Introduction
Een onvermijdelijk gevolg van het ouder worden is het afnemende vermogen van weefsels en organen blijven functioneren. Volwassen stamcellen zijn essentieel voor een weefsel homeostase en orgaanfunctie, maar zoals organismen leeftijd, de stamcellen een daling van hun biologisch gedrag ook ervaring. Dit is bijzonder nadelig voor weefsels die een hoge omloopsnelheid hebben, zoals het darmepitheel. Kenmerken van stamcellen leeftijd omvatten genomische schade, verminderde herstelmechanismen, verstoorde regulatie van de celcyclus en misregulated signaalwegen, die allemaal invloed op de normale stamcellen gedrag (beoordeeld in 1-3). Door het manipuleren van specifieke signaalwegen of kloppen vaststelling van specifieke genen, hebben we inzicht gekregen in hun rol in de regulering van en het handhaven van de normale stamcellen gedrag. Aangezien de meeste van deze experimenten zijn kandidaatmolecule benaderingen, we weinig kennis over de endogene moleculaire veranderingen die optreden in stamcellen tijdensveroudering. Een manier om deze vraag te benaderen is het vergelijken van de transcriptome van jong versus oud stamcellen om moleculen waarvan de expressie profiel significant verandert bij het ouder worden te identificeren. Helaas hebben biologische en technische uitdagingen onze vooruitgang met betrekking tot deze aanpak tot nu toe belemmerd.
Drosophila melanogaster is een zeer geschikt modelorganisme veroudering te bestuderen omdat het een korte levensduur (ongeveer 60-70 dagen) en vertoont veroudering fenotypes (beoordeeld in 4). Bovendien kan het verouderingsproces in Drosophila worden versneld door de temperatuur. Wanneer houden de vliegen bij 29 ° C, kan een oude fenotype in het darmweefsel reeds waargenomen na 15 dagen 5. Bovendien Drosophila is vatbaar voor een overvloed van genetische manipulaties. Met name heeft de Drosophila middendarm voren als een uitstekend model systeem om de invloed van verschillende signaalwegen en milieuproblemen op bestuderende biologie van intestinale stamcellen (ISC) tijdens veroudering (beoordeeld in 6-10). De Drosophila darmepitheel heeft een hoge omloopsnelheid en wordt elke twee weken vernieuwd bij vrouwen en ongeveer eens per maand bij mannen 11. ISC's die woonachtig zijn in de Drosophila middendarm hebben de capaciteit om te verdelen en produceren een self-vernieuwde ISC en een post-mitotische progenitorcel genaamd de enteroblast (EB) 12,13. De EB differentieert zich in ofwel een absorberend enterocyt of een secretoire entero-endocriene cel. Tot op heden de enige marker combinatie die ondubbelzinnig etiketten een ISC is de uitdrukking van de transcriptiefactor escargot (ESG) en de Notch ligand Delta (Dl) 14. Echter, dit geldt alleen voor een jonge en gezonde darm. Tijdens veroudering, wordt de middendarm epitheel gekenmerkt door een toename van de ISC proliferatie 15-17. Daarnaast afwijkende Notch signalering verstoort het lot beslissing van ISC dochtercellenen induceert misdifferentiation van EBS 15. Dit resulteert in een accumulatie van cellen die actief Notch signalering en co-express ESG en Dl zijn, waarbij Dl expressie onvoldoende bona fide stamcellen in een ouder middendarm identificeren rendering. De moeilijkheid bij het identificeren waar ISC heeft het vermogen om endogene veranderingen veroudering ISC onderzoeken tot nu belemmerd.
We hebben dit probleem opgelost door gebruik te maken van de ESG -Gal4, UAS-GFP transgene vliegen lijn waarin het niveau van GFP-expressie in ISC's en EVSA is inherent verschillend en blijft gedurende veroudering anders. Een soortgelijke aanpak is beschreven voor de isolatie van larvale neuroblasts en neuronen 18,19. Midguts van jong en oud ESG -Gal4, UAS-GFP vliegen werden ontleed en gedissocieerd in enkele cellen. De cellen werden vervolgens gesorteerd op GFP-positieve cellen met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). Interessant is dat de gesorteerde GFP-positieve cells verdeeld in twee verschillende pieken op basis van GFP fluorescentie-intensiteit (GFP hoog en GFP laag). Bovendien is de verdeling van het GFP-positieve cellen in de twee pieken ook gecorreleerd met celgrootte: de cellen die GFP lage intensiteit vertoonden waren klein en meer korrelvormig terwijl cellen met een hoge GFP intensiteit waren groter en gedetailleerder. Deze waarneming suggereerde dat de kleinere ISCs kunnen worden onderscheiden van de grotere EBS met FACS op basis van GFP intensiteit en kiezen van geschikte voorwaartse verstrooiing (FSC) en zijwaartse verstrooiing (SSC) getoond. Intrigerend bleef de twee pieken duidelijk gescheiden tijdens veroudering. Bovendien is de verhouding van de twee pieken veranderd in de zin dat de bovengenoemde kenmerken van veroudering midguts weerspiegelt namelijk dat het aantal grote, misdifferentiated EBS tijd toeneemt. Uit deze bevindingen concluderen wij dat door het sorteren van GFP-positieve cellen met behulp van de juiste FACS parameterinstellingen kunnen wij verrijken voor ISC's en EVSA's op elk gewenst tijdstip dijdens veroudering.
Samengevat, introduceren we een FACS strategie die onderzoekers in staat stelt om te verrijken voor twee verschillende celpopulaties, ISC's en EBS, van Drosophila midguts van elke leeftijd en isoleren van deze cellen voor verdere analyse, zoals next generation sequencing. Deze krachtige methode maakt het bestuderen van de endogene moleculaire mechanismen die inherent zijn aan veroudering in een verrijkte populatie van stamcellen of progenitor cellen. De uit deze studies gegevens zal ongetwijfeld de identificatie van geconserveerde moleculen die significant veroudering in soorten vergemakkelijken.
Protocol
OPMERKING: Als dit protocol wordt gebruikt voor de eerste keer naar ISC's te isoleren door FAC het sorteren, de volgende controles zijn verplicht om in eerste instantie goed ingesteld de FACS parameters: Gedissocieerde cellen van wild-type (bijv w 1118) Drosophila midguts zonder Sytox. Los cellen van wild-type (bijv w 1118) Drosophila midguts met Sytox (zie stap 3.6). Gedissocieerde cellen van midguts van de ESG -Gal4, UAS-GFP fly lijn zonder Sytox.
1. Bereiding van oplossingen en Gerechten voor Gut Dissection
- Bereid 4-6 flesjes met elk 40 vrouwelijke vliegt van de ESG -Gal4, UAS-GFP vliegen lijn.
- Vanuit 10x PBS-stockoplossing bereiden 500 ml 1x PBS (1,8 mM NaH 2PO 4 · H2O, 8,4 mM Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, 175 mM NaCl, pH aanpassen tot 7,4).
- Bereid een 3,5% Agarose oplossing in 1x PBS (3,5 g agarose elektroforese rang in 100 ml 1 x PBS). Bereid dissectie platen door uitgieten deze oplossing in petrischalen (diameter 8.5 cm) aan de bodem bedekken. De agarose-laag voorkomt schade aan de uiteinden van de tang tijdens de dissectie procedure. Nadat de gel is gestold slaan de dissectie platen bij 4 ° C.
- Maak 300 ml 1x PBS + 1% BSA vers vóór ontleden en plaats de fles op ijs of bij 4 ° C.
- Schakel centrifuge en laat het afkoelen tot 4 ° C.
- Vlam de toppen van 2 glazen pasteurpipetten om de randen glad.
- Schoon twee paar pincetten en een scheermesje met 70% ethanol.
- Plaats vier tot zes 1,5 ml microcentrifugebuisjes voor het verzamelen van ontleed midguts op ijs.
2. Voorbereiding van het maag-darmkanaal en Dissectie van de Midgut
- Verdoven vliegen van de ene flacon (40 vliegen) met CO 2 op een standaard fly bed, onthoofden allevliegt met een scheermesje en overbrengen naar de dissectie gerecht. Giet koud 1x PBS / 1% BSA oplossing in de dissectie schotel naar de agarosegel dekken. De vliegen zal drijven.
- Pak de vlieg achterlijf met een pincet, terwijl de thorax met de andere pincet. Scheid de thorax van de buik. De darm zichtbaar en de voordarm / gewas waarschijnlijk steeds verbonden met de thorax.
- Pak de darm en trek hem uit de thorax. Om de darm te ontvouwen, pak het gewas en trek de darm iets naar voren uit de buurt van de buik.
- Pak het achterste uiteinde van het achterlijf met een pincet en de rand van het anterieur openen cuticula met het andere paar pincetten. Wees voorzichtig dat u de uitstekende darmweefsel te vernietigen. Trek de achterste einde weg naar de cuticula te breken en verder te trekken naar achteren heel voorzichtig totdat de gehele darm is getrokken uit de buikholte. Het gewas moet eventueel vooraf verwijderd worden als het te groot is om te passendoor de lichaamsholte.
- Verwijder de voordarm, Malpighian buisjes, hindgut en eierstokken verlaten van de kale middendarm.
- Met behulp van een glazen Pasteur pipet, breng de batch ontleed midguts naar een 1,5 ml microcentrifugebuis met koud 1x PBS / 1% BSA-oplossing en houdt de buis op ijs. De monsters moeten worden verwerkt binnen 2 uur.
- Na de dissectie van een hele batch is voltooid, spoel de dissectie schotel met dubbel gedestilleerd water om af te wassen overgebleven puin. Start het ontleden van de volgende batch van midguts (Herhaal stappen 2,1-2,7). Ontleden zoveel partijen zo mogelijk binnen 2 uur, ga dan verder met stap 3.1.
3. vertering van het darmweefsel te Harvest Cellen voor FAC sorteren
- Verwijder de 1x PBS / 1% BSA-oplossing uit de midguts en voeg 500 ul 0,5% trypsine-EDTA-oplossing aan elk monster.
- Vortex goed voor 20 sec en incubeer de monsters met zachte wiegen / roteren bij 20 tpm bij kamertemperatuur gedurende 25-30 min.
- Vortex na ongeveer 30 minuten en laat het intacte middendarm weefsel zinken naar de bodem van de buis. Verwijder voorzichtig de cellen die in suspensie met een gevlamd glas Pasteur pipet en filteren ze door een 35 micrometer nylon mesh in een frisse 1,5 ml microcentrifugebuis.
- Draai de cellen af bij 100 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Van de nota, bij het starten van de digest, een cel pellet misschien niet zichtbaar zijn in het begin, maar is zichtbaar als het weefsel digest vordert geworden.
- Breng zorgvuldig de trypsine oplossing terug naar de oorspronkelijke monsterbuisje met het overige intact middendarm weefsel. Vermijden dat te veel cellen van de pellet.
- Voorzichtig resuspendeer de cel pellet in 400 ul van koude 1x PBS / 1% BSA. Houd de microcentrifugebuizen met de gedissocieerde cellen op ijs en dek de buizen met aluminiumfolie om de cellen te beschermen tegen licht.
- Vortex de trypsine oplossing weer met daarin de resterende intacte middendarm weefsel en plaats de monstersop de wip nog 30 min bij kamertemperatuur geroerd.
- Herhaal stap 3.3 3.4.3 totdat alle middendarm weefsel verteerd. Combineer de gedissocieerde cellen van alle microcentrifuge buizen in een microcentrifugebuis. Dit kan een centrifugatiestap zoals in 3.4, aangezien het volume van alle celsuspensies gecombineerd hoogste 1,5 ml nodig. Houd de celsuspensie op ijs en de cellen te beschermen tegen licht.
- Spin de gedissocieerde cellen neer op 100 g gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder voorzichtig zoveel van de bovenstaande vloeistof mogelijk laat ongeveer 50-100 ul van 1x PBS / 1% BSA oplossing in de microcentrifugebuis. Voorzichtig resuspendeer de gedissocieerde cellen in 800 ul 1x PBS / 1% BSA bevat Sytox (1: 20.000).
- Breng de celsuspensie aan een 5 ml ronde bodem Falcon buis door het filteren van de cellen door middel van een cel zeef snap cap (35 micrometer nylon mesh). Houden cel monsters altijd op ijs en beschermd tegen licht. De cellen zijn nu klaar omgesorteerd worden.
- Pipetteer 600 ul van RNAlater oplossing in elke microcentrifugebuis waarin de cellen worden gesorteerd voor daaropvolgende RNA-isolatie. Voor andere toepassingen later de cellen kunnen worden verzameld in een andere oplossing, bijvoorbeeld in steriele PBS.
4. FAC sorteren op Intestinal isoleren van stamcellen
- Schakel de flowcytometrie instrument ten minste één uur voor het sorteren. Zorg ervoor dat het vloeibare systeem vrij is van luchtbellen.
- Kies de 70 micrometer dopmaat om de cellen te injecteren in de beek mantelvloeistof.
- Stel de amplitude van de kern fluïdumstroom zodat het gat komt overeen met de referentiewaarde (6-7, bij gebruik van de 70 urn nozzle). Laat de kern vloeistofstroom te stabiliseren voordat u begint te sorteren.
- Volg deze volgorde om als eerste het instellen van de parameters voor het sorteren:
- Laad de gedissocieerde cellen verkregen uit wild type lef. Stel eerst de FSC en SSC voltagesde cellen plot in het midden van de puntenwolk. Tweede stel de FITC (GFP) spanning zodat alle cellen onder 10 2 uitgezet op de logaritmische x-as. Het instellen van de parameter FITC stelt de limiet voor autofluorescentie.
- Laad de gedissocieerde cellen verkregen van wild-type lef met Sytox toegevoegd. Pas de Pacific Blue spanning en poort te identificeren en gescheiden levende cellen van dode, Sytox-positieve cellen in de Pacific Blue vs. FSC-A scatterplot.
- Laad de gedissocieerde cellen verkregen uit de ESG -Gal4, UAS-GFP vliegen lijn zonder Sytox en stel de FITC spanning om ervoor te zorgen dat alle GFP-positieve cellen worden uitgezet in de scatterplot.
- Laad de gedissocieerde cellen verkregen uit de ESG -Gal4, UAS-GFP vliegen lijn met Sytox toegevoegd. Pas de Pacific Blue spanning en poort te identificeren en gescheiden levende cellen van dode, Sytox-positieve cellen (poort P1).
- Stel het SSC-A en FSC-A poort naar het GFP te identificerenpositieve cellen (gebaseerd op het histogram grondstuk) zoals bepaald door de grootte en granulariteit (poort P2).
- Stel het FSC-H en FSC-W poort naar GFP-positieve cel wambuizen op basis van hun grootte (poort P3) te identificeren en uit te sluiten.
- Stel de SSC-H en de SSC-W poort te identificeren en uit te sluiten GFP-positieve cel wambuizen, gebaseerd op hun granulariteit (poort P4).
- Gebruik poort P4 de GFP-positieve cellen tonen in een histogram grafiek die het aantal cellen (aantal) versus GFP intensiteit toont. Twee verschillende pieken van GFP-positieve cellen zichtbaar. Maak een poort voor elke piek (poorten P5 en P6). Poort P5 bevat de celpopulatie die verrijkt is ISC en kunnen afzonderlijk worden gesorteerd van cellen poort P6.
- Back-poort in een contourgrafiek te controleren of de twee verschillende GFP-positieve celpopulatie bevatten levende cellen (vergelijk poort P1) en cellen van de juiste grootte (vergelijk met poort P2).
- Sorteer de cellen in een 1,5 ml microcentrifugebuis die 600 & # bevat181; l van RNAlater oplossing. Het sorteren gebeurt op een laag debiet (max. 2,0, 70 micrometer mondstuk, 1000 events / sec, 70 psi) en met gebruikmaking van een twee-weg zuiverheid soort.
- Na het sorteren is voltooid, onmiddellijk vortex de gesorteerde cellen kort en houden de microcentrifugebuizen op ijs tot verder gaat met RNA-isolatie of andere downstream-toepassingen.
Representative Results
Voor het verkrijgen van 50.000-100.000 cellen van FAC sorteren, tussen 160 en 200 midguts moeten worden ontleed. Uiteraard is dit de meest tijdrovende stap van de gehele procedure. De in figuur 1A cartoon illustreert de belangrijkste stappen darm dissectie, die worden beschreven in het protocol hier gegeven. Deze procedure kan individueel worden aangepast. Een ontleed, geheel maagdarmkanaal wordt getoond in figuur 1B.
Als alle middendarm weefsel werd gedigereerd onmiddellijk verder met FAC sorteren. Na de gating strategie beschreven in het protocol maakt de succesvolle identificatie en sortering van een celpopulatie verrijkt ISC en EBS van jong (figuur 2) en uit oude midguts (figuur 3). De P1 poort is ingesteld om alleen gezonde levende cellen en om de poort uit dode cellen bevatten. Cellen die plot boven 10 3 op de logaritmische Y-aswordt bij gebruik van de Pacific Blue kanaal worden gedefinieerd als dode cellen. De stippen dat perceel onder 40 op de x-as (FSC-A) veelal vuil en derhalve uitgesloten (Figuur 2A). In de scatter plot van SSC-A versus FSC-A de cellen verdeeld op basis van hun grootte en granulariteit. Voor een optimale resolutie, worden de cellen geplaatst in de puntgrafiek zoals getoond in Figuur 2B door aanpassing van de fotomultiplicatorbuis (PMT) spanning. In de puntgrafieken FSC-H vs. FSC-W en SSC-H vs. SSC-W enkele cellen worden gescheiden van aggregaten en wambuizen op basis van grootte (figuur 2C) en op basis van granulariteit (figuur 2D). Wanneer beeltenis van de cellen opgenomen in de poort P4 in een histogram plot, de duidelijke scheiding van GFP-negatieve, GFP lage (poort P5) en GFP hoog (poort P6) cellen zichtbaar is (figuur 2E). Cellen vertonen lagere GFP intensiteit zijn klein en minder korrelig en vertegenwoordigen ISC. Cellen vertonen een hogere GFP intensity zijn groter en meer granulaire en vertegenwoordigen EBS. Reverse Transcriptase (RT) -PCR voor Dl op cDNA gesynthetiseerd van RNA van cellen van elk GFP-positieve populatie (poorten P5, P6) bleek dat het Dl signaal in de kleinere, GFP laag cellen inderdaad sterker dan in de grotere, GFP high cellen (Figuur 2H). De cellen werden vervolgens backgated en afgebeeld in contourplots om te bevestigen dat de GFP lage (poort P5) en GFP hoog (poort P6) cellen verschillen in grootte en granulariteit (figuur 2F) en nog in leven zijn (figuur 2G). Van de nota, kunnen de twee toppen van GFP-positieve cellen (GFP laag en GFP hoog) alleen mooi te onderscheiden als de FITC (GFP) kanaal is gekalibreerd op de juiste toepassing van de in het protocol beschreven controles.
Dezelfde gating strategie werd gebruikt bij het sorteren van ISC's afgeleid van oude lef (figuur 3). De scatter plots (Figure 3A-D), het histogram (figuur 3E) en de contour plots (figuur 3F, G) zijn analoog aan die aangegeven in figuur 2. Zoals hierboven vermeld, is er geen bonafide marker om ISC in oude midguts dus identificeren geen RT-PCR data wordt hier gepresenteerd. Echter, de intrigerende observatie hierbij is dat de twee pieken met GFP laag (poort P5) of GFP hoog (poort P6) cellen duidelijk gescheiden blijven tijdens veroudering. Bovendien is het aantal cellen in de GFP hoge (poort P6) piek sterk toeneemt tijdens veroudering, die duidelijk emuleert de bekende accumulatie van misdifferentiated EBS met de leeftijd. De verandering in de verhouding van de twee celpopulaties kunnen ook worden gezien in de spreidingsdiagrammen (vergelijk Figuur 3A-D figuur 2A-D) en in de contour plots (vergelijk figuur 3F, G figuur 2F, G). Uit deze resultaten concluderen wij dat door het sorteren van GFP-positieve cellen met behulp van FACS kunnen wij verrijken voor ISC's en EBS in jong en oud midguts.
Om de zuiverheid van de geïsoleerde ISC en EBS valideren, werd een post soort analyse uitgevoerd (figuur 4). Het histogram plots van de post gesorteerd ISC's en EBS (figuur 4B, C) tot uitdrukking zuiverheid tussen 95% en 98%.
Indien de hiërarchie van het instellen van de FACS parameters zoals hierboven beschreven wordt opgevolgd, kunnen de twee verschillende celpopulaties (GFP lage, midden- en hoge GFP, groter) reeds onderscheiden in een scatterplot GFP versus FSC-A (figuur 5A). Deze twee celpopulaties niet te onderscheiden zijn wanneer deze hiërarchie wordt genegeerd (Figuur 5B-D).
Figuur 1: (A) Een schematische weergave van de belangrijkste stappen dissecting de vlieg darm. Eerst wordt de kop verwijderd (verwijdering van de vleugels is optioneel) gevolgd door scheiding van de thorax en de buik tot de darm bloot te leggen. De darm wordt vervolgens bevrijd van de lichaamsholte in de volgende stappen. De zwarte pijlen geven de progressie van de dissectie, terwijl de donkere rode pijlen duiden de trekrichting. De rode lijnen in het laatste beeld te geven van de voorste en achterste grenzen van de middendarm. Een lichtbeeld microscoop van de volwassen vlieg darm (B). De belangrijkste regio's en anatomische kenmerken zijn gelabeld. Rode lijnen markeren de grenzen van de middendarm.
Figuur 2:. FAC sorteren strategie te identificeren en te isoleren ISC en EBS uit jonge (7 dagen) midguts Voor een betere visualisatie, cellen die ISC's zijn gemarkeerd in het rood en cellen vertegenwoordigen EVSA's worden gemarkeerdin blauw in de spreidingsdiagrammen (AD) en in de contour plots (F, G). (A) De P1 poort is ingesteld op dood, Sytox-positieve cellen dan 10 3 uitgezet op de logaritmische Y-as uitgesloten. De drempel van de FSC-A ingesteld op 40 ook sluiten dode cellen en afval. (B) Cellen werden gated FSC-SSC-A en A om cellen te selecteren op grootte en granulariteit (poort P2). Het histogram perceel (E) werd gebruikt in parallel aan de GFP-positieve cellen in de FSC-A vs. SSC-A scatterplot (B) te identificeren. (C, D) De puntgrafieken FSC-H vs. FSC-W en SSC-H vs. SSC-W dienen om aggregaten en wambuizen verwijderen en kies voor singlets (poort P3 in C en poort P4 in D). (E) Het histogram grafiek toont het aantal cellen en hun GFP intensiteit. Twee pieken, GFP lage (poort P5) en GFP hoog (poort P6) kunnen worden onderscheiden. (F, G) Cellen werden back-gated in een contour plot om te controleren of de twee verschillende GFP-positieve cel populationen zijn van de juiste grootte (F) en bevatten levende cellen (G). (H) Reverse Transcriptase (RT) -PCR voor Dl op cDNA gesynthetiseerd van RNA geïsoleerd uit de in de eerste piek (poort P5) cellen en in de tweede piek (poort P6), respectievelijk. Meer Dl expressie kon worden gedetecteerd in de cellen aanwezig in de poort P5 vs. poort P6. Tubuline diende als een laad controle. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: FAC sorteren strategie te identificeren en te isoleren ISC en EBS uit oude (60 dagen) midguts Voor een betere visualisatie, cellen die ISC's zijn gemarkeerd in het rood en cellen vertegenwoordigen EBS zijn blauw gemarkeerd in de puntgrafieken (AD) en in de. contourplots (F, G). (A) De P1 poort is ingesteld op dood, Sytox-positieve cellen dan 10 3 uitgezet op de logaritmische Y-as uitgesloten. De drempel van het FSC-A is vastgesteld op 40 tot ook uitgesloten dode cellen en afval. Van de nota, de leeftijdsafhankelijke toename van de grotere GFP-positieve cellen is al duidelijk in dit complot. (B) cellen werden gated voor FSC-A en SSC-A om cellen te selecteren op basis van de grootte en granulariteit (poort P2). Het histogram perceel (E) werd gebruikt in parallel aan de GFP-positieve cellen in de FSC-A vs. SSC-A scatterplot (B) te identificeren. (C, D) De puntgrafieken FSC-H vs. FSC-W en SSC-H vs. SSC-W dienen om aggregaten en wambuizen verwijderen en kies voor singlets (poort P3 in C en poort P4 in D). (E) Het histogram grafiek toont het aantal cellen en hun GFP intensiteit. Twee pieken, GFP lage (poort P5) en GFP hoog (poort P6) kunnen worden onderscheiden. Van de nota, heeft de cel bevolking GFP hoog met grotere cellen i toegenomenn nummer tijdens veroudering. (F, G) Cellen werden back-gated in een contour plot om te controleren of de twee verschillende GFP-positieve celpopulaties zijn van het juiste formaat (F) en bevatten levende cellen (G). Klik hier om te bekijk een grotere versie van deze figuur.
Figuur 4:. Een post sorteren analyse werd uitgevoerd om de zuiverheid van de geïsoleerde ISC en EBS bepalen (A) GFP-positieve cellen van jonge (7 dagen) en oude (60 dagen) midguts waren FAC gesorteerd en het histogram plots tonen de verdeling in twee pieken op basis van GFP intensiteit. (B) The post sorteren analyse toont de zuiverheid van de geïsoleerde ISC's van jong en oud midguts dat is> 97%. (C) De functie soort analyse van de gesorteerde EB van jong en oud midguts toont een zuiverheid van> 95%. De lichte verontreinigingen kunnen voortvloeien uit fluorescentiedoving of mechanisch beschadigd GFP tot expressie cellen veroorzaakt door het opnieuw sorteren van de cellen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Voorbeelden van puntgrafieken dat suboptimale FACS data, die wordt gezien als de FACS parameters niet juist zijn ingesteld tonen (A) Vertegenwoordiger FACS profiel van alle cellen wanneer de FACS parameters correct zijn ingesteld op basis van de in het protocol beschreven controles.. De celpopulatie met ISC is rood omcirkeld en de celpopulatie met EBS is omcirkeld in blauw. De cellen groen omcirkelde zijn dode cellen die een sterkere autofluorescence hebben in vergelijking metlevende cellen, die hieronder 10 3 worden uitgezet op de logaritmische Y-as. (B) De scatter plot toont een typisch resultaat verkregen wanneer de FACS instrument niet is gekalibreerd. Geen GFP-positieve cellen waargenomen. (C) Als het FSC niet juist is ingesteld, worden de verschillende GFP-positieve celpopulatie niet gedetecteerd. (D) Als het FITC (GFP) kanaal niet juist is afgesteld, de meeste GFP- positieve cellen worden gesorteerd zijn niet in de puntgrafiek maar langs de bovenrand van de grafiek uitgezet. Ook in de hier getoonde plot, de limiet voor autofluorescence werd niet aangepast, vandaar cellen die plot boven de 10 2 op de logaritmische y-as zijn eigenlijk autofluorescente en verward als GFP-positieve cellen zou kunnen zijn.
Discussion
Het gepresenteerde protocol beschrijft een werkwijze voor isoleren ISC van jong en oud volwassen Drosophila midguts, dat vervolgens kan worden gebruikt voor verdere moleculaire technieken zoals next generation sequencing. FAC sortering van de GFP-positieve celpopulatie van de ESG -Gal4, heeft UAS-GFP vliegen lijn al bereikt door verschillende groepen 21,22. Tot nu de aanwezigheid van de twee afzonderlijke pieken van GFP-positieve cellen is hoofd gezien of ondergewaardeerd. We tonen aan dat deze scheiding betekent niet alleen twee verschillende populaties van celtypen (ISC en EBS), maar ook dat de twee pieken van GFP-positieve cellen blijven duidelijk gescheiden tijdens veroudering. Deze waarneming is zeer relevant en waardevol voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het bestuderen van stamcellen of voorlopercellen tijdens veroudering. Isolatie van ISC's uit oude midguts is belemmerd door het feit dat er geen moleculaire marker combinatie met ISC's in een oude middendarm identificeren. De enige marker die unambiguously identificeert ISC's in een oude middendarm is fosfo-histone3 (PH3), omdat ISC's zijn de enige delende cellen in de middendarm 12,13. Echter, PH3 is een ongeschikte marker om ISC's te isoleren omdat het aantal delende stamcellen op een bepaald tijdstip te laag is om een fatsoenlijk bedrag van ISC's te verkrijgen voor verdere analyses. Het vliegen lijn ESG -Gal4, UAS-GFP is de meest voorkomende vliegen lijn gebruikt door onderzoekers die een studie ISC functie, onderhoud en differentiatie. Onze huidige kennis van de moleculaire regeling van ISC homeostase is gebaseerd op studies waarin specifieke moleculen signaalbanen gemanipuleerd (beoordeeld in 7). Vandaar dat we nog steeds geen kennis over de endogene moleculaire veranderingen die optreden tijdens het ouder worden. De hierin beschreven werkwijze sluit deze kloof en is gebaseerd op het feit dat ISCs kunnen worden geïsoleerd op basis van hun grootte, granulariteit en GFP intensiteit van volwassen midguts op enig tijdstip gedurende veroudering.
Terwijlhet opzetten en optimaliseren van deze methode die we hebben gevonden de volgende stappen om van cruciaal belang voor een betrouwbaar resultaat. Ongeveer 200 lef moeten worden ontleed om een goede hoeveelheid ISC krijgen voor FAC sorteren. De snelheid van dissectie cruciaal en afhankelijk praktijk het individu. Een getrainde individu kan 40 lef ontleden binnen 20-30 min. Aangezien GFP ook uitgedrukt in de Malpighian tubuli in de ESG -Gal4, UAS-GFP vliegen lijn, is het essentieel volledig verwijderen Malpighian tubuli van de middendarm. De ontleed midguts moet in een koele omgeving worden gehouden om weefsel degradatie te voorkomen en te verminderen RNAse activiteit in het weefsel. Daarom moet de ontlede midguts worden overgedragen van het ontleden schaal in microcentrifuge buisjes die koud 1x PBS / 1% BSA oplossing na maximaal 20-30 min en op ijs gehouden. De ontleed midguts niet worden voordat het weefsel dissociatie met trypsine op ijs gelaten gedurende meer dan 2 uur. De meest efficient aanpak is om zoveel mogelijk partijen vliegen mogelijk te ontleden binnen deze 2 uur, start de trypsine verteren voor deze partijen. Indien meer midguts nodig, kunnen zij worden ontleed in de incubatietijden van trypsine digestie.
Hoewel trypsine is een zeer potente enzym en nadelige effecten kunnen hebben op cellen, verkregen we nog genoeg levende, gezonde cellen voor daaropvolgende FAC sorteren. De belangrijkste stap van onze procedure maakt de isolatie van intacte cellen die de gedissocieerde cellen verwijderd uit de trypsine oplossing elke 30 minuten. Als ontleed midguts worden gedurende 2 ½ uur in een trypsine bevattende oplossing bij kamertemperatuur een toename van 20-30% in dode, Sytox-positieve cellen waargenomen wij. Hierbij moet worden opgemerkt dat de trypsine oplossing die we gebruiken bevat EDTA. De aanwezigheid van EDTA vergemakkelijkt waarschijnlijk weefsel desintegratie door chelerende calcium- en magnesiumionen nodig voor de goede werking van extracellulaire matrix moleculen. De meest cruciale stappen om met succes soort ISC's van jong en oud lef zijn de juiste oorspronkelijke instellingen van de FACS en gating parameters met behulp van de beschreven controles en het volgen van een specifieke sortering hiërarchie. We voerden de FAC sorteren op een ARIA II doorstroomcytometer (FACSDiva software). Het is belangrijk dat het instrument wordt ingeschakeld ten minste één uur voor het sorteren te warmen de lasers. Van de nota, wanneer FAC sorteren van ISC's wordt uitgevoerd voor de eerste keer, de parameters voor het sorteren en tot schadevergoeding moeten worden ingesteld met behulp van de bovengenoemde controles: (1) los cellen van wild-type (bijv w 1118) Drosophila midguts zonder toevoeging van Sytox - het instellen van deze parameter (stap 4.4.1) voorkomt dat het sorteren van cellen op basis van hun autofluorescence; (2) los cellen van wild-type (bijv w 1118) Drosophila midguts met Sytox toegevoegd - het instellen van deze parameter(Stap 4.4.2) maakt het scheiden dood van levende cellen (dode cellen hebben een hoge autofluorescentie en kan de gesorteerde GFP-positieve cellen besmetten); (3) los cellen uit midguts van de ESG -Gal4, UAS-GFP vliegen lijn zonder Sytox - het instellen van deze parameter (stap 4.4.3) zorgt ervoor dat alle GFP-positieve cellen worden uitgezet in de scatterplot. Als deze parameters niet correct zijn ingesteld, zal de gesorteerde celpopulatie waarschijnlijk dode cellen en afval (Figuur 5B, C), veel GFP-positieve cellen missen (Figuur 5D) en de twee afzonderlijke pieken voor GFP-positieve cellen bevatten gezien in het histogram plot zal (Figuur 2E en figuur 3E) niet worden gedetecteerd. Zodra de FACS en gating parameters zijn ingesteld, wordt het instrument gekalibreerd en klaar om cellen van de ESG -GAL4, UAS-GFP vliegen lijn gekozen afstand. Omdat deze parameters kunnen worden opgeslagen, alle toekomstige sorteren sessies voor ISC's en EVSA van de ESG -GAL4, UAS-GFP vliegen lijn kan beginnen vanaf stap 4.5. Hoewel de keuze van "zuiverheid" -modus en het uitvoeren van een twee-weg zuiverheid sorteren vermindert het aantal cellen gesorteerd, het zorgt voor een hogere sorteren stringentie (stap 4.6 en Figuur 4B, C). Opmerkelijk het voordeel van Sytox plaats propidiumjodide om dode cellen te labelen is dat er slechts een geringe invloed daarvan op de FITC (GFP) kanaal, waardoor het gemakkelijk te compenseren overloop maakt.
Onze werkwijze verrijkend ISC en EBS, respectievelijk gebaseerd op het sorteren van de cellen volgens verschillende GFP expressie. Het kan zijn dat bij veroudering de misdifferentiated EBS ook GFP tot expressie op een lager niveau kan vergissen als ISC. Aangezien de gesorteerde cellen ook verschillen in grootte en granulariteit, geloven we dat onze sorteren strategie is het meest geschikt om deze datum te verrijken ISC EBS. Ook is bekend dat cellen in een verouderende middendarm behouden ISC identiteit een kleine kern 15. Om meer duidelijkheid over de identiteit van de gesorteerde cellen te verkrijgen, kan men cellen van een transgene vlieg lijn die ESG draagt -GAL4, UAS-GFP en een Notch signalering verslaggever transgen afstand. Aangezien Notch is aangetoond actief alleen in de EBS 12,13, ISC geïsoleerd van een jonge middendarm negatief voor de Notch reporter zou zijn, terwijl de EBS positief voor de Notch reporter is. Echter, bij het ouder worden Notch signalering wordt afwijkend in de middendarm weefsel. Derhalve moet worden getest of deze experimentele setup is inderdaad betrouwbaarder onderscheiden ISC en EBS geïsoleerd uit een oude middendarm.
We hebben al in dienst deze aanpak voor een vergelijkende transcriptoom analyse van ISC's van jong en oud midguts en identificeerde een aantal factoren die differentieel gereguleerd tijdens veroudering (unpub. OBSERV.). Bovendien maakt deze werkwijze voor het analyseren van verschillen in genexpressie tussen ISC en EBS. Dergelijk onderzoeks zal inzicht geven in de eerste moleculaire veranderingen die optreden als een cel komt in de differentiatie proces. Ook zal de isolatie van EBS tijdens het ouder worden en de daaropvolgende analyses licht werpen op de moleculaire veranderingen of-age-geïnduceerde misdifferentiation. Bovendien kan deze werkwijze worden gecombineerd met andere genetische instrumenten die in Drosophila bestudering van genfunctie. Samengevat, biedt deze methode een onbevooroordeelde benadering van moleculaire kenmerken en veranderingen van ISC en EBS te onderzoeken tijdens veroudering. Dit is een waardevol instrument dat de verkenning van veroudering mechanismen in volwassen stamcellen en stamcellen zal vergemakkelijken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps: Dumont, Inox Biologie #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| SefarNitex 03-150um/38 (35 µm nylon mesh) | Sefar | 3A03-0150-102-00 | |
| Falcon 5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | |
| Polymax 1040 | Heidolph | 543-42210-00 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma | A4503-50G | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | Trypsin obtained from a different company most likely has a different activity and the duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly. |
| SYTOX Blue Dead Cell Stain for flow cytometry | Life Technologies | S34857 | |
| RNAlater Stabilization Solution | Life Technologies | AM7023 | Other solutions, e.g., Trizol can be used for subsequent RNA isolation |
| FACSAria II cell sorter | Becton Dickinson | Turn on one hour prior to sorting |
References
- Jones, D. L., Rando, T. A. Emerging models and paradigms for stem cells ageing. Nat. Cell Biol. 13 (5), 506-512 (2011).
- Otín, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
- Signer, R. A., Morrison, S. J. Mechanisms that regulate stem cell aging and life span. Cell Stem Cell. 12 (2), 152-165 (2013).
- Iliadi, K. G., Knight, D., Boulianne, G. L. Healthy Aging – Insights from Drosophila. Front. Physiol. 3, 106 (2012).
- Biteau, B., Jasper, H. EGF signaling regulates the proliferation of intestinal stem cells in Drosophila. Development. 138 (6), 1045-1055 (2011).
- Jasper, H., Jones, D. L. Metabolic regulation of stem cell behavior and implications for aging. Cell Metab. 12 (6), 561-565 (2010).
- Biteau, B., Hochmuth, C. E., Jasper, H. Maintaining tissue homeostasis: dynamic control of somatic stem cell activity. Cell Stem Cell. 9 (5), 402-411 (2011).
- Wang, L., Jones, D. L. The effects of aging on stem cell behavior in Drosophila. Exp. Gerontol. 46 (5), 340-344 (2011).
- Lucchetta, E. M., Ohlstein, B. The Drosophila midgut: a model for stem cell driven tissue regeneration. Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 1 (5), 781-788 (2012).
- Ayyaz, A., Jasper, H. Intestinal inflammation and stem cell homeostasis in aging Drosophila melanogaster. Front. Cell Infect. Microbiol. 3 (98), (2013).
- Jiang, H., Patel, P. H., Kohlmaier, A., Grenley, M. O., McEwen, D. G., Edgar, B. A. Cytokine/Jak/Stat Signaling Mediates Regeneration and Homeostasis in the Drosophila Midgut. Cell. 137 (7), 1343-1355 (2009).
- Ohlstein, B., Spradling, A. The adult Drosophila posterior midgut is maintained by pluripotent stem cells. Nature. 439, 470-474 (2006).
- Micchelli, C. A., Perrimon, N. Evidence that stem cells reside in the adult Drosophila midgut epithelium. Nature. 439, 475-479 (2006).
- Ohlstein, B., Spradling, A. Multipotent Drosophila intestinal stem cells specify daughter cell fates by differential notch signaling. Science. 315 (5814), 988-992 (2007).
- Biteau, B., Hochmuth, C. E., Jasper, H. JNK Activity in Somatic Stem Cells Causes Loss of Tissue Homeostasis in the Aging Drosophila Gut. Cell Stem Cell. 3 (4), 442-455 (2008).
- Choi, N. H., Kim, J. G., Yang, D. J., Kim, Y. S., Yoo, M. A. Age-related changes in Drosophila midgut are associated with PVF2, a PDGF/VEGF-like growth factor. Aging Cell. 7, 318-334 (2008).
- Park, J. S., Kim, Y. S., Yoo, M. A. The role of p38b MAPK in age-related modulation of intestinal stem cell proliferation and differentiation in Drosophila. AGING. 1 (7), 637-651 (2009).
- Berger, C., Harzer, H., Burkard, T. R., Steinmann, J., vander Horst, S., Laurenson, A. S., Novatchkova, M., Reichert, H., Knoblich, J. A. FACS purification and transcriptome analysis of Drosophila neural stem cells reveals a role for Klumpfuss in self-renewal. Cell Rep. 2 (2), 407-418 (2012).
- Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing. Nat. Protoc. 8 (6), 1088-1099 (2013).
- Yagi, Y., Hayashi, S. Role of the Drosophila EGF receptor in determination of the dorsoventral domains of escargot expression during primary neurogenesis. Genes Cells. 2 (1), 41-53 (1997).
- Amcheslavsky, A., Ito, N., Jiang, J., Ip, Y. T. Tuberous sclerosis complex and Myc coordinate the growth and division of Drosophila intestinal stem cells. J. Cell Biol. 193 (4), 695-710 (2011).
- Dutta, D., Xiang, J., Edgar, B. A. RNA expression profiling from FACS-isolated cells of the Drosophila intestine. Curr. Protoc. Stem Cell Biol. 13 (27), (2013).
