات العمل والحلل على أساس حجم (الشكل 2C) وبناء على تحبب (الشكل 2D). عندما تصور الخلايا المدرجة في بوابة P4 في مؤامرة الرسم البياني، وفصل واضح للGFP سلبية، GFP منخفض (بوابة P5) وعالية (بوابة P6) خلايا GFP غير مرئية (الشكل 2E). الخلايا العارضة أقل كثافة GFP صغيرة وأقل الحبيبية وتمثل ISCS. الخلايا العارضة العالي GFP كثافة العملياتensity تكون أكبر وأكثر تفصيلا وتمثل EBS. عكس الناسخ (RT) -PCR لدل على كدنا] توليفها من RNA من خلايا كل السكان GFP إيجابية (بوابات P5، P6) كشفت أن إشارة دل هي في الواقع أقوى في الخلايا منخفضة GFP أصغر مما كانت عليه في أكبر، GFP عالية الخلايا (الشكل 2H). الخلايا ثم تم backgated وصفت في المؤامرات كفاف للتأكد من أن GFP منخفض (بوابة P5) وGFP عالية (بوابة P6) الخلايا تختلف من حيث الحجم وتحبب (الشكل 2F) ومازالت على قيد الحياة (الشكل 2G). وتجدر الإشارة، يمكن أن اثنين من قمم GFP إيجابية الخلايا (منخفض GFP وGFP عالية) يكون فقط حاليا بشكل جيد إذا تم معايرة FITC (GFP) قناة باستخدام صحيح الضوابط المبينة في البروتوكول.
استخدمت استراتيجية النابضة نفسها عندما يكون الترتيب ISCS المستمدة من الشجاعة القديمة (الشكل 3). المؤامرات مبعثر (شملت رقمالبريد 3A-D)، والرسم البياني (الشكل 3E) والمؤامرات كفاف (الشكل 3F، G) هي مشابهة لتلك التي هو موضح في الشكل (2). وكما ذكر أعلاه، وليس هناك علامة حسنة النية لتحديد ISCS في midguts القديمة، وبالتالي لم يتم تقديم البيانات RT-PCR هنا. ومع ذلك، فإن الملاحظة المثيرة للاهتمام هنا هو أن قمم اثنين تحتوي على GFP منخفض (بوابة P5) أو عالية (بوابة P6) خلايا GFP مفصولين بوضوح أثناء الشيخوخة. وعلاوة على ذلك، فإن عدد الخلايا في عالية (بوابة P6) ذروة GFP يزيد بشكل ملحوظ خلال الشيخوخة، والذي يحاكي بشكل واضح تراكم معروفة من EBS misdifferentiated مع التقدم في السن. ويمكن أيضا أن ينظر إلى التغير في نسبة السكان الخلية اثنين في المؤامرات مبعثر (قارن الشكل 3A-D مع الشكل 2A-D) والمؤامرات كفاف (قارن الشكل 3F، G مع الشكل 2F، G). من هذه النتائج فإننا نستنتج أنه من خلال فرز لGFPخلايا -positive باستخدام FACS نحن يمكن أن تثري لISCS وEBS في midguts الصغار والكبار.
للتحقق من صحة نقاء ISCS معزولة وEBS، تم إجراء تحليل نوع آخر (الشكل 4). المؤامرات الرسم البياني للISCS وEBS بعد فرز (الشكل 4B، C) تصور درجات نقاء تتراوح بين 95٪ و 98٪.
إذا تم اتباع التسلسل الهرمي للتعيين المعلمات FACS على النحو المبين أعلاه بدقة، وهما السكان خلية مختلفة (GFP منخفضة، وصغيرة وGFP عالية، وأكبر) يمكن بالفعل تمييز في مؤامرة مبعثر GFP مقابل FSC-A (الشكل 5A). هؤلاء السكان الخلية اثنين لا يمكن تمييزها إذا تم تجاهل هذا التسلسل الهرمي (الشكل 5B-D).
الشكل (1): (A) والتخطيطي من الخطوات الرئيسية لديسcting الأمعاء الطاير. أولا، يتم إزالة الرأس (إزالة أجنحة اختيارية)، يليه الفصل بين الصدر والبطن لفضح القناة الهضمية. يتم تحرير القناة الهضمية في وقت لاحق من تجويف الجسم في الخطوات التالية. وتبين الأسهم السوداء تطور تشريح، في حين أن السهام الحمراء الداكنة تدل على الاتجاه سحب. الخطوط الحمراء في الصورة الأخيرة تشير إلى الأمامية والخلفية حدود المعي المتوسط. (B) صورة المجهر الخفيفة من الأمعاء ذبابة الكبار. وصفت المناطق الرئيسية والميزات التشريحية. خطوط حمراء علامة حدود المعي المتوسط.
ويسلط الضوء FAC فرز استراتيجية لتحديد وعزل ISCS وEBS من الشباب (7 أيام) midguts لأفضل تصور، والخلايا التي تمثل ISCS باللون الأحمر وأبرزت خلايا تمثل EBS: الرقم 2.باللون الأزرق في المؤامرات مبعثر (AD) والمؤامرات كفاف (F، G). ومن المقرر (A) بوابة P1 لاستبعاد الخلايا الميتة Sytox إيجابية تآمر فوق 10 3 على وغاريتمي المحور ص. يتم تعيين عتبة FSC-A في 40 أيضا لاستبعاد الخلايا الميتة والحطام. وبوابات (B) خلايا لFSC-A وSSC-A لتحديد الخلايا وفقا لحجم وتحبب (بوابة P2). تم استخدام مؤامرة الرسم البياني (E) بالتوازي مع تحديد الخلايا GFP إيجابي في FSC-A مقابل SSC-A مؤامرة مبعثر (B). (C، D) والمؤامرات مبعثر FSC-H مقابل FSC-W و SSC-H مقابل SSC-W تعمل على إزالة الركام والحلل وحدد لفانلات (بوابة P3 في C وبوابة P4 في D). (E) معارض المؤامرة الرسم البياني عدد الخلايا وكثافة GFP بهم. اثنين من القمم، GFP منخفض (بوابة P5) وGFP عالية (بوابة P6) يمكن تمييزها. (F، G) خلايا وبوابات العودة في مؤامرة كفاف للتحقق من أن الخلايا GFP إيجابية متميزة اثنين populatالأيونات هي من الحجم الصحيح (F) وتحتوي على الخلايا الحية (G). (H) الناسخ العكسي (RT) -PCR لدل على كدنا] توليفها من RNA معزولة عن الخلايا الموجودة في الذروة الأولى (بوابة P5) وفي الذروة الثانية (بوابة P6)، على التوالي. يمكن أن يتم الكشف عن المزيد من التعبير DL في الخلايا الموجودة في البوابة P5 مقابل بوابة P6. خدم تويولين كعنصر تحكم التحميل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: FAC فرز استراتيجية لتحديد وعزل ISCS وEBS من العمر (60 يوما) midguts لأفضل تصور، ويسلط الضوء على الخلايا التي تمثل ISCS باللون الأحمر وأبرز خلايا تمثل EBS باللون الأزرق في المؤامرات مبعثر (AD) وفي. المؤامرات كفاف (F، G). (A) يتم تعيين بوابة P1 لاستبعاد الخلايا الميتة Sytox إيجابية تآمر فوق 10 3 على وغاريتمي المحور ص. يتم تعيين عتبة FSC-A في 40 أيضا لاستبعاد الخلايا الميتة والحطام. من المذكرة، والزيادة التي تعتمد على العمر في الخلايا GFP إيجابية الأكبر هي بالفعل واضحة في هذه المؤامرة. تم بوابات (B) خلايا لFSC-A وSSC-A لتحديد الخلايا وفقا لحجم وتحبب (بوابة P2). تم استخدام مؤامرة الرسم البياني (E) بالتوازي مع تحديد الخلايا GFP إيجابي في FSC-A مقابل SSC-A مؤامرة مبعثر (B). (C، D) والمؤامرات مبعثر FSC-H مقابل FSC-W و SSC-H مقابل SSC-W تعمل على إزالة الركام والحلل وحدد لفانلات (بوابة P3 في C وبوابة P4 في D). (E) معارض المؤامرة الرسم البياني عدد الخلايا وكثافة GFP بهم. اثنين من القمم، GFP منخفض (بوابة P5) وGFP عالية (بوابة P6) يمكن تمييزها. من المذكرة، وارتفاع خلية GFP السكان تحتوي على خلايا أكبر زاد طوكان عدد ن خلال الشيخوخة. (F، G) خلايا بوابات العودة في مؤامرة كفاف للتحقق من أن اثنين من السكان الخلية متميزة GFP إيجابية هم من الحجم الصحيح (F) وتحتوي على الخلايا الحية (G). يرجى النقر هنا ل عرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
كانت أجري تحليل آخر لتحديد نوع نقاء ISCS معزولة وEBS خلايا (A) GFP إيجابية من الشباب (7 أيام) وعمره (60 يوما) midguts FAC فرزها وتظهر المؤامرات الرسم البياني توزيعها: الشكل 4. في قمتين على أساس كثافة GFP. (B) يوضح تحليل آخر نوع نقاء ISCS معزولة من midguts الصغار والكبار وهو> 97٪. (C) تحليل آخر نوع من فرزها Eبكالوريوس من midguts الصغار والكبار يظهر نقاء> 95٪. الشوائب طفيفة قد تنجم عن تبريد مضان أو التالفة ميكانيكيا GFP معربا عن الخلايا التي تسببها إعادة الفرز الخلايا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: أمثلة من المؤامرات مبعثر التي تظهر البيانات FACS دون المستوى الأمثل، الذي ينظر إليه عندما يتم تعيين المعلمات FACS بشكل صحيح (A) لمحة الممثل FACS من كل الخلايا عندما تم تعيين معلمات FACS بشكل صحيح على أساس الضوابط المبينة في البروتوكول. وحلقت السكان الخلية التي تحتوي ISCS باللون الأحمر وحلقت السكان الخلية التي تحتوي EBS باللون الأزرق. الخلايا دائري باللون الأخضر هي الخلايا الميتة التي لديها تألق ذاتي أقوى مقارنةالخلايا الحية، والتي يتم رسم أقل من 10 3 على وغاريتمي المحور ص. (B) مؤامرة مبعثر تصور نتيجة نموذجية تم الحصول عليها عندما لم يكن معايرة الصك FACS. لم يتم اكتشاف خلايا GFP إيجابية. (C) إذا لم يتم تعيين FSC بشكل صحيح، لا يتم الكشف عن مختلف السكان الخلية GFP إيجابية. (D) إذا لم يتم ضبط FITC (GFP) القناة بشكل صحيح، فإن غالبية GFP- خلايا الإيجابية التي يمكن فرزها لا يتم رسم في المؤامرة مبعثر بل على طول الحافة العليا من هذه المؤامرة. أيضا، في المؤامرة هو موضح هنا، لم يكن تعديل الحد الأقصى لتألق ذاتي، وبالتالي الخلايا التي مؤامرة فوق 10 2 على المحور Y-لوغاريتمي هي autofluorescent في الواقع، ويمكن أن يكون مخطئا كما GFP إيجابية الخلايا.
Discussion
يصف بروتوكول المعروضة طريقة لعزل ISCS من الشباب والكبار القديم midguts ذبابة الفاكهة، والتي يمكن أن تستخدم لاحقا لمزيد من التحليلات الجزيئية مثل الجيل القادم التسلسل. FAC الفرز من السكان خلية GFP إيجابية من ESG -Gal4، تم تحقيق-UAS GFP خط الطيران بالفعل من قبل العديد من الجماعات 21،22. ولكن، حتى الآن وجود اثنين من القمم متميزة من الخلايا GFP إيجابية تم إما التغاضي أو مقومة بأقل من قيمتها. وتبين لنا أن هذا الفصل لا يمثل سوى اثنين مجموعات مختلفة من أنواع الخلايا (ISCS وEBS)، ولكن أيضا أن اثنين من قمم خلايا GFP إيجابية تبقى منفصلة بوضوح أثناء الشيخوخة. هذه الملاحظة هي ذات أهمية كبيرة وقيمة للباحثين المهتمين في دراسة الخلايا الجذعية أو السلف أثناء الشيخوخة. وقد أعاق عزل ISCS من midguts القديمة من حقيقة أنه لا يوجد مزيج الواسمات الجزيئية لتحديد ISCS في المعي المتوسط العمر. العلامة الوحيدة التي شيحدد nambiguously ISCS في المعي المتوسط القديم هو الفوسفات-histone3 (PH3)، منذ ISCS هي تقسيم الخلايا فقط في المعي المتوسط 12،13. ومع ذلك، PH3 هو علامة غير مناسبة لعزل ISCS منذ عدد من تقسيم الخلايا الجذعية في أي نقطة زمنية معينة منخفض جدا من أجل الحصول على مبلغ محترم من ISCS للتحليلات لاحقة. وESG خط الطيران -Gal4، UAS-GFP هو خط الطيران الأكثر شيوعا التي يستخدمها الباحثون الذين يدرسون ISC وظيفة والصيانة والتمايز. ويستند معرفتنا الحالية بشأن تنظيم الجزيئي للISCS التوازن على الدراسات التي تم التلاعب بها جزيئات محددة ومسارات إشارات (استعراضها في 7). بالتالي، لا يزال يفتقرون إلى المعرفة عن التغيرات الجزيئية الداخلية التي تحدث أثناء الشيخوخة. طريقة هنا وصف يغلق هذه الفجوة، ويستند على حقيقة أن ISCS يمكن عزل بناء على حجمها وتحبب وGFP كثافة من midguts الكبار في أي نقطة زمنية أثناء الشيخوخة.
في حينإنشاء وتحسين هذه الطريقة وجدنا الخطوات التالية لتكون حاسمة لتحقيق نتائج يمكن الاعتماد عليها. تحتاج ما يقرب من 200 الشجاعة أن تشريح من أجل الحصول على كمية جيدة من ISCS لFAC الفرز. سرعة تشريح أمر بالغ الأهمية ويعتمد على ممارسة الفرد. ويمكن للفرد مدربين تشريح 40 الشجاعة في غضون 20-30 دقيقة. منذ يتم التعبير عن GFP أيضا في الأنابيب مالبيغي في ESG -Gal4،-UAS GFP خط الطيران، فمن الضروري لإزالة الأنابيب مالبيغي تماما من المعي المتوسط. يجب أن تظل midguts تشريح في بيئة باردة لتجنب تدهور الأنسجة وتقليل النشاط ريبونوكلياز في الأنسجة. ولذلك، يجب نقل midguts تشريح من الطبق تشريح في أنابيب microcentrifuge تحتوي الباردة 1X PBS الحل / 1٪ BSA بعد كحد أقصى من 20-30 دقيقة، وأبقى على الجليد. ومع ذلك، لا ينبغي أن يترك لتشريح midguts على الجليد لمدة أكثر من 2 ساعة قبل بدء تفكك الأنسجة مع التربسين. الأكثر efficiنهج الأنف والحنجرة هو تشريح العديد من دفعات من الذباب ممكن داخل هذه الساعة 2، ثم تبدأ التربسين هضم لهذه دفعات. إذا هناك حاجة لمزيد midguts، ويمكن تشريح خلال الأوقات حضانة التربسين هضم.
وعلى الرغم من التربسين هو انزيم قوية جدا، ويمكن أن يكون لها آثار ضارة على خلايا، ما زلنا الحصول عليها ما يكفي من المعيشة، الخلايا السليمة لاحق FAC الفرز. الخطوة الرئيسية الداخلي في أن يسمح لعزل خلايا سليمة هي أن تتم إزالة الخلايا فصلها من الحل التربسين كل 30 دقيقة. إذا حضنت midguts تشريح لمدة 2 ½ ساعة في التربسين التي تحتوي على الحل في درجة حرارة الغرفة، لاحظنا زيادة 20-30٪ في الخلايا الميتة، Sytox إيجابية. وتجدر الإشارة إلى أن الحل التربسين التي نستخدمها يحتوي على EDTA. وجود EDTA ربما يسهل تفكك الأنسجة التي كتبها مخلبية أيونات الكالسيوم والمغنيسيوم اللازمة للوظيفة المناسبة من جزيئات المصفوفة خارج الخلية. أهم الخطوات الحاسمة بنجاح لنوع ISCS من الشجاعة الصغار والكبار هي الإعدادات الأولية المناسبة للFACS والمعلمات النابضة باستخدام عناصر التحكم وصفها وبعد تسلسل هرمي محدد الفرز. نحن إجراء FAC فرز على II تدفق عداد الكريات ARIA (البرمجيات FACSDiva). من المهم أن يتم تشغيل الأداة على ساعة واحدة على الأقل قبل الفرز في عملية الاحماء الليزر. من ملاحظة، عندما يتم تنفيذ FAC فرز ISCS لأول مرة، والمعلمات للفرز وضرورة التعويض الواجب تعيين باستخدام ضوابط المذكورة أعلاه: (1) فصل الخلايا من النوع البري (على سبيل المثال ث 1118) midguts ذبابة الفاكهة دون إضافة Sytox - تحديد هذه المعلمة (الخطوة 4.4.1) يمنع فرز الخلايا استنادا تألق ذاتي لهم. (2) فصل الخلايا من النوع البري (على سبيل المثال ث 1118) midguts ذبابة الفاكهة مع Sytox وأضاف - وضع هذه المعلمة(الخطوة 4.4.2) تتيح فصل القتلى من الخلايا الحية (الخلايا الميتة لها تألق ذاتي عالية، ويمكن تلوث الخلايا GFP إيجابية مرتبة)؛ (3) فصل الخلايا من midguts من ESG -Gal4،-UAS GFP خط الطيران دون Sytox - وضع هذه المعلمة (الخطوة 4.4.3) يضمن أن جميع الخلايا GFP إيجابية يتم رسم ضمن مؤامرة مبعثر. إذا لم يتم تعيين هذه المعلمات بشكل صحيح، من المرجح أن تحتوي على السكان الخلية فرزها الخلايا الميتة والحطام (الشكل 5B، C)، العديد من الخلايا GFP إيجابية سيفتقد (الشكل 5D) واثنين من القمم متميزة للخلايا GFP إيجابية كما ينظر في المؤامرة الرسم البياني لن يتم الكشف عن (الشكل 2E والشكل 3E). مرة واحدة وقد تم تعيين FACS والمعلمات النابضة، يتم معايرة الصك وعلى استعداد لفرز الخلايا من ESG -GAL4،-UAS GFP خط الطيران. وبما أن هذه المعايير يمكن انقاذه، وكلها المستقبل الفرز جلسات لISCS وEBS من ESG -GAL4، UAS-GFP خط الطيران يمكن أن تبدأ من الخطوة 4.5. وعلى الرغم من اختيار وضع "الطهارة" وأداء نقاء اتجاهين نوع يقلل من عدد الخلايا مرتبة، فإنه يسمح لصرامة فرز أعلى (الخطوة 4.6 و الشكل 4B، C). من المذكرة، والاستفادة من استخدام Sytox بدلا من يوديد propidium لتسمية الخلايا الميتة هي أنه لا يوجد سوى امتداد منخفض في FITC (GFP) القناة، مما يجعل من السهل للتعويض عن غير المباشرة.
لدينا وسيلة لإثراء لISCS وEBS، على التوالي، تقوم على فرز الخلايا وفقا لمختلف المستويات GFP التعبير. ومن المحتمل أن يكون خلال الشيخوخة misdifferentiated EBS أيضا عن GFP على مستوى أدنى، ويمكن أن يكون مخطئا كما ISCS. ومع ذلك، منذ الخلايا مرتبة تختلف أيضا من حيث الحجم وتحبب، فإننا نعتقد أن استراتيجية الفرز لدينا هو الأكثر مناسبة لهذا التاريخ لإثراء لISCS وEBS. أيضا، فمن المعروف أن الخلايا في المعي المتوسط الشيخوخة الاحتفاظ بالهوية ISC لديها نواة صغيرة 15. للحصول على مزيد من الوضوح بشأن هوية الخلايا فرزها، يمكن للمرء أن فرز الخلايا من خط المعدلة وراثيا ذبابة الذي يحمل ESG -GAL4، UAS-GFP والشق يشير مراسل التحوير. منذ وقد تبين الشق أن تكون نشطة فقط في EBS 12،13، معزولة ISCS من المعي المتوسط الشباب ستكون سلبية لمراسل الشق، في حين أن EBS ستكون إيجابية لمراسل الشق. ومع ذلك، أثناء الشيخوخة الشق يشير يصبح الشاذة في النسيج المعى المتوسط. لذلك، لا بد من اختبار ما إذا كان هذا التجريبية انشاء هو في الواقع أكثر موثوقية للتمييز بين ISCS وEBS معزولة من المعي المتوسط القديم.
لقد استخدمنا بالفعل هذا النهج لتحليل مقارن لTranscriptome على ISCS من midguts الصغار والكبار وحددت عددا من العوامل التي يتم تنظيمها بشكل مختلف خلال الشيخوخة (unpub. observ). بالإضافة إلى ذلك، يسمح هذا الأسلوب لتحليل الاختلافات في التعبير الجيني بين ISCS وEBS. هذا التحقيقالصورة ستوفر نظرة ثاقبة على التغيرات الجزيئية الأولية التي تحدث كما يدخل خلية عملية التمايز. أيضا، فإن العزلة من خلال EBS الشيخوخة واللاحقة التحليلات تسليط الضوء على التغيرات الجزيئية التي يسببها سن misdifferentiation. وعلاوة على ذلك، وهذه الطريقة يمكن دمجها مع أدوات الوراثية الأخرى المستخدمة في ذبابة الفاكهة لدراسة وظيفة الجين. وباختصار، هذا الأسلوب يوفر نهج غير متحيز للتحقيق في الخصائص الجزيئية والتغيرات في ISCS وEBS أثناء الشيخوخة. هذا هو أداة قيمة من شأنها أن تسهل استكشاف آليات الشيخوخة في الخلايا الجذعية والسلف الكبار.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps: Dumont, Inox Biologie #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| SefarNitex 03-150um/38 (35 µm nylon mesh) | Sefar | 3A03-0150-102-00 | |
| Falcon 5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | |
| Polymax 1040 | Heidolph | 543-42210-00 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma | A4503-50G | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | Trypsin obtained from a different company most likely has a different activity and the duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly. |
| SYTOX Blue Dead Cell Stain for flow cytometry | Life Technologies | S34857 | |
| RNAlater Stabilization Solution | Life Technologies | AM7023 | Other solutions, e.g., Trizol can be used for subsequent RNA isolation |
| FACSAria II cell sorter | Becton Dickinson | Turn on one hour prior to sorting |
References
- Jones, D. L., Rando, T. A. Emerging models and paradigms for stem cells ageing. Nat. Cell Biol. 13 (5), 506-512 (2011).
- Otín, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
- Signer, R. A., Morrison, S. J. Mechanisms that regulate stem cell aging and life span. Cell Stem Cell. 12 (2), 152-165 (2013).
- Iliadi, K. G., Knight, D., Boulianne, G. L. Healthy Aging – Insights from Drosophila. Front. Physiol. 3, 106 (2012).
- Biteau, B., Jasper, H. EGF signaling regulates the proliferation of intestinal stem cells in Drosophila. Development. 138 (6), 1045-1055 (2011).
- Jasper, H., Jones, D. L. Metabolic regulation of stem cell behavior and implications for aging. Cell Metab. 12 (6), 561-565 (2010).
- Biteau, B., Hochmuth, C. E., Jasper, H. Maintaining tissue homeostasis: dynamic control of somatic stem cell activity. Cell Stem Cell. 9 (5), 402-411 (2011).
- Wang, L., Jones, D. L. The effects of aging on stem cell behavior in Drosophila. Exp. Gerontol. 46 (5), 340-344 (2011).
- Lucchetta, E. M., Ohlstein, B. The Drosophila midgut: a model for stem cell driven tissue regeneration. Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 1 (5), 781-788 (2012).
- Ayyaz, A., Jasper, H. Intestinal inflammation and stem cell homeostasis in aging Drosophila melanogaster. Front. Cell Infect. Microbiol. 3 (98), (2013).
- Jiang, H., Patel, P. H., Kohlmaier, A., Grenley, M. O., McEwen, D. G., Edgar, B. A. Cytokine/Jak/Stat Signaling Mediates Regeneration and Homeostasis in the Drosophila Midgut. Cell. 137 (7), 1343-1355 (2009).
- Ohlstein, B., Spradling, A. The adult Drosophila posterior midgut is maintained by pluripotent stem cells. Nature. 439, 470-474 (2006).
- Micchelli, C. A., Perrimon, N. Evidence that stem cells reside in the adult Drosophila midgut epithelium. Nature. 439, 475-479 (2006).
- Ohlstein, B., Spradling, A. Multipotent Drosophila intestinal stem cells specify daughter cell fates by differential notch signaling. Science. 315 (5814), 988-992 (2007).
- Biteau, B., Hochmuth, C. E., Jasper, H. JNK Activity in Somatic Stem Cells Causes Loss of Tissue Homeostasis in the Aging Drosophila Gut. Cell Stem Cell. 3 (4), 442-455 (2008).
- Choi, N. H., Kim, J. G., Yang, D. J., Kim, Y. S., Yoo, M. A. Age-related changes in Drosophila midgut are associated with PVF2, a PDGF/VEGF-like growth factor. Aging Cell. 7, 318-334 (2008).
- Park, J. S., Kim, Y. S., Yoo, M. A. The role of p38b MAPK in age-related modulation of intestinal stem cell proliferation and differentiation in Drosophila. AGING. 1 (7), 637-651 (2009).
- Berger, C., Harzer, H., Burkard, T. R., Steinmann, J., vander Horst, S., Laurenson, A. S., Novatchkova, M., Reichert, H., Knoblich, J. A. FACS purification and transcriptome analysis of Drosophila neural stem cells reveals a role for Klumpfuss in self-renewal. Cell Rep. 2 (2), 407-418 (2012).
- Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing. Nat. Protoc. 8 (6), 1088-1099 (2013).
- Yagi, Y., Hayashi, S. Role of the Drosophila EGF receptor in determination of the dorsoventral domains of escargot expression during primary neurogenesis. Genes Cells. 2 (1), 41-53 (1997).
- Amcheslavsky, A., Ito, N., Jiang, J., Ip, Y. T. Tuberous sclerosis complex and Myc coordinate the growth and division of Drosophila intestinal stem cells. J. Cell Biol. 193 (4), 695-710 (2011).
- Dutta, D., Xiang, J., Edgar, B. A. RNA expression profiling from FACS-isolated cells of the Drosophila intestine. Curr. Protoc. Stem Cell Biol. 13 (27), (2013).
