Introduction
Eski büyüyen bir kaçınılmaz sonucu işlevsel kalır dokuların ve organların azalan yeteneğidir. Yetişkin kök hücreleri, ancak yaş organizmalar gibi, kök hücreler de kendi biyolojik davranışı bir düşüş yaşamaya, doku ve organ homeostasis işlevselliğini korumak için gereklidir. Bu, bağırsak epiteli gibi yüksek devir oranına sahip dokular, özellikle zararlıdır. Yaşlı kök hücrelerin diğerlerinden ayıran genomik hasar, bozulma onarım mekanizmaları, bozulmuş hücre döngüsü düzenleme ve (1-3 gözden), normal kök hücre davranışını etkilemekte olan düzeni bozulmuş sinyal yollarını içerir. Belirli sinyal yolları manipüle veya belirli genleri aşağı vurma, biz düzenleyen ve normal kök hücre davranışlarını muhafaza rolleri içgörü kazanmıştır. Bu deneylerin en adayı molekülü yaklaşımlar olduğundan, biz sırasında kök hücrelerinde meydana endojen moleküler değişiklikler hakkında çok az bilgiye sahipyaşlanma. Bu soruyu yaklaşım bir yolu eski kök hücreler olan ifade profili yaşlanma sırasında önemli ölçüde değişir molekülleri tanımlamak için karşı genç Transcriptome karşılaştırmaktır. Ne yazık ki, biyolojik ve teknik sorunlar bugüne kadar bu yaklaşımı ile ilgili bizim ilerleme engel olmuştur.
Drosophila melanogaster o (4 gözden) fenotipleri yaşlanma kısa bir ömrü (yaklaşık 60-70 gün) ve sergiler beri yaşlanma incelemek için son derece uygun bir model organizmadır. Ayrıca, Drosophila yaşlanma işlem ısı derecesi ile hızlandırılabilir. 29 ° C 'de sinekler korurken, bağırsak dokusunda yaşlı fenotip önce 15 gün 5 fark edilebilir. Ayrıca, Drosophila genetik manipülasyonlar bir bolluk için elverişlidir. Özellikle, Drosophila orta bağırsak, farklı sinyal yolları ve çevre sorunlar etkisini incelemek için mükemmel bir model sistem olarak ortaya çıkmıştır(10/06 gözden) yaşlanma sırasında bağırsak kök hücreleri (ISCs) biyolojisi. Drosophila bağırsak epitel yüksek ciro oranına sahip ve erkeklerde 11 ayda bir kez kadınlarda her iki haftada bir yenilenir ve. Drosophila midgut ikamet eden ISCs bölmek ve kendi kendine yenilenen ISC ve enteroblast (EB) 12,13 olarak adlandırılan bir post-mitotik progenitör hücre üretme kapasitesine sahip. EB emici bir enterosit veya salgı enteroendokrin hücreye ya belirlemektedir. Bu güne kadar, açıkça bir ISC etiketler tek işaretleyici kombinasyonu transkripsiyon faktörü salyangoz (esg) ve Çentik ligandı Delta (Dİ) 14 ifadesidir. Bununla birlikte, bu, sadece genç ve sağlıklı bir bağırsak için de geçerlidir. Yaşlanma sırasında, orta bağırsak epitel ISC çoğalması 15-17 bir artış ile karakterize edilmektedir. Ayrıca, anormal Notch sinyal ISC kızı hücrelerinin kaderi kararını bozanve EBS 15 misdifferentiation neden olur. Bu sayede bir yaşlı midgut niyetli kök hücreleri tanımlamak için yetersiz Dİ ifade render, Notch sinyalizasyon ve ko-ekspres ESG ve Dİ için aktif hücrelerin birikmesi ile sonuçlanır. Gerçek ISCs tanımlamada zorluk şimdiye kadar yaşlanma ISCs endojen değişiklikleri incelemek için yeteneği engellemiştir.
Biz ISCs ve EBS GFP seviyesi doğal olarak farklı ve yaşlanma boyunca farklı kaldığı ESG -Gal4, UAS-GFP transgenik sinek hattı yararlanarak bu sorunu ele oylandı. Benzer bir yaklaşım, larva nöroblast- ve nöronlar 18,19 izolasyonu için tarif edilmiştir. Genç ve yaşlı ESG -Gal4, UAS-GFP sinek Midguts disseke ve tek hücre içine ayrışmış edildi. Hücreler daha sonra, floresan aktive hücre sınıflandırma (FACS) kullanılarak GFP-pozitif hücreler için saklanmıştır. İlginçtir, sıralanmış GFP pozitif cGFP floresan yoğunluğuna dayalı iki ayrı zirveleri dağıtıldı arşın (GFP yüksek ve GFP düşük). Ayrıca, aynı zamanda, hücre boyutu ile ilişkili iki adet tepe noktasına GFP pozitif hücrelerin dağılımı: düşük GFP yoğunluğu sergiledi hücrelerin küçük ve yüksek GFP yoğunluğuna sahip hücreleri ise daha az zerre daha büyük ve daha granüler idi. Bu gözlem küçük ISCs GFP yoğunluğuna dayalı FACS kullanarak ve uygun ileri dağılım (FSC) ve yan dağılım (SSC) ayarları seçerek büyük EBS ayırt edilebileceğini önerdi. Ilginç bir iki tepe belirgin yaşlanma sırasında ayrılmış kaldı. Ayrıca, iki adet tepe oranı, yaşlanma midguts bahsedilen ayırt edici yansıtan bir şekilde değiştirildi: büyük sayısı, zaman içinde EBS artar misdifferentiated yani bu. Bu bulgular biz uygun FACS parametre ayarlarını kullanarak GFP pozitif hücreler için sıralama biz her zaman noktası d ISCs ve EBS için zenginleştirebilirsiniz sonucuna varıldırada yaşlanma.
Özetle, biz herhangi bir yaş Drosophila midguts gelen, iki farklı hücre popülasyonlarının, ISCs ve EBS için zenginleştirmek ve gelecek nesil dizileme gibi daha fazla analiz için bu hücrelerin, izole etmek araştırmacıların sağlayan bir FACS stratejisi tanıtmak. Bu güçlü bir yöntem kök veya projenitör hücreler, zenginleştirilmiş bir popülasyonda yaşlanma doğasında olan endojen molekül mekanizmalarının incelenmesi için izin verir. Bu çalışmalardan elde edilen veriler, kuşkusuz türler arasında yaşlanan önemli olan korunmuş moleküllerin belirlenmesini kolaylaştırır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps: Dumont, Inox Biologie #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| SefarNitex 03-150um/38 (35 µm nylon mesh) | Sefar | 3A03-0150-102-00 | |
| Falcon 5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | |
| Polymax 1040 | Heidolph | 543-42210-00 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma | A4503-50G | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | Trypsin obtained from a different company most likely has a different activity and the duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly. |
| SYTOX Blue Dead Cell Stain for flow cytometry | Life Technologies | S34857 | |
| RNAlater Stabilization Solution | Life Technologies | AM7023 | Other solutions, e.g., Trizol can be used for subsequent RNA isolation |
| FACSAria II cell sorter | Becton Dickinson | Turn on one hour prior to sorting |
References
- Jones, D. L., Rando, T. A. Emerging models and paradigms for stem cells ageing. Nat. Cell Biol. 13 (5), 506-512 (2011).
- Otín, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
- Signer, R. A., Morrison, S. J. Mechanisms that regulate stem cell aging and life span. Cell Stem Cell. 12 (2), 152-165 (2013).
- Iliadi, K. G., Knight, D., Boulianne, G. L. Healthy Aging – Insights from Drosophila. Front. Physiol. 3, 106 (2012).
- Biteau, B., Jasper, H. EGF signaling regulates the proliferation of intestinal stem cells in Drosophila. Development. 138 (6), 1045-1055 (2011).
- Jasper, H., Jones, D. L. Metabolic regulation of stem cell behavior and implications for aging. Cell Metab. 12 (6), 561-565 (2010).
- Biteau, B., Hochmuth, C. E., Jasper, H. Maintaining tissue homeostasis: dynamic control of somatic stem cell activity. Cell Stem Cell. 9 (5), 402-411 (2011).
- Wang, L., Jones, D. L. The effects of aging on stem cell behavior in Drosophila. Exp. Gerontol. 46 (5), 340-344 (2011).
- Lucchetta, E. M., Ohlstein, B. The Drosophila midgut: a model for stem cell driven tissue regeneration. Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 1 (5), 781-788 (2012).
- Ayyaz, A., Jasper, H. Intestinal inflammation and stem cell homeostasis in aging Drosophila melanogaster. Front. Cell Infect. Microbiol. 3 (98), (2013).
- Jiang, H., Patel, P. H., Kohlmaier, A., Grenley, M. O., McEwen, D. G., Edgar, B. A. Cytokine/Jak/Stat Signaling Mediates Regeneration and Homeostasis in the Drosophila Midgut. Cell. 137 (7), 1343-1355 (2009).
- Ohlstein, B., Spradling, A. The adult Drosophila posterior midgut is maintained by pluripotent stem cells. Nature. 439, 470-474 (2006).
- Micchelli, C. A., Perrimon, N. Evidence that stem cells reside in the adult Drosophila midgut epithelium. Nature. 439, 475-479 (2006).
- Ohlstein, B., Spradling, A. Multipotent Drosophila intestinal stem cells specify daughter cell fates by differential notch signaling. Science. 315 (5814), 988-992 (2007).
- Biteau, B., Hochmuth, C. E., Jasper, H. JNK Activity in Somatic Stem Cells Causes Loss of Tissue Homeostasis in the Aging Drosophila Gut. Cell Stem Cell. 3 (4), 442-455 (2008).
- Choi, N. H., Kim, J. G., Yang, D. J., Kim, Y. S., Yoo, M. A. Age-related changes in Drosophila midgut are associated with PVF2, a PDGF/VEGF-like growth factor. Aging Cell. 7, 318-334 (2008).
- Park, J. S., Kim, Y. S., Yoo, M. A. The role of p38b MAPK in age-related modulation of intestinal stem cell proliferation and differentiation in Drosophila. AGING. 1 (7), 637-651 (2009).
- Berger, C., Harzer, H., Burkard, T. R., Steinmann, J., vander Horst, S., Laurenson, A. S., Novatchkova, M., Reichert, H., Knoblich, J. A. FACS purification and transcriptome analysis of Drosophila neural stem cells reveals a role for Klumpfuss in self-renewal. Cell Rep. 2 (2), 407-418 (2012).
- Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing. Nat. Protoc. 8 (6), 1088-1099 (2013).
- Yagi, Y., Hayashi, S. Role of the Drosophila EGF receptor in determination of the dorsoventral domains of escargot expression during primary neurogenesis. Genes Cells. 2 (1), 41-53 (1997).
- Amcheslavsky, A., Ito, N., Jiang, J., Ip, Y. T. Tuberous sclerosis complex and Myc coordinate the growth and division of Drosophila intestinal stem cells. J. Cell Biol. 193 (4), 695-710 (2011).
- Dutta, D., Xiang, J., Edgar, B. A. RNA expression profiling from FACS-isolated cells of the Drosophila intestine. Curr. Protoc. Stem Cell Biol. 13 (27), (2013).
