Introduction
En oundviklig konsekvens av att åldras är den minskande förmåga vävnader och organ att förbli funktionella. Adulta stamceller är avgörande för att upprätthålla vävnads homeostas och organfunktioner, men som organismer ålder, stamcellerna upplever också en nedgång i deras biologiska beteende. Detta är särskilt skadligt för vävnader som har en hög omsättningshastighet, såsom tarmepitelet. Kännetecken för åldrade stamceller inkluderar genomisk skador, osäkra mekanismer reparation, nedsatt cellcykelreglering och misregulated signalvägar, som alla påverkar normala stamceller beteende (över i 1-3). Genom att manipulera specifika signalvägar eller knacka ner specifika gener, har vi fått insikt i sina roller i regleringen och upprätthålla normal stamcellsbeteende. Eftersom de flesta av dessa experiment är kandidatmolekyl tillvägagångssätt har vi mycket lite kunskap om de endogena molekylära förändringar som sker i stamceller underåldrande. Ett sätt att närma sig denna fråga är att jämföra transkriptom av unga kontra gamla stamceller för att identifiera molekyler vars uttrycksprofilen förändras väsentligt under åldrandet. Tyvärr har biologiska och tekniska utmaningar hämmas våra framsteg beträffande detta tillvägagångssätt hittills.
Drosophila melanogaster är en mycket lämplig modellorganism för att studera åldrandet eftersom den har en kort livslängd (ca 60-70 dagar) och uppvisar åldrande fenotyper (över i 4). Vidare kan åldrandeprocessen i Drosophila accelereras genom temperaturen. När hålla flugorna vid 29 ° C, kan redan observeras en åldrig fenotyp i tarmvävnaden efter 15 dagar 5. Dessutom är Drosophila mottaglig för en uppsjö av genetiska manipulationer. I synnerhet har Drosophila midgut vuxit fram som ett utmärkt modellsystem för att studera inverkan av olika signalvägar och miljömässiga utmaningar påbiologi tarm stamceller (ISCs) under åldrandet (över i 6-10). Drosophila tarmepitel har en hög omsättningshastighet och förnyas varannan vecka hos kvinnor och ungefär en gång i månaden hos män 11. ISCs bosatt i Drosophila midgut har kapacitet att dela sig och producera en själv förnyad ISC och en post-mitotiska stamceller kallas enteroblast (EB) 12,13. EB skiljer till antingen en absorberande enterocyten eller en sekretorisk enteroendocrine cell. Till detta datum är den enda markör kombination som entydigt märker en ISC uttrycket av transkriptionsfaktorn escargot (ESG) och Notch-liganden Delta (Dl) 14. Men bara gäller detta för en ung och frisk tarm. Under åldrandet, är midgut epitel kännetecknas av en ökning av ISC proliferation 15-17. Dessutom stör avvikande Notch-signalering öde beslut ISC dottercelleroch inducerar misdifferentiation EBS 15. Detta resulterar i en ansamling av celler som är aktiva för Notch-signalering och co-express ESG och Dl och därigenom gör Dl uttryck otillräcklig för att identifiera bona fide stamceller i en åldrig midgut. Svårigheten i att identifiera sanna ISCs har hindrat möjligheten att undersöka endogena förändringar i åldrande ISCs förrän nu.
Vi har tacklat det här problemet genom att dra nytta av ESG -Gal4, UAS-GFP transgen lina där nivån av GFP uttryck i ISCs och EB är annorlunda och förblir annorlunda hela åldrandet. Ett liknande tillvägagångssätt har beskrivits för isolering av larvneuroblaster och nervceller 18,19. Midguts av unga och gamla ESG -Gal4, UAS-GFP flugor dissekerades och dissocieras till enskilda celler. Cellerna sorteras sedan för GFP-positiva celler med användning av fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). Intressant, sorterade GFP-positiva calnar fördelade i två distinkta toppar baserade på GFP-fluorescensintensiteten (GFP hög och GFP låg). Dessutom fördelningen av GFP-positiva celler i de två topparna också korrelerade med cellstorlek: cellerna som uppvisade låg GFP intensitet var små och mindre kornig medan celler med hög GFP intensitet var större och mer granulär. Denna observation antydde att de mindre ISCs kunde särskiljas från de större EBS med FACS baserade på GFP intensitet och väljer lämplig framåtspridning (FSC) och sidospridning (SSC) inställningar. Fängslande, förblev de två topparna tydligt avskilt under åldrandet. Dessutom är förhållandet mellan de två topparna förändrats på ett sätt som återspeglar de ovan nämnda kännetecknen för åldrande midguts: nämligen att antalet stora, misdifferentiated EBS ökar över tiden. Från dessa resultat drar vi slutsatsen att vi genom att sortera efter GFP-positiva celler genom att använda lämpliga parameterinställningar FACS kan anrika ISCs och EB som helst led dnder åldrande.
Sammanfattningsvis vi införa en FACS strategi som möjliggör för forskare att berika för två olika cellpopulationer, ISCs och EBS, från Drosophila midguts i alla åldrar och isolera dessa celler för vidare analys, till exempel nästa generations sekvensering. Denna kraftfulla metoden tillåter att studera de endogena molekylära mekanismer som är förbundna med åldrandet i en berikad population av stamceller eller progenitorceller. Data som erhållits från dessa studier kommer otvivelaktigt att underlätta identifieringen av konserverade molekyler som är betydande i åldrandet över arter.
Protocol
OBS: Om detta protokoll används för första gången att isolera ISCs från FAC sortering, följande kontroller är obligatoriska för att initialt ställa in FACS parametrarna korrekt: Dissocierade celler från vildtypen (t.ex. w 1118) Drosophila midguts utan Sytox. Dissocierade celler från vildtypen (t.ex. w 1118) Drosophila midguts med Sytox (se steg 3.6). Dissocierade celler från midguts av ESG -Gal4, UAS-GFP fluglina utan Sytox.
1. Beredning av lösningar och Porslin för Gut Dissection
- Förbered 4-6 injektionsflaskor innehållande 40 hona flyger från ESG -Gal4, UAS-GFP fluglina.
- Från en 10x PBS utgångslösning bereds 500 ml 1 x PBS (1,8 mM NaH 2 PO 4 • H2O, 8,4 mM Na 2 HPO 4 • 2 H2O, 175 mM NaCl, justera pH till 7,4).
- Förbered en 3,5% Agaroslösning i 1x PBS (3,5 g elektroforeskvalitet agaros i 100 ml 1 x PBS). Förbered dissektion plattor genom att hälla denna lösning i petriskålar (diameter 8,5 cm) för att täcka botten. Agarosen lagret förhindrar skada tips av pincetten under dissektion förfarandet. Efter det att gelén har stelnat lagra dissektion plattorna vid 4 ° C.
- Bered 300 ml 1x PBS + 1% BSA färska innan dissekera och placera flaskan på is eller vid 4 ° C.
- Slå på centrifug och låt den svalna till 4 ° C.
- Flamma tips av 2 glas Pasteur pipetter att utjämna kanterna.
- Rena två par av pincett och en rakblad med 70% etanol.
- Placera 05:56 1,5 ml mikrorör för insamling dissekerade midguts på is.
2. Beredning av mag-tarmkanalen och Dissekering av midgut
- Söva flugor från en injektionsflaska (40 flugor) med CO2 på en vanlig fluga säng, halshugga allaflugor med ett rakblad och överföra dem till dissekering skålen. Häll kallt 1x PBS / 1% BSA lösningen i dissektion skålen för att täcka agarosgelen. Flugorna kommer att flyta.
- Ta flugan buken med en pincett, medan du håller bröstkorgen med den andra pincett. Separera torax från buken. Tarmen kommer att synas och tarmen / grödan kommer sannolikt fortfarande vara ansluten till bröstkorgen.
- Ta tarmen och dra ut den ur thorax. För att fälla tarmen, ta tag i grödan och dra tarmen något anteriort bort från buken.
- Ta den bakre änden av buken med en pincett och kanten på den anteriort öppna ytterhud med den andra pincett. Var noga med att inte förstöra den utskjutande tarmvävnad. Dra den bakre änden bort att bryta nagelbanden och fortsätta dra posteriort mycket försiktigt tills hela tarmen har dragits ut ur bukhålan. Grödan kan behöva avlägsnas i förväg, om den är för stor för att passagenom kroppshåligheten.
- Avlägsna tarmen, Malpighian tubuli, hindgut och äggstockar lämnar kala midgut.
- Med hjälp av ett glas pasteurpipett, överföra sats av dissekerade midguts till en 1,5 ml mikrocentrifugrör innehållande kallt 1x PBS / 1% BSA-lösning och hålla röret på is. Proverna måste bearbetas inom 2 timmar.
- Efter dissektion av en hel sats är klar, skölj dissektion skålen med dubbla destillerat vatten för att tvätta bort vänster över skräp. Börja dissekera nästa omgång midguts (upprepa steg 2,1-2,7). Dissekera så många partier som möjligt inom 2 timmar, sedan vidare till steg 3.1.
3. Nedbrytning av Gut Tissue till Harvest Celler för FAC Sortering
- Avlägsna 1 x PBS / 1% BSA-lösning från midguts och tillsätt 500 pl av 0,5% trypsin-EDTA-lösning till varje prov.
- Vortex väl för 20 sek och inkubera proverna med försiktig skakning / roterande med 20 varv per minut vid rumstemperatur under 25-30 min.
- Vortex igen efter ca 30 minuter och låt den intakta midgut vävnad sjunka till botten av röret. Ta försiktigt bort de celler som är i suspension med en flammade glas pasteurpipett och filtrera dem genom en 35 um nylonnät i en ny 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Snurra cellerna ner vid 100 xg under 5 min vid 4 ° C. Notera, när man startar digest, ett cellpellet kanske inte syns i början men blir synlig som vävnaden digest skrider.
- Försiktigt överföra Trypsinlösningen tillbaka till den ursprungliga provröret innehållande återstående intakta midgut vävnad. Undvik att överföra för många celler från pelleten.
- Försiktigt återsuspendera cellpelleten i 400 | il kall 1 x PBS / 1% BSA. Håll mikrocentrifugrör innehållande dissocierade celler på is och täcka rören med aluminiumfolie för att skydda cellerna från ljus.
- Vortex Trypsinlösningen innehåller återstående intakta midgut vävnad igen och placera provernapå vipparmen under ytterligare 30 min vid rumstemperatur.
- Upprepa steg 3,3 till 3.4.3 tills allt midgut vävnad har digererats. Kombinera de dissocierade cellerna från alla mikrocentrifugrör i en mikrocentrifugrör. Detta kan kräva ett centrifugeringssteg enligt 3.4, eftersom volymen av alla upphävanden cell kombinerat får överstiga 1,5 ml. Håll cellsuspensionen på is och skydda cellerna från ljus.
- Snurra de dissocierade cellerna ner vid 100 xg under 5 min vid 4 ° C. Ta försiktigt bort så mycket av supernatanten som möjligt lämnar ungefär 50-100 | il av 1 x PBS / 1% BSA-lösning i mikrocentrifugrör. Resuspendera försiktigt dissocierade celler i 800 pl 1x PBS / 1% BSA innehållande Sytox (1: 20.000).
- Överför cellsuspensionen till en 5 ml rundbottnad Falcon rör genom att filtrera cellerna genom ett cellfilter snäpplock (35 | im nylonnät). Ha alltid cellprover på is och skyddas från ljus. Cellerna är nu redo attsortering.
- Pipettera 600 l av RNAlater lösning i varje mikrocentrifugrör i vilken cellerna kommer att sorteras för efterföljande RNA isolering. För andra tillämpningar nedströms cellerna kan samlas upp i en annan lösning, till exempel i steril PBS.
4. FAC Sortering att Isolera Tarm stamceller
- Slå på flödescytometri instrumentet minst en timme före sortering. Kontrollera att fluidsystemet är fritt från luftbubblor.
- Välj den 70 ^ m munstycksstorlek att injicera cellerna i manteln fluidströmmen.
- Justera amplituden av kärnan fluidströmmen så att spalten värde motsvarar referensvärdet (6-7, vid användning av 70 | j, m munstycke). Låt kärnfluidströmmen stabiliseras innan du börjar sortera.
- Följ denna ordning när initialt ställa in parametrarna för sortering:
- Ladda dissocierade celler från vild typ inälvor. Först justera FSC och SSC spänningaratt plotta celler i mitten av spridningsdiagram. För det andra, justera FITC (GFP) spänning så att alla celler plottas nedan 10 2 på logaritmisk x-axeln. Ställa FITC parametern sätter gränsen för autofluorescens.
- Ladda dissocierade celler från vildtyp tarmar med Sytox lagt. Justera Pacific Blue spänningsvärde och grind för att identifiera och separera levande celler från döda, Sytox-positiva celler i Pacific Blue vs. FSC-A punktdiagram.
- Ladda dissocierade celler erhållna från ESG -Gal4, UAS-GFP fluglina utan Sytox och justera FITC spänning för att se till att alla GFP-positiva celler plottas i punktdiagrammet.
- Ladda dissocierade celler erhållna från ESG -Gal4, UAS-GFP fluglina med Sytox lagt. Justera Pacific Blue spänningsvärde och grind för att identifiera och separera levande celler från döda, Sytox-positiva celler (gate P1).
- Ställ SSC-A och FSC-En grind för att identifiera GFP-positiva celler (baserat på histogrammet tomten) som bestäms av storlek och granularitet (gate P2).
- Ställ FSC-H och FSC-W grind för att identifiera och utesluta GFP-positiva celler dubbletter baserat på deras storlek (gate P3).
- Ställ SSC-H och SSC-W grind för att identifiera och utesluta GFP-positiva celler dubbletter baserat på deras kornighet (gate P4).
- Använd grinden P4 att skildra de GFP-positiva celler i ett histogram plot som visar antalet celler (räkna) vs. GFP intensitet. Två distinkta toppar av GFP-positiva celler kommer att vara synlig. Skapa en grind för varje topp (grindar P5 och P6). Gate P5 innehåller cellpopulation som är berikad för ISCs och kan sorteras separat från cellerna i grind P6.
- Back-grind i ett konturdiagram för att kontrollera att de två distinkta GFP-positiva cellpopulationer innehåller levande celler (jämför med grind P1) och celler av rätt storlek (jämför med grind P2).
- Sortera cellerna i en 1,5 ml mikrocentrifugrör som innehåller 600 & #181; l RNAlater lösning. Sorteringen sker vid en låg flödeshastighet (max. 2,0, 70 ìm munstycke, 1000 händelser / sek, 70 psi) och anställa en tvåvägs renhet slag.
- Efter sortering är klar omedelbart virvel de sorterade cellerna kort och hålla mikrocentrifugrör på is tills vidare med RNA isolering eller andra program nedströms.
Representative Results
För att erhålla mellan 50,000-100,000 celler från FAC sortering, mellan 160 och 200 midguts måste dissekeras. Uppenbarligen är detta den mest tidskrävande steget i hela förfarandet. Den tecknade visas i Figur 1A illustrerar de viktigaste stegen i tarmen dissektion, som beskrivs i detalj i protokollet ges här. Detta förfarande kan individuellt modifieras. En dissekeras, hel magtarmkanalen visas i figur 1B.
När alla midgut vävnad har smält, genast fortsätta med FAC sortering. Efter gating strategi beskrivs i protokollet möjliggör framgångsrik identifiering och sortering av en cellpopulation berikad för ISCs och för EBS från unga (Figur 2) och från gamla midguts (Figur 3). P1 grinden är inställd på att inkludera endast friska levande celler och till grinden ut döda celler. Celler som plottar över 10 3 på den logaritmiska y-axär när du använder Pacific Blue kanalen definieras som döda celler. Prickarna som tomt under 40 på x-axeln (FSC-A) är mestadels skräp och därför är också uteslutna (Figur 2A). I punktdiagram av SSC-A kontra FSC-A cellerna fördelas baserat på deras storlek och granularitet. För en optimal upplösning, är cellerna placerade i spridningsdiagrammet som visas i fig 2B genom att justera fotomultiplikatorrör (PMT) spänning. I scatter tomter FSC-H vs. FSC-W och SSC-H mot SSC-W enstaka celler är separerade från aggregat och dubbletter baserat på storlek (figur 2C) och bygger på kornighet (figur 2D). När skil cellerna ingår i grind P4 i ett histogram tomt, den distinkta separationen av GFP-negativa, GFP låg (gate P5) och GFP höga (gate P6) celler är synlig (Figur 2E). Celler som uppvisar lägre GFP intensitet är små och mindre kornig och representerar ISCs. Celler som uppvisar högre GFP intensity är större och mer detaljerad och representerar EBS. Omvänt transkriptas (RT) -PCR för Dl på cDNA syntetiserat från RNA av celler av varje GFP-positiva populationen (grindar P5, P6) avslöjade att DL-signalen är faktiskt starkare i de mindre, GFP låga celler än i de större, GFP hög celler (Figur 2H). Cellerna backgated och avbildas i kontur tomter att bekräfta att GFP låg (gate P5) och GFP hög (gate P6) celler skiljer sig i storlek och granularitet (Figur 2F) och är fortfarande vid liv (figur 2G). Notera kan de två topparna av GFP-positiva celler (GFP låg och GFP högt) endast snyggt särskiljas om FITC (GFP) kanal har kalibrerats på rätt sätt med de kontroller som anges i protokollet.
Samma gating strategi användes vid sortering ISCs härrör från gamla tarmar (Figur 3). Scatter tomter (figure 3A-D), histogrammet (figur 3E) och kontur plottningar (figur 3F, G) är analoga med de som visas i figur 2. Såsom nämnts ovan, finns det inget bona fide markör för att identifiera ISCs i gamla midguts och därför ingen RT-PCR data presenteras här. Men den spännande observation här att de två topparna innehållande GFP låg (gate P5) eller GFP höga (gate P6) celler förblir tydligt avskilt under åldrandet. Vidare ökar antalet celler i GFP hög (grind P6) topp avsevärt under åldring, vilket tydligt emulerar kända ackumulering av misdifferentiated EBS med åldern. Förändringen i förhållandet mellan de två cellpopulationer kan också ses i de spridningsdiagram (jämför figur 3A-D med fig 2A-D) och i kontur plottningar (jämför figur 3F, G med figur 2F, G). Från dessa resultat kan man konstatera att genom att sortera efter GFP-positiva celler med FACS kan vi berika för ISCs och EB i unga och gamla midguts.
För att bekräfta renheten hos den isolerade ISCs och EBS, var en eftersorteringsanalys (figur 4). Histogrammet tomter av den efter sorteras ISCs och EBS (figur 4B, C) avbildar renheter mellan 95% och 98%.
Om hierarki inställning av FACS parametrarna som beskrivs ovan är strängt följs, kan de två olika cellpopulationer (GFP låg, liten och GFP hög, större) redan urskiljas i ett punktdiagram GFP vs FSC-A (Figur 5A). Dessa två cellpopulationer inte kan skiljas åt om denna hierarki inte beaktas (figur 5B-D).
Figur 1: (A) En schematisk bild av de viktigaste stegen i dissecting flugan tarmen. Först huvudet har avlägsnats (avlägsnande av vingarna är valfritt) följt av en separation av bröstkorgen och buken för att exponera tarmen. Tarmen därefter befrias från kroppshåligheten i följande steg. De svarta pilarna visar fortskridandet av dissektion, medan de mörka röda pilarna betecknar dragriktningen. De röda linjerna i den sista bilden visar de främre och bakre gränser midgut. (B) En ljusmikroskop bild av den vuxna flugan tarmen. De viktigaste områdena och anatomiska funktioner är märkta. Röda linjer markerar gränserna för midgut.
Figur 2:. FAC sortering strategi att identifiera och isolera ISCs och EB från unga (7 dagar) midguts För bättre visualisering, celler som representerar ISCs är markerade i rött och celler som representerar EB är markeradei blått i spridningsdiagram (AD) och kontur tomter (F, G). (A) Den P1 grinden är inställd på att utesluta döda, Sytox-positiva celler plottas över 10 3 på den logaritmiska y-axeln. Tröskeln för FSC-A är satt till 40 för att även utesluta döda celler och skräp. (B) Celler gated för FSC-A och SSC-A för att markera celler enligt storlek och granularitet (gate P2). Histogrammet tomten (E) användes parallellt för att identifiera GFP-positiva celler i FSC-A mot SSC-A punktdiagram (B). (C, D) De scatter tomter FSC-H kontra FSC-W och SSC-H mot SSC-W tjäna till att avlägsna aggregat och dubbletter och välj efter sing (gate P3 i C och grind P4 i D). (E) Histogrammet tomten visar antalet celler och deras GFP intensitet. Två toppar, GFP låg (grind P5) och GFP hög (grind P6) kan urskiljas. (F, G) Celler tillbakaextraherades gated i en konturkurva för att verifiera att de två distinkta GFP-positiv cell populatjoner är av den korrekta storleken (F) och innehåller levande celler (G). (H) omvänt transkriptas (RT) -PCR för Dl på cDNA syntetiserat från RNA isolerat från cellerna som är närvarande i den första toppen (grind P5) och i andra toppen (gate P6), respektive. Mer Dl uttryck kunde detekteras i celler som finns i grind P5 vs. gate P6. Tubulin tjänade som laststyrning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: FAC sortering strategi för att identifiera och isolera ISCs och EB från gamla (60 dagar) midguts För bättre visualisering, celler som representerar ISCs är markerade i rött och celler som representerar EB är markerade i blått i scatter tomter (AD) och i. konturdiagram (F, G). (A) P1-grinden är inställd på att utesluta döda, Sytox-positiva celler uppritade ovan 10 3 på logaritmisk y-axeln. Tröskeln för FSC-A är satt till 40 för att även utesluta döda celler och skräp. Att notera är åldersberoende ökning i större GFP-positiva celler som redan tydligt i denna sammansvärjning. (B) Celler gated för FSC-A och SSC-A för att markera celler enligt storlek och granularitet (gate P2). Histogrammet tomten (E) användes parallellt för att identifiera GFP-positiva celler i FSC-A mot SSC-A punktdiagram (B). (C, D) De scatter tomter FSC-H kontra FSC-W och SSC-H mot SSC-W tjäna till att avlägsna aggregat och dubbletter och välj efter sing (gate P3 i C och grind P4 i D). (E) Histogrammet tomten visar antalet celler och deras GFP intensitet. Två toppar, GFP låg (grind P5) och GFP hög (grind P6) kan urskiljas. Att notera, har cellpopulationen GFP hög innehåller större celler ökade in antal under åldrandet. (F, G) Celler var tillbaka-gated i en kontur komplott för att kontrollera att de två distinkta GFP-positiva cellpopulationer är av rätt storlek (F) och innehåller levande celler (G). Klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4:. En postsorteringsanalys utfördes för att bestämma renheten hos den isolerade ISCs och EB (A) GFP-positiva celler från unga (7 dagar) och gamla (60 dagar) midguts var FAC sorteras och histogrammet tomter visar deras fördelning in två toppar baserade på GFP intensitet. (B) Den postsorterings analys visar renheten av de isolerade ISCs från unga och gamla midguts vilket är> 97%. (C) Den postsorteringsanalys av sorterad EB från unga och gamla midguts visar en renhet av> 95%. De smärre föroreningar kan härröra från fluorescensquenchning eller mekaniskt skadade GFP uttryckande celler som orsakas av åter sortera cellerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Exempel på scatter tomter som visar suboptimala FACS data, vilket ses när FACS parametrarna inte korrekt inställd (A) representant FACS profilen för alla celler när FACS parametrar korrekt inställd på grundval av de kontroller som beskrivs i protokollet.. Cellpopulationen innehåller ISCs är inringad i rött och cellpopulationen innehåller EBS inringat i blått. Cellerna inringade i grönt är döda celler som har en starkare autofluorescens jämfört medlevande celler, vilka är ritade under 10 tre på logaritmisk y-axeln. (B) Den spridningsdiagram visar ett typiskt resultat erhålles när FACS instrumentet inte kalibrerades. Inga GFP-positiva celler upptäcks. (C) Om FSC inte är korrekt inställd, är de olika GFP-positiva cellpopulationer inte upptäcks. (D) Om FITC (GFP) kanalen inte är korrekt inställd, majoriteten av GFP- positiva celler som ska sorteras plottas inte i spridningsdiagrammet utan snarare utmed den övre kanten av tomten. Också i komplotten som visas här, gränsen för autofluorescens justerades inte, varför celler som plot över 10 2 på logaritmiska y-axeln är faktiskt autofluorescent och kan misstas som GFP-positiva celler.
Discussion
Den presenterade protokoll beskriver en metod för att isolera ISCs från unga och gamla vuxna Drosophila midguts, som sedan kan användas för ytterligare molekylära analyser som nästa generations sekvensering. FAC sortering av GFP-positiva cellpopulation från ESG -Gal4 har UAS-GFP fluglina redan uppnåtts av flera grupper 21,22. Men fram tills nu förekomsten av de två distinkta toppar i GFP-positiva celler har antingen förbises eller undervärderad. Vi visar att denna separation inte bara representerar två olika populationer av celltyper (ISCs och EBS), men också att de två topparna av GFP-positiva celler stanna distinkt separat under åldrandet. Denna observation är mycket relevant och värdefull för forskare som är intresserade av att studera stamceller eller progenitorceller under åldrandet. Isolering av ISCs från gamla midguts har hindrats av det faktum att det inte finns någon molekylär markör kombination för att identifiera ISCs i en åldrig midgut. Den enda markör som unambiguously identifierar ISCs i en gammal midgut är fosfor-histone3 (PH3), eftersom ISCs är de enda delande celler i midgut 12,13. Dock är PH3 ett olämpligt markör för att isolera ISCs eftersom antalet dela stamceller vid varje given tidpunkt är för låg för att få en anständig mängd ISCs för efterföljande analyser. Fluglinan ESG -Gal4, UAS-GFP är den vanligaste linan som används av forskare som studerar ISC-funktion, underhåll och differentiering. Vår nuvarande kunskap på molekylär reglering av ISCs homeostas är baserad på studier där specifika molekyler och signalvägar har manipulerats (över i 7). Därför saknas fortfarande kunskap om de endogena molekylära förändringar som sker under åldrandet. Den häri beskrivna metoden stänger detta gap och är baserad på det faktum att ISCs kan isoleras baserat på deras storlek, granularitet och GFP intensitet från vuxna midguts vid någon tidpunkt under åldrande.
Medanupprättande och optimera denna metod som vi har hittat följande steg för att vara avgörande för en pålitlig utfall. Cirka 200 tarmar måste dissekeras för att erhålla en bra mängd ISCs för FAC sortering. Hastigheten på dissektion är avgörande och beror på individens praxis. En utbildad person kan dissekera 40 tarmar inom 20-30 min. Eftersom GFP uttrycks också i de Malpighian tubuli i ESG -Gal4, är det UAS-GFP fluglina viktigt att helt ta bort de Malpighian tubuli från midgut. De dissekerade midguts måste förvaras i en sval miljö för att undvika vävnadsnedbrytning och minska RNAs aktiviteten i vävnaden. Därför måste de dissekerade midguts överföras från dissekera skålen i mikrocentrifugrör innehållande kallt 1x PBS / 1% BSA lösning efter max 20-30 min och hålls på is. Dock bör de dissekerade midguts inte lämnas på is i mer än 2 timmar innan vävnadsdissociering med trypsin. Den mest efficient tillvägagångssätt är att dissekera så många partier av flugor som möjligt inom dessa 2 timmar, sedan starta trypsin smälta för dessa partier. Om fler midguts behövs, kan de dissekerade under inkubationstider på trypsin digerering.
Även trypsin är en mycket potent enzym och kan ha skadliga effekter på celler, vi fortfarande erhållas tillräckligt levande, friska celler för efterföljande FAC sortering. Nyckelsteget i vårt förfarande som medger isolering av intakta celler är att de dissocierade cellerna avlägsnas från trypsinlösning varje 30 min. Om de dissekerade midguts inkuberas under 2 ½ timme i en trypsin innehållande lösning vid rumstemperatur, observerade vi en ökning av döda, Sytox-positiva celler 20-30%. Det bör påpekas att trypsin lösningen vi använder innehåller EDTA. Närvaron av EDTA underlättar förmodligen vävnad sönderfall genom kelaterande kalcium- och magnesiumjoner som behövs för en korrekt funktion av extracellulära matrixmolekyler. De mest avgörande steg för att lyckas sortera ISCs från unga och gamla tarmar är lämpliga grundinställningar av FACS och grind parametrar med de beskrivna kontrollerna och efter en viss sorterings hierarki. Vi utförde FAC sortering på en ARIA II flödescytometer (FACSDiva programvara). Det är viktigt att instrumentet slås på minst en timme före sortering för att värma upp lasrarna. Notera, när FAC sortering av ISCs utförs för första gången, de parametrar för sortering och för ersättning måste fastställas med hjälp av de tidigare nämnda kontrollerna: (1) dissocierade celler från vildtypen (t.ex. w 1118) Drosophila midguts utan tillsats av Sytox - ställa in den här parametern (steg 4.4.1) förhindrar sorterings celler baserat på deras autofluorescens; (2) dissocierade celler från vildtypen (t.ex. w 1118) Drosophila midguts med Sytox läggas - ställa in den här parametern(Steg 4.4.2) medger att separera döda från levande celler (döda celler har en hög autofluorescens och kan förorena de sorterade GFP-positiva celler); (3) dissocierade celler från midguts av ESG -Gal4, UAS-GFP fluglina utan Sytox - ställa in den här parametern (steg 4.4.3) ser till att alla GFP-positiva celler plottas i punktdiagrammet. Om dessa parametrar inte är inställda på rätt sätt kommer den sorterade cellpopulationen troligen innehåller döda celler och skräp (figur 5B, C), många GFP-positiva celler kommer att missa (figur 5D) och de två distinkta toppar för GFP-positiva celler som ses i histogrammet tomten (Figur 2E och figur 3E) kommer inte att upptäckas. När FACS och grind parametrar har ställts in, är instrumentet kalibrerat och redo att sortera celler från ESG -GAL4, UAS-GFP fluglina. Eftersom dessa parametrar kan sparas, alla framtida sorterings sessioner för ISCs och EB från ESG -GAL4, UAS-GFP fluglina kan börja från steg 4,5. Även välja "Renhet" läge och utförande av en tvåvägs renhet sortera minskar antalet celler sorterade, möjliggör det en högre sorterings stringens (Steg 4,6 och figur 4B, C). Att notera, är fördelen med att använda Sytox istället för propidiumjodid för att märka döda celler som det finns endast en låg spridningseffekterna på den FITC (GFP) kanal, vilket gör det lätt att kompensera för spillover.
Vår metod att anrika för ISCs och EBS, respektive, är baserad på att sortera celler enligt olika GFP-expressionsnivåer. Det kan vara så att under åldrandet av misdifferentiated EB också uttrycka GFP på en lägre nivå och kan misstas som ISCs. Eftersom de sorterade cellerna skiljer sig också i storlek och kornighet, vi tror att vår sorteringsstrategi är den mest lämpliga för detta datum att anrika ISCs och EBS. Dessutom är det känt att celler i en åldrande midgut snäpp ISC identitet har en liten kärna 15. För att få mer klarhet om vilka de sorterade cellerna kan man sortera celler från en transgen fluglina som bär ESG -GAL4, UAS-GFP och en Notch-signalering reporter transgen. Eftersom Notch har visats vara aktiv endast i EBS 12,13, ISCs isolerad från en ung midgut vore negativt för Notch reporter, medan EBS skulle vara positivt för Notch reporter. Men under åldrandet Notch-signalering blir avvikande i midgut vävnad. Därför måste det testas huruvida detta experimentella inrättat är verkligen mer tillförlitlig att skilja mellan ISCs och EB isolerats från en gammal midgut.
Vi har redan använt denna metod för jämförande transkriptomanalys av ISCs från unga och gamla midguts och identifierat ett antal faktorer som differentiellt regleras under åldrandet (unpub. Observer.). Dessutom ger den här metoden för att analysera skillnader i genuttryck mellan ISCs och EBS. Sådan undersöknings kommer att ge en inblick i de inledande molekylära förändringar som sker som en cell in i differentieringsprocessen. Dessutom kommer isoleringen av EBS under åldrande och efterföljande analyser belysa de molekylära förändringar i ålders inducerad misdifferentiation. Dessutom kan denna metod kombineras med andra genetiska verktyg som används i Drosophila för att studera genfunktion. Sammanfattningsvis erbjuder denna metod en opartisk syn att undersöka molekylära egenskaper och förändringar i ISCs och EB under åldrandet. Detta är ett värdefullt verktyg som underlättar utforskning av åldrande mekanismer hos vuxna stamceller och progenitorceller.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps: Dumont, Inox Biologie #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| SefarNitex 03-150um/38 (35 µm nylon mesh) | Sefar | 3A03-0150-102-00 | |
| Falcon 5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | |
| Polymax 1040 | Heidolph | 543-42210-00 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma | A4503-50G | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | Trypsin obtained from a different company most likely has a different activity and the duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly. |
| SYTOX Blue Dead Cell Stain for flow cytometry | Life Technologies | S34857 | |
| RNAlater Stabilization Solution | Life Technologies | AM7023 | Other solutions, e.g., Trizol can be used for subsequent RNA isolation |
| FACSAria II cell sorter | Becton Dickinson | Turn on one hour prior to sorting |
References
- Jones, D. L., Rando, T. A. Emerging models and paradigms for stem cells ageing. Nat. Cell Biol. 13 (5), 506-512 (2011).
- Otín, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
- Signer, R. A., Morrison, S. J. Mechanisms that regulate stem cell aging and life span. Cell Stem Cell. 12 (2), 152-165 (2013).
- Iliadi, K. G., Knight, D., Boulianne, G. L. Healthy Aging – Insights from Drosophila. Front. Physiol. 3, 106 (2012).
- Biteau, B., Jasper, H. EGF signaling regulates the proliferation of intestinal stem cells in Drosophila. Development. 138 (6), 1045-1055 (2011).
- Jasper, H., Jones, D. L. Metabolic regulation of stem cell behavior and implications for aging. Cell Metab. 12 (6), 561-565 (2010).
- Biteau, B., Hochmuth, C. E., Jasper, H. Maintaining tissue homeostasis: dynamic control of somatic stem cell activity. Cell Stem Cell. 9 (5), 402-411 (2011).
- Wang, L., Jones, D. L. The effects of aging on stem cell behavior in Drosophila. Exp. Gerontol. 46 (5), 340-344 (2011).
- Lucchetta, E. M., Ohlstein, B. The Drosophila midgut: a model for stem cell driven tissue regeneration. Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 1 (5), 781-788 (2012).
- Ayyaz, A., Jasper, H. Intestinal inflammation and stem cell homeostasis in aging Drosophila melanogaster. Front. Cell Infect. Microbiol. 3 (98), (2013).
- Jiang, H., Patel, P. H., Kohlmaier, A., Grenley, M. O., McEwen, D. G., Edgar, B. A. Cytokine/Jak/Stat Signaling Mediates Regeneration and Homeostasis in the Drosophila Midgut. Cell. 137 (7), 1343-1355 (2009).
- Ohlstein, B., Spradling, A. The adult Drosophila posterior midgut is maintained by pluripotent stem cells. Nature. 439, 470-474 (2006).
- Micchelli, C. A., Perrimon, N. Evidence that stem cells reside in the adult Drosophila midgut epithelium. Nature. 439, 475-479 (2006).
- Ohlstein, B., Spradling, A. Multipotent Drosophila intestinal stem cells specify daughter cell fates by differential notch signaling. Science. 315 (5814), 988-992 (2007).
- Biteau, B., Hochmuth, C. E., Jasper, H. JNK Activity in Somatic Stem Cells Causes Loss of Tissue Homeostasis in the Aging Drosophila Gut. Cell Stem Cell. 3 (4), 442-455 (2008).
- Choi, N. H., Kim, J. G., Yang, D. J., Kim, Y. S., Yoo, M. A. Age-related changes in Drosophila midgut are associated with PVF2, a PDGF/VEGF-like growth factor. Aging Cell. 7, 318-334 (2008).
- Park, J. S., Kim, Y. S., Yoo, M. A. The role of p38b MAPK in age-related modulation of intestinal stem cell proliferation and differentiation in Drosophila. AGING. 1 (7), 637-651 (2009).
- Berger, C., Harzer, H., Burkard, T. R., Steinmann, J., vander Horst, S., Laurenson, A. S., Novatchkova, M., Reichert, H., Knoblich, J. A. FACS purification and transcriptome analysis of Drosophila neural stem cells reveals a role for Klumpfuss in self-renewal. Cell Rep. 2 (2), 407-418 (2012).
- Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing. Nat. Protoc. 8 (6), 1088-1099 (2013).
- Yagi, Y., Hayashi, S. Role of the Drosophila EGF receptor in determination of the dorsoventral domains of escargot expression during primary neurogenesis. Genes Cells. 2 (1), 41-53 (1997).
- Amcheslavsky, A., Ito, N., Jiang, J., Ip, Y. T. Tuberous sclerosis complex and Myc coordinate the growth and division of Drosophila intestinal stem cells. J. Cell Biol. 193 (4), 695-710 (2011).
- Dutta, D., Xiang, J., Edgar, B. A. RNA expression profiling from FACS-isolated cells of the Drosophila intestine. Curr. Protoc. Stem Cell Biol. 13 (27), (2013).
