Introduction
For at skabe et stort antal af levedygtige og funktionelle humane celler til transplantation, regulering af dyrkningsbetingelser er bydende nødvendigt. Udtømning af næringsstoffer, sammen med opbygning af metaboliske affald er væsentlige bidragydere til ældning og metaboliske ændringer, som reducerer kvaliteten af cellen produkt 1 - 3 ud. Denne procedure belyser en fremgangsmåde til kultur pattedyrceller i sfæroider ved anvendelse af en omrørt bioreaktor kombineret med en justeret sats perfusion fodringssystem at regulere glucose i en fysiologisk område 4 under hele kulturen. Med henblik på disse undersøgelser blev det fysiologiske område defineret som mellem 100 og 200 mg / dl. De samme fremgangsmåder kan anvendes til at regulere andre næringsstoffer og metaboliske affald såsom lactat.
Statiske kulturer i små volumener (1 - 30 ml) anvendes typisk i indstillingen laboratorium for at opretholde og differentiere cellelinier til experimental formål. Cell passage udføres med komplet medium ændringer efter behov med jævne mellemrum. Mest "konventionelle" dyrkningsmedium har en høj glucosekoncentration (450 mg / dl for DMEM anvendt i disse undersøgelser) for at muliggøre mindre hyppige udskiftning af medium uden risiko for begrænsninger næringsstoffer. Men denne batch-fodring metode kræver stadig hyppige manipulation, introducerer variation i cellen miljø, og øger risikoen for forurening 5 - 9. Omrørt suspension bioreaktorer (SSB) give bedre blanding og faldt håndtering 3,10 - 20, men ligesom statiske kulturer, kræver manuelle medium ændringer, der bidrager til potentielt skadelige udsving i næringsstoffer og spildprodukt niveauer. Perfusion fodring af SSB kulturer reducerer disse problemer ved kontinuerlig infusion og fjernelse af medium, men store ændringer i næringsstoffer niveauer på grund af cellevækst fortsat være et problem. Anvendelsen af en justeret fodring rate fra beregninger af forbrug af næringsstoffer baseret på estimerede celle krav kan give den stabile celle miljø kræves for at optimere cellernes levedygtighed og funktion 21 - 24.
Der er en stor mængde litteratur, der beskriver metoder til skalerbare SSB kulturer af pattedyrceller specielt til kultur og udvidelse af pluripotente celler 25-32, med andre fokuserede på holmen (beta) celler 17,33,34, eller produktion af biologiske produkter 24, 35-38. Mange af disse undersøgte celletyper kan dyrkes i kugleformede kulturer, og særlige procedurer for den celletype, der bruges bør optimeres før at gennemføre en kontinuerlig fodring system. I denne demonstration blev en perfusion fodring metode bruges til at udvide en beta-cellelinie dyrket som sfæroider i en omrørt bioreaktor 39-43. Den heri beskrevne fremgangsmåde tilvejebringer enligetil implementering af fodring sats justeringer baseret på off-line glucose målinger for at opnå målrettede dyrkningsbetingelser. Justering af tilførselshastigheden med denne metode til at opretholde en fysiologisk glucose niveau vises til stigninger celleudbytter. Mammale celler er afhængige af en nøgle næringsstof, glucose, til energiproduktion, så brugen af denne cellelinie er en model for mange dyrkede pattedyrceller 44. Derudover denne linje eksemplificerer yderligere kompleksitet af beta-celler, som er følsomme for kroniske høje niveauer af glucose 45. Til denne undersøgelse blev p-TC6 celler lov at dannes sfæroider i kultur at tilnærme den gennemsnitlige størrelse af Langerhanske øer in vivo. Den perfusionsbioreaktor systemet 17 - 19,21,46 med en fødehastighed justeret til glucose forbrug, i bevarelse fysiologiske betingelser og højere celleudbytter uden ændringer i levedygtighed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cell Line og vedligeholdelse
- Opnå p-TC6 celler (eller anden ønsket adhærerende mammal cellelinie). Som forberedelse til undersøgelsen, kultur, passage, og Cryopreservering cellerne i henhold til udbyder anvisninger.
2. Saml Kontinuerlig Feeding System
BEMÆRK: Den kontinuerlige fødesystem design i nedenstående metode var baseret på tilsvarende systemer, der er beskrevet i litteraturen 17 - 19,21,47 - 49. Montering af systemet bruges her er beskrevet i detaljer i en tidligere publikation 3.
- Saml de komponenter, der er nødvendige til fodring system, som består af fem primære komponenter: et medium reservoir, peristaltisk pumpe, omrøres bioreaktor, reservoir affald, og specialdesignet rør / sampling sæt.
- Etablere mediet reservoir under anvendelse af en 1 L glasflaske, spildreservoiret anvendelse af en 2 L glasflaske, og stirred bioreaktor ved anvendelse af en 250 ml volumen glasreaktor (fra hylden udgave).
- Anvende en digital peristaltisk pumpe eller lignende pumpe med en 8 kanals pumpehoved at kontrollere mediumudskiftning.
- Fremstilling reservoiret og modificerede bioreaktor låg fra hård og autoklaverbar plast med rustfrit stål rør gennemslag havne for at give ventilation gennem sterile filtre, og giver mulighed for medium overførsel mellem reservoirer og bioreaktorer. Alternativt købe specialiserede låg med flow havne fra forskellige leverandører.
BEMÆRK: bioreaktor låg kan indeholde yderligere pass-through porte til valgfri instrumentering og overvågning prober (fx ilt monitor). - Vedhæfte en udstrømning rør (OT) fremstillet af porøse glas beluftning rør med en gennemsnitlig porestørrelse mellem 40 um til 60 um og en pore- tæthed på 40% til den modificerede SSB låget. Alternativt kan du vælge en anden udstrømning rør baseret på de specifikke krav i kulturen.
BEMÆRK: Vælg denOT porestørrelse at fjerne kun medium og cellerester, efterlader celle aggregater i kultur (som beskrevet i afsnit 6 og offentliggørelse 3 for flere detaljer).
- Saml autoklaverbare perfusion slangesæt fra polyvinylidenfluorid (PVDF) slanger stik og holdbare peristaltisk pumpe slange. Længden af afsnittet er afhængig af afstanden mellem de forskellige komponenter.
BEMÆRK: Vær ekstra forsigtig, når du vælger slange sort for at sikre holdbarhed og pålidelighed for langsigtede eksperimenter. - Saml slangesæt fra tre dele: en fødeledning, spild linje, og en prøve linje.
- Saml fødeledning ved hjælp af to slanger diametre (L / S 14 og L / S 13). Brug L / S 14 for den primære rør, der vil spænde over afstanden fra bioreaktoren til mediet reservoir, og indsætte en kort længde på L / S 13 i midten af røret længde for pumpesektionen anvendelse af de passende PVDF adaptere.
- Brug Standard PVDF slange-pigtråd Tubing adaptere til at slutte to stykker L / S 14 slange på hver side af den kortere pumpens sektion (L / S 13) slange.
BEMÆRK: Alternativt kunne hele længden af slangen være mindre diameter L / S 13 slanger, og hele rørlængde kunne erstattes, når pumpen tværsnit integritet den er i spørgsmålet.
- Saml den anden slange sektion for affald fjernelse ved hjælp større diameter (L / S 16) slange og indsætte en kort del af L / S 14 slange i midten til pumpning sektion. Dette gøres på samme måde som fødeledning samling under anvendelse PVDF slangelignende modhager adaptere, eller alternativt ved anvendelse af en kontinuerlig længde af den ønskede pumpe slange størrelse, og udskiftning efter behov.
BEMÆRK: Hvis der anvendes den samme pumpe og pumpe hoved for foderet kredsløb og kredsløbet affald, skal pumpen del af fjernelse affald slange linjer være en større diameter end den del af fodring linje pumpen. Dette sikrer, at fjernelsen pumpe frekvens er hurtigere end tilspændingen, og vil undgå den potenteundervægter le for store ændringer i mængden kultur, og mindske risikoen for overløb. - Saml den endelige komponent i slangesættet: en prøve opsamlingsenheden.
- Denne procedure beskriver en brugerdefineret samlet prøveudtagning havnesystem; alternativt kan en steril prøveudtagning port købes fra forskellige leverandører.
- Konstruer sættet fra tre korte (~ 6 cm) L / S 14 slanger længder forbundet sammen med en T-typen PVDF stik, og to små spændebånd på to af de slanger længder.
- Vedhæfte en steril gas filter til gas udluftning til en af den fastspændte længder, og den anden anvendes til forbindelse til en steril prøveudtagning sprøjte (sterile gasfiltre kan være nødvendigt at blive tilføjet i en bio-sikkerhedsskab efter sterilisering så mange sterile filtre er ikke autoklaverbare).
- Forbind den tredje ende til en rustfri stål prøve stik fastgjort på låget af bioreaktoren.
- Autoklaver prøveudtagning forsamling, mens forbundet til før begyndelsen bioreaktoreneksperimentet (se trin 3 nedenfor).
- Brug denne forsamling til at indsamle sterile prøver fra bioreaktoren efter behov uden at forstyrre den kontinuerlige foder processen.
3. Autoklave Alle Materialer
- Forbered alle bioreaktor komponenter til autoklave sterilisering.
- Saml individuelle komponenter til sterilisering. Medium og affald reservoirer (samlet fra trin 2.1.1), 250 ml spinner kolbe (samlet fra 2.1.1), der er nødvendige modificerede låg (samlet fra 2.1.3), udstrømning rør (beskrevet i 2.1.4), tre slangesæt ( samlet i punkt 2.2 through2.5), udstrømning rør (som er nødvendige for kontinuerlig fodring).
- spinnerkolben Saml med alle komponenter og sørg udstrømningen røret er solidt fastgjort inde spinnerkolben (beskrevet i afsnit 2.1.4), og fastgør den brugerdefinerede samlet prøvetagning port (afsnit 2.5), eller anden prøveudtagning port til toppen af låget .
- Wrap hele spinnerkolben forsamling med autoClave omviklingsmateriale, og autoklaver indikerer tape. Vær sikker på, at wrap lufttæt. BEMÆRK: aluminiumsfolie eller lignende materiale kan anvendes til at dække individuelle ender af hver adgangsport i bioreaktoren låget for at bevare sterilitet af konnektoren / slutter, når udpakning og når ikke-tilsluttet slangesæt inde i inkubatoren.
- Saml de modificerede låg af mellem- og affald reservoirer de og derefter vedhæfte til de respektive glasflasker. Dæk dem ved hjælp af aluminiumsfolie og autoklaver indikerer tape.
- Individuelt wrap slangesæt (afsnit 2,2-2,5) med autoklave wrap og tape til at hjælpe med den endelige samling. Aluminiumsfolie eller lignende materiale kan anvendes til at indpakke de individuelle ender af hver slangesættet at bevare sterilitet af konnektoren / slutter, når udpakning.
- Autoklavér alle indpakket elementer ved hjælp en standard tør autoklave cyklus (f.eks, "Gravity" indstilling med ~ 15 psi ved 121 ° C i 30 min eller mere).
BEMÆRK: Brug ikke vedhæfte sterilfiltre før autoklavering, medmindre de er bekræftet at være autoklave sikker.
4. Sfæroide Formation
BEMÆRK: Denne teknik svarer til dem, der er beskrevet i litteraturen 17 - 19,21,50 - 52 for andre pattedyr cellekulturer. Alle procedurer efter sterilisation bør ske i en laminær strømning og anvendelse af sterile handsker til at opretholde sterile betingelser for cellekultur.
- For alle forhold, kultur og udvide β-TC6 celler i standard vedhængende kulturer (beskrevet af sælgeren) indtil tilstrækkelige celle mængder opnås til frø det ønskede antal bioreaktorer.
- Saml kontinuerlig fodring bioreaktor med udstrømning rør som vist i figur 1 og beskrevet i afsnit 2, og tilslut sampling port til prøveudtagning låg. BEMÆRK: udstrømning rør og prøveudtagning port forsamling bør føjes til bioreacteller til kontinuert tilførsel før kugleformet dannelse, og skal trækkes op af dyrkningsmediet indtil kontinuerlig fodring startes.
- Steriliser modificerede SSB samling af autoklave (beskrevet i afsnit 3).
- Vedhæft sterile ventilationskanaler (0,22 um eller mindre sterile filtre) til de relevante steder på lågene af spinnerkolben og mellemstore og affald skibe.
BEMÆRK: Denne er vigtigt at forhindre damp lås, og at tillade gasudveksling mellem inkubatoren (5% CO2) miljø og bioreaktoren. Gasbørsen er nødvendig for at opretholde den korrekte pH ved brug bicarbonatpufrede medier.
- Opsamle cellerne ved forsigtig trypsinering anvendelse af 0,25% (vægt / volumen) trypsin- 0,53 mM EDTA-opløsning, ved stuetemperatur hjulpet af mekanisk omrøring til 2 - 3 min, og frø i bioreaktorer med en densitet på ca. 1,3 x 10 6 celler / ml i 200 ml dyrkningsmedium.
- Flyt udpegede kolber ud af inkubatoren ogind i en Bio-Safety kabinet.
BEMÆRK: Alle cellekultur og manipulationer bør ske på en Bio-Safety kabinet ved hjælp af ordentlig steril teknik. - Fjern kulturmedium fra kolber ved sugning.
- Vask cellerne ved pipettering 5 ml phosphatbufret saltvand (uden Ca ++ eller Mg ++), i kolben, og skylning tværs cellerne på overfladen, og derefter aspirér PBS.
- Tilsæt 3 ml trypsin-EDTA-opløsning til hver kolbe, der vil blive opsamlet (typisk ca. 10x 175 cm 2 T-kolber).
- Tillad høstede celler til at inkubere ved stuetemperatur til 2 - 3 min i biosikkerhed kabinet.
- Omryst forsigtigt med hånden for at løsne cellerne fra kolben overflade, og indsamle cellerne ved tilsætning af 6 ml dyrkningsmedium (med serum) til kolben, og overføre cellerne til et 50 ml rør. Når en 50 ml rør er fuld, bruge en anden 50 ml rør, indtil alle de nødvendige celler er blevet opsamlet (ca. vil være nødvendig én 50 ml rør for hver 5 T-175-kolberindsamlet).
- Forsigtigt centrifuge (ca. 50 x tyngdekraft) de indsamlede cellesuspensioner at pelletere cellerne.
- Aspirere den resterende medium forlader pellet intakt.
- Saml alle de celler i et enkelt rør ved re-suspension af pellets i dyrkningsmedium (indeholdende serum) ved hjælp af en pipette, og overføre alle pellets i det samme rør.
- Tæl celledensiteten anvendelse af en standard hæmocytometer med trypan blå-farvning som beskrevet i litteraturen 53.
- Tilføj ønskede antal totale celler til sterile SSB for hver betingelse (1,3 x 10 6 celler / ml var de målrettede start celletætheder til denne demonstration).
- Tilføj medium (med den ønskede glucosekoncentration, vi i dette tilfælde anvendte medium glucoseniveauer inden for det fysiologiske område) til SSB anvendelse af en pipette for at nå den ønskede totale kulturvolumen (200 ml kulturvolumen blev anvendt til disse undersøgelser).
BEMÆRK: For disse løbende fodret SSB studerer cu ltures blev podet ved anvendelse af en modificeret "lav-glucose" version af dyrkningsmediet (100 mg / dl). Dette tillod kulturerne at starte i det ønskede mål glucosekoncentration stedet for at starte med en "høj-glucose" medium og venter på glucoseforbrugshastighed at bringe blodsukkerniveauet ned i det fysiologiske område for at begynde fodringen. Alt andet medium til fodring i disse undersøgelser anvendte standard "høj-glucose" medium (500 mg / dl). - Flyt SSB med celler til en omrøringsplade i en cellekultur inkubator.
- Flyt udpegede kolber ud af inkubatoren ogind i en Bio-Safety kabinet.
- Kultur celler i bioreaktorer uden fodring i 3 dage ved 37 ° C, med 5% CO2, 100% relativ fugtighed og en omrøringshastighed på 70 rpm for at tillade sfæroiderne at danne.
BEMÆRK: Der bør ikke observeret nogen signifikant spredning i klumpformet dannelse periode på tre dage. - Efter sfæroid dannelse, opdele sfæroider blandt bioreaktorer med ønskede dyrkningsbetingelser.
- Autoklave eller gas sterilisere alle komponenterne, og samles i et biologisk sikkerhedsskab med sterile teknikker (trin 2 - 4).
- Efter kugleformet dannelse, fjerne SSB fra inkubatoren og samle komponenterne til kontinuerlig fodringssystem i en biologisk sikkerhedsskab.
- Først fylde frisk medium reservoir med det ønskede dyrkningsmediet, og derefter oprette forbindelse til den ene side af tilførselsledningen. Også sikre, at det friske medium reservoir er korrekt udluftet med en steril filter.
- Slut den ene side af tilførselsledningen til foderet indløbsporten på bioreaktoren på en steril måde. Et sterilt filter skal monteres mellem fødeledning og bioreaktorens indgangsport for at filtrere mediet før den kommer ind i bioreaktoren.
- Slut affaldet linje til bioreaktoren udstrømning rør og reservoir mediet affald, og sikre, at reservoiret affald er korrekt udluftet med en sterile filter.
- Flyt samlingen ud af den biologiske sikkerhed fryser (dette vil sandsynligvis kræve to personer til at bære alle de fartøjer og slanger), og sætte alle komponenter ud for langsigtet kultur.
- Sæt SSB på omrørerplade indersiden af inkubatoren anvendelse af de samme dyrkningsbetingelser parametre for klumpformet dannelse (37 ° C, 5% CO2, 100% fugtighed og 70 rpm). BEMÆRK: Det kan være nødvendigt midlertidigt at afbryde slangesegmenterne fra bioreaktoren hvis linierne skal køre gennem huller i siden af inkubatoren snarere end ud gennem pakningen i døren. Dette kan gøres på en aseptisk måde ved at vikle enderne af slangesæt med aluminiumsfolie før autoklavering (trin 3), og venter på at fastgøre bioreaktoren side af foder og affald rørsektioner indtil bioreaktoren er inde i inkubatoren. De rør linjer kan sættes på plads, og aluminiumfolien kan fjernes inde i inkubatoren og hurtigt fastgøres til bioreaktoren.
- Kør resterende ender af slangesæt (dem der ikke er forbundet til bioreaktoren låg) ud gennem inkubatoren adgang port (pass-through), eller gennem et hak i inkubatoren dørpakningen.
- Uden for inkubator (i et nærliggende biosikkerhed kabinet hvis muligt), hurtigt at forbinde tilførselsledningen til det friske medium reservoir, og affaldet linje til medium reservoir affaldet, og sikre, at reservoiret affald er korrekt udluftet med en steril filter. BEMÆRK: For at gøre dette på aseptisk måde, fjerne aluminiumsfolie fra slanger og fartøjet stik og oprette forbindelse til de respektive fartøjer så hurtigt som muligt (især hvis denne forbindelse skal gøres uden for biosikkerhed kabinet).
- Put frisk medium reservoir (fyldt med ønsket foder medium) inde nærliggende mini-køleskab. Kontroller at sikre, at foder og affald linjer er i stand til at afslutte inkubatoren og indtast køleskabet uden at forhindre dørene på hver i at lukke. Det er også afgørende, at foderet lines ikke klemt lukket af døre i enten køleskabet eller inkubatoren.
BEMÆRK: Mediet anvendt til disse undersøgelser var den standard høje glukose (500 mg / dl) dyrkningsmedium anbefalet af leverandøren for denne celletype. Enhver høj glukose medium kunne anvendes på grundlag af de specifikke behov i den celletype der dyrkes. Glucosekoncentrationen af foderet medium bør være noget højere (2x eller mere) end den ønskede koncentration i kultur som fodring system bygger på at forøge tilførselshastigheden for høj glucose medium at opretholde tilstrækkelige glucoseniveauer i kulturerne samtidig opretholde en rimelig tilførselshastigheder . - Dernæst kan affaldet medium reservoir sættes på bænken toppen uden inkubatoren i en bekvem beliggenhed.
- Herefter sættes "pumpe afsnit" af foder og affald linjer i pumpehovedet at sikre en korrekt orientering, så foder linjer vil pumpe medium fra frisk medium reservoir i SSB, og affald linjervil pumpe medium fra SSB og affaldet medium reservoir.
- Vend pumpen videre til den ønskede tilspænding.
- Beregn tilspænding ved hjælp af den justerede tilspænding ligning beskrevet i litteraturen 3 og i givet repræsentative resultater nedenfor.
- Brug den nyeste celletal information (procedure beskrevet i trin 5) langs med væksten forudsigelse, og mellemstore glukosemålinger de at estimere tilspænding er nødvendig for at holde koncentrationen ønskede glucose i kulturen.
BEMÆRK: celle vækst og glucose forbrug satser skal indhentes forud for at gøre disse procedurer. - Indstil pumpens hastighed baseret på den beregnede tilspænding.
- Gentag beregningen af tilspænding og juster pumpens hastighed for hver prøvetagningssted (hver tredje dag til den beskrevne metode).
6. celletal, levedygtighed og glukosekoncentrationen Målinger
<ol>- Forlader kontinuerligt tilført SSB inde bioreaktoren, vedhæfte en steril sprøjte (5 ml volumen sprøjte blev anvendt til disse undersøgelser) at un-filtrerede tilslutning af prøveudtagning porten.
- Flyt prøvetagningsrøret ned i dyrkningsmediet.
- Unclamp rørsektionen går til sprøjten, og trække den ønskede samlede prøvevolumen.
- Flyt prøvetagningsrøret op, så den ikke længere er nedsænket i kulturen, og fortsætte med at trække sprøjten indtil luften er fjernet.
- Spænd røret, der føder sprøjten, og tag sprøjten indeholder prøven, og der er afsat.
- Pre-indlæse en anden frisk steril sprøjte med luft, og tillægger det sterile filter side af prøveudtagning porten.
- Unclamp røret vil sprøjten-filter side afprøveudtagningsåbningen, og derefter rense sampling port ved forsigtigt udstøde luften i sprøjten gennem sterilfilter. Dette sikrer, at prøveudtagningen porten vil være klart af enhver resterende medium.
- Re-klemme røret går til filteret, afbryde steril sprøjte og kassér den.
- Tilføj medium (med serum) tilprøven til fortynding efter behov.
- Tæl cellerne, og beregne celle levedygtighed ved at optage levende (ufarvede) celler, og døde (farvede) celler uafhængigt (levedygtighed% = levende celler / totale celler).
- Tag glucosemålinger som beskrevet af glukosemåleren instruktioner substituerer dyrkningsmediet for blod.
- Dyp teststrimlen i mediet, der skal testes (indsamlet fra tæller prøver over), og gentag for det ønskede antal gentagelser (tre gentagelser kan anbefales).
- Test både frisk medium og affald medium for glucosekoncentrationer.
BEMÆRK: For nogle meter, målinger lavere end 20 mg / dl (påviselig tærskel af måleren), kan observeres som en fejl i måleren output.
7. sfæroid sedimenteringshastighed Målinger
- For at sikre at cell klynger ikke bliver fjernet af den kontinuerlige fodringssystem, måle sedimenteringshastigheden af p-TC6 sfæroider ved at observere deres sedimentation i en stor plastik diameter pipette.
- Kultur p-TC6 celler i SSB bioreaktorer til dannelse sfæroider som beskrevet ovenfor.
- Efter 3 dages dyrkning, tage 30 ml prøver af sfæroidet suspension og sted i et 50 ml rør.
- Forsigtigt pipetteres op og ned med en bred diameter 25 ml pipette at fordele sig jævnt i suspension, så stop pipettering med suspensionen ved en kendt niveau i pipetten (f.eks 20 ml mærket), og derefter optage tiden for alle de sfæroider til bosætte 5 cm.
- Gentag denne procedure nok gange til at opnå statistisk konfidens (normalt n> 3).
BEMÆRK: For biologiske undersøgelser, ap-værdi mindre end 0,05 anses for at være statistisk signifikant, når man sammenligner målinger. Standarden på middelværdien blev brugt til rapportering fejl, og de to tailed un-parret student-t-testblev anvendt til at sammenligne betingelserne for de præsenterede data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Medium blodsukkerniveauet og Udsving Begræns Cell Ekspansion i Standard SSB Cultures
Glucose niveauer svinger i statiske kulturer og SSB kulturer i hele kulturen perioden 3.. Disse udsving intensiveres med stigende celletal under 21-dages kultur periode og var næsten identisk i både statiske og SSB kulturer. Disse observationer er præsenteret i vores tidligere publikation 3. Glucoseniveauerne kan være super-fysiologiske under hele dyrkningsperioden for begge metoder. Fordi denne kronisk eksponering kan hæmme cellevækst 54, blev et kontinuerligt fødesystem udviklet for at eliminere glucose udsving og forbedre næringsstof kontrol under sfæroide kultur.
Kontinuerlig Fodring System for Sfæroide Kultur
Kontinuerlig tilsætning frisk medium og fjernelse af gammelt medium for varigheden af dyrkningsperiodenkan opnås ved anvendelse af en enkelt medium genopfyldningssystem. Fremgangsmåden beskrevet i fremgangsmåde 2 og vist i figur 1, der anvendes en pumpe og slangesæt til løbende genopbygge medium og en separat udmunder til løbende at fjerne medium samtidig forhindre fjernelse af sfæroider fra kulturen. Mediet indløb var på den modsatte side af reaktoren for at minimere enhver mulighed for at forstyrre den korrekte funktion af OT, og give mulighed for grundig blanding. Frisk medium (med høj glucose, 450 mg / dl) blev holdt ved køleskabstemperatur at sikre langsigtet stabilitet og kontinuerligt tilsættes til kulturen gennem et medium si med fuld medium dækningsgrad hver tredje dag til at genopbygge de næringsstoffer. Dette system begrænsede manipulationer og indgreb, der kræves i den kultur periode ved at erstatte den manuelle batch medium udskiftning proces med en kontinuerlig proces 3,22,23. Den kolde medium ind i bioreaktoren i små mængder gennem time (0,046 ml / min) i forhold til det totale volumen kultur (200 ml), hvilket giver hver "drop" af tilsat medium tid til at ækvilibrere temperaturen med det omgivende dyrkningsmedium, som var ved 37 ° C. Dette sikrede, at den ekstra kolde medium ikke reducere den samlede kultur temperaturen stigende niveau i inkubatoren. Omrøring af dyrkningsmediet også øget varmeoverførsel effektivitet og forbedret temperaturensartethed i disse kulturer. Temperatur vedligeholdelse kunne være en bekymring, hvis meget høje tilspændinger blev anvendt med små mængder kultur, men disse usandsynlige betingelser blev ikke testet for disse undersøgelser. Volumenet kultur blev holdt på et konstant niveau i den kontinuerlige fødesystem ved at sikre, at den gennemsnitlige medium fjernelse sats var lig med tilførselshastigheden. Det system, der anvendes til disse undersøgelser faktisk fjernet medium ved en højere gennemstrømningshastighed end tilspændingen fordi fjernelse slange sektionen brugte større rør diameter for pumpen sektion. På trods af den hurtigere removal sats blev kulturen volumen opretholdes ved justering af niveauet af udmunder inde i reaktoren til det ønskede volumen kultur niveau. Kontinuerlig tilsætning frisk medium til SSB resulterede i en lille stigning i det medium niveau i reaktoren, og når mediet nået niveauet for OT, blev mediet fjernet fra reaktoren ved en hurtigere hastighed. Mediet blev fjernet gennem den porøse glas OT, forlader cellen sfæroider i kultur indtil mediet niveau faldt under bunden af OT. Dette system undgås kompleksiteten af anvendelse af tynd strøm og volumen sensorer til at styre pumpen hastigheder, og er den standard til brug med mange SSB baseret kultur apparat 47,48. Den OT designet til at sikre, at sfæroider ikke blev fjernet fra kulturen ved at fjerne kredsløb, og porestørrelsen og tæthed i frittet glasrør var store nok (40% og i 40 - 60 um henholdsvis) for at sikre, at den lineære strømningshastighed var mindre end sedimenteringshastigheden af sfæroider osed for disse kulturundersøgelser. Den lineære strømning blev beregnet som beskrevet detaljeret 3. Den gennemsnitlige lineære medium hastighed gennem porerne i OT blev beregnet til 0,17 cm / min, og dette var meget langsommere end den langsomste observerede sfæroid sedimenteringshastighed. Den gennemsnitlige faldhastighed blev målt som beskrevet i metode 7 og var 2,53 ± 0,26 cm / min for sfæroiderne anvendt i disse studier. Sfæroiderne blev observeret at stige i størrelse som kulturen skrider frem, og disse større sfæroider afviklet hurtigere på grund af deres øgede masse-træk-forhold, hvilket yderligere faldt muligheden for fjernelse gennem OT. Nogle spheroids blev fanget i de nederste porer på de udvendige kanter af OT, men dette skyldes primært mekanisk kollision, når udstrømningen rør dips ind den omrørte medium. Det forhindrede ikke korrekt funktion af OT, og ikke bidrog til en målbar tab af sfæroider i de testede kulturer. Den OT for disse undersøgelser blev renset efter hver undersøgelse, (med DI vand flush), og udskiftes efter brug for to kulturundersøgelser at undgå risikoen for nedsat funktion. Den OT kunne erstattes efter hver undersøgelse, hvis der observeres sphæroider at tilstoppe porerne i løbet af en særlig undersøgelse (dette blev ikke observeret i den præsenterede arbejde). På grund af den cykliske fjernelse af medium ved hjælp af denne metode, medium kulturvolumen den svinget med op til 6%. Udsvingene var forårsaget af overfladespændingen af mediet, der tillod OT at fjerne en smule mere medium efter det gennemsnitlige medium niveau faldt under bunden af OT.
Eliminering Næringsstoffer Udsving Forbedret cellevækst i SSB Cultures
Kontinuerligt at erstatte mediet i SSB kulturer under anvendelse af systemet beskrevet ovenfor forøgede kultur udbytter i løbet af 21-dages dyrkningsperiode i sammenligning med standard SSB kulturer. Foderet blev fastholdt konstant i hele kulturen periode med en hastighed, der erstattede hele kultur VOLUmig hver tredje dag for at være sammenlignelige med batch-fed SSB kulturer. Eliminering af de næringsstoffer udsving medført en stigning i celle udbytter (figur 3) på trods af den høje glukosekoncentration 3. Sfæroid størrelse blev også målt ved slutningen af dyrkningsperioden af 2D mikroskopisk vurdering (standard lysmikroskopi beskrevet i litteraturen 3), og sfæroiderne i CF-SSB-kulturer var signifikant større (p <0,02, student-t-test), der i statisk eller standard SSB kulturer som rapporteret i litteraturen 3. Disse observationer understøtter celle-count data tyder på en højere vækst i CF-SSB kulturer, mens levedygtigheden blev fastholdt på samme høje niveau (96,23 ± 0,85%), uanset kultur tilstand. Den løbende fodret SSB (CF-SSB) kultur-system elimineret udsving næringsstoffer i kugleformede kulturer, og forbedret celle vækstrater, men blodsukkerniveauet forblev super-fysiologiske, som kan have forhindret yderligere imp rovement i celle ekspansion (figur 2). For yderligere at forbedre det CF-SSB dyrkningssystem blev en algoritme anvendes til at justere tilførselshastigheden under dyrkningsperioden med det formål at forbedre kontrollen med glucoseniveauer i SSB kulturer.
Beregning af Justeret Feed Rate
Flere faktorer kan betragtes til beregning af tilspænding at opretholde ensartede blodsukkerniveauer. De specifikke faktorer af interesse kan ændres for en given undersøgelse og havde et specifikt cellelinie. Med henblik på denne demonstration, betragtede vi vækstrate og glukose forbrug bestemmes fra tidligere kulturer, såvel som den faktiske glucose niveauer på tidspunktet for tilpasningen 3. Tilspænding kan foretages justeringer på ethvert interval på tid. Til denne demonstration blev prøver opsamlet, og fødehastigheden blev justeret hver tredje dag baseret på de sekventielle beregninger, der beskrives som følger.
t "> Beregning af forventede vækstLigning 1 forudsiger cellevækst i en vis periode af kultur, med den forudsagte celletal (N2), der repræsenterer den forventede samlede antal celler i kultur på et tidspunkt i fremtiden. Denne metode bruger en lineær vækst tilnærmelse, hvor den nuværende celletal (N1) til den estimerede vækstrate cellerne i kugleformede kulturer (R g) ganget med kulturen periode (t 2 -t 1).
(1)
Beregnet Baseline Feed Rate
Grundlinjen tilspænding (Rf) blev beregnet ved anvendelse af ligning 2 ved at estimere glucose forbruges i kultur under dyrkningsperioden (tæller) og dividere det med glucosekoncentrationen i foderet medium (C F (R1) med det vejede gennemsnit af N 1 og N 2 fra ligning 1. Denne forbrug sats blev derefter divideret med glukosekoncentrationen (C F) i foderet medium til at beregne den gennemsnitlige medium tilspænding nødvendig for at erstatte glucose forbrugt i samme kultur periode.
(2)
Justering Feed sats med Observerede blodsukkerniveauet
Yderligere blev der foretaget justeringer til baseline tilspænding til at rumme de målte blodsukkerniveauer (C 1) på det valgte tidspunkt ved anvendelse af ligning 3. Denne glukose-justeret tilspænding (GAFR) kan bruges til at opretholde niveauer, når uventede ændringer i vækst eller død forekomme i kulturen. Denne equatio n indarbejdet en kontrol konstant (X), og en værdi på 0,5 blev anvendt til disse data 3. C 1 repræsenterer glucosekoncentrationen målt i dyrkningsmediet på prøven dag, og C D betegner målet medium glucosekoncentration. Den endelige værdi justerer forudsagt tilspænding fra den anden beregning.
(3)
Figur 1: Kontinuerlig Fodring System Diagram med Udstrømning Tube. (A) Diagram over den påviste system. (B) frittet glasfilter anbringes på udmunder at tillade medium, der skal fjernes fra kulturen uden tab af celler. Figur gengivet med tilladelse. 3
/files/ftp_upload/52224/52224fig2.jpg "/>
Figur 2:. Glucose Målinger til SSB, CF-SSB, og korrigerede CF-SSB kulturer (A) Medium glucose målinger fra p-TC6 sfæroide kulturer ved hjælp af statiske, SSB, og CF-SSB dyrkningsmetoder og fodring med standard høj glukose medium. Den kontinuerlige fodring er i stand til at fjerne de glucose udsving, men de gennemsnitlige glucoseniveauer i mediet ændre sig dramatisk i løbet af dyrkningsperioden, og langt over det fysiologiske område (angivet med grå søjle). Den justerede fodring er i stand til at eliminere de udsving samt opretholde de glucosekoncentrationer nær fysiologiske niveauer under hele dyrkningsperioden. Fejllinjer til glukosemålinger er for små til at være synlige på skalaen vist (Standard Error ≤ 4% for alle målinger). Dataene fra tallene præsenteres i tidligere publikation med tilladelse. 3
Figur 3: celletal fra SSB, CF-SSB, og justeret CF-SSB kulturer med vækst Justeret Feed Priser Cellevækst rapporteret som gange ændring i celle nummer i løbet af 21-dages kultur periode sammenligner SSB med regelmæssige mellemstore ændringer mod konstant tilspænding. SSB kulturer og justerede tilspænding SSB kulturer. Fejlsøjler rapporterer standardfejlen på middelværdien, og p-værdier er rapporteret er for en un-parret to-halet Student-t statistisk test. Gengivet med tilladelse. 3
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Generering pattedyrcellelinjer produkter til fremstilling af biologiske agenser og for celleterapi kræver kulturen og overvågning af pattedyrceller i stor skala 55-58. Endvidere disse applikationer kræver definerede og validerede dyrkningsbetingelser. Blot øge mængden af celler ved hjælp af forskning teknologier vil ikke opfylde alle disse krav. Manuelle mellemstore ændringer forårsager udsving i næringsstoffer og ophobning af affaldsstoffer reducere cellernes kvalitet, levedygtighed og udbytte. Anvendelsen af bioreaktorer er veletableret til kommerciel kultur af mikroorganismer til bio-farmaceutiske anvendelser, og lignende strategier er blevet anvendt på mammale cellekulturer. Den komplekse vekselvirkning af mammale celler med deres miljøet kræver specifikke modifikationer til at regulere niveauerne af næringsstoffer for at optimere celleekspansion potentiale.
For at løse disse problemer, har vi udviklet en straightforward metode til at opretholde glucoseniveauer i et specifikt målrettet interval, tilnærmelse fysiologiske niveauer i en omrørt suspension bioreaktor med en justerbar sats perfusion fødemekanisme. For at opnå dette, blev sfæroider af en beta-cellelinje genereret i en omrørt suspension bioreaktor. En perfusion fodring system blev anvendt til at give en kontinuerlig fodring mekanisme til at erstatte standard batch fodring procedurer. Cellevæksthastigheder blev observeret, og anvendt til at forudsige tilnærmelsesvis glucose use satser. Faktiske glucoseniveauer blev også målt over tid i kultur for at justere tilspændinger som reaktion på de faktiske næringsstoffer forbruges og metaboliske produkter deponeret i mediet af cellerne. Denne metode forhindrede udsving i blodsukkerniveauet set med andre statiske og SSB-systemer 3, hvor blodsukkerniveauet varieret voldsomt med medium ændringer hver 3 dage. Brug af batch-fodringsstrategier, glucosekoncentrationer faldt så meget som 275 mg / dl over tre dage, på sent tidspunkts i 21-dages ekspansion. Disse udsving i blodsukkerniveauet begrænset celle udbytte.
Beregning af mediet dækningsgrad for demonstration af den justerede fodring system indbygget en etableret vækstrate og glukose forbrug sats for cellelinie, samt de observerede (målt) kultur tætheder og glucose niveauer på hvert fodringstid-point. For forskellige celletyper, eller til mere komplekse vævskultursystemer kan disse forudsætninger ikke holder stik. At sikre mere præcis glucose kontrol algoritmen omfattede også en feedback-styresystem at tage højde for variabiliteten af individuelle kulturer. Begrænsninger af en perfusion metode baseret på vækstraten alene, herunder følgerne af heterogenitet i glukoseudnyttelse for celler i hele sfæroiderne og ændringer i glukose forbrug baseret på parametre som differentierende stamceller, kan afbødes ved en feedback-styresystem. Afhængig af anvendelsen, celler, der udviser exponential vækstrater eller flere komplekse vækstprofiler kunne gennemføres for at forbedre den algoritme ydeevne. De antagelser og værdier, der anvendes til beregninger tilspænding kan ændres til at overholde aktuelle dyrkningsbetingelser.
De præsenterede fremgangsmåder er beregnet til at producere celler til en terapeutisk anvendelse, i hvilken en udvidelse og kultur af sfæroider ville være for en endelig varighed, og cellerne selv er produktet .. Det kan være ønskeligt for nogle forskere til løbende at udvide eller dyrkede celler ved anvendelse af en lignende fremgangsmåde, men dette ville frembyde andre udfordringer ikke stødt til disse undersøgelser. Hvis dyrket i længere perioder, vil sfæroiderne fortsætte med at vokse i størrelse, og levedygtigheden af nogle celler i kernen af klumpformet kan lide på grund af stigende begrænsninger næringsstoffer og ilt diffusion. Disse kulturer kan kræve yderligere manipulationer for at dissociere store sfæroider at forhindre denne begrænsning når der ønskes langvarige kulturer.Ingen reduktion i levedygtighed blev observeret for sphæroider genereret med denne protokol, hvilket tyder på, at denne grænse ikke er nået i løbet af 21-dages kultur periode med denne undersøgelse.
For cellulære terapier, kan disse teknikker anvendes i kombination med yderligere regulatoriske systemer til forbedring celleudbytte, funktion og levedygtighed. For eksempel kunne SSB-metoden kombineres med lette teknologier, herunder mikro-bæreflade kulturer til adhærente celler til forbedring cellevæksthastigheder eller indkapsling af celler eller sfæroider. Endvidere kunne mere komplekse justering algoritmer skal gennemføres for at give strammere kultur kontrol. Fodring justering kunne kombineres med styring af flere andre parametre, såsom pH, koncentration af opløst ilt, temperatur, og injektion af reagenser at foretage yderligere forbedringer 59,60. For at forbedre resultaterne i andre programmer, kan denne metode automatiseres 15,24, og tilspændinger kan beregnes mmalm eller sjældnere, yderligere raffinering dyrkningsbetingelser.
Produktion processer 61-63 skal defineres og kontrolleres omhyggeligt at gøre reproducerbare biologiske produkter. Anvendelsen af kontinuerte medium udskiftning kan anvendes til at afbøde udsving i kritiske næringsstoffer observeret i skala celle produktion store, og inkorporerer et justerbart fodringssystem kan implementere endnu mere kontrol på cellen miljø, for at opretholde det ønskede niveau af næringsstoffer. Den beskrevne fremgangsmåde kan anvendes med andre pattedyrceller til både cellulære og farmaceutiske produkter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β TC-6 Cells | ATCC, Manassas, VA | CRL-11506 | Mouse Insulinoma cell line (adherent cell type) |
| DPBS No Ca, No Mg | Invitrogen, Carlsbad, CA | 14190-144 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144?ICID=search-14190144 |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | See below for product numbers | |
| DMEM High Glucose (500 mM) | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11965-092 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092 |
| DMEM Low Glucose (100 mM) | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11885-084 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084 (note that this medium already contains pyruvate) |
| L-glutamine | Invitrogen, Carlsbad, CA | 25030081 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-product |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11360070 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070?ICID=search-product |
| Heat Inactivated Porcine Serum | Gibco - Life Technologies | 10082147 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147 |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen, Carlsbad, CA | 25200056 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056?ICID=search-product |
| T-150 Tissue Culture Treated Flasks | Corning, Corning, NY | 430825 | http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=430825(Lifesciences) &categoryname= |
| NuAire Cell culture incubator | Princeton, MN | US Autoflow. Any water-jacketed CO2 regulating cell culture incubator could be used. | |
| Centrifuge | Sorvall RT 7 (Any similar benchtop centrifuge may be used) | ||
| Refrigerator | Any laboratory refrigerator could be used (a small table-top version was used for these studies) | ||
| 1 L Glass Bottle | Corning, Corning, NY | 1395-1L | Any vendor could be used. http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=1395-1L(Lifesciences) &categoryname= |
| 2 L Glass Bottle | Corning, Corning, NY | 1395-2L | Any vendor could be used |
| 250 ml stirred bioreactors | Corning, Corning, NY | 4500-250 | http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=4500-250(Lifesciences) &categoryname= |
| Stir Plate | Fisher Scientific | 11-496-104A | Any incubator safe stir-plate can be used, any vendor |
| Tissue Culture Dishes 100 mm Diameter | Nunc, Rochester, NY (Fisher Scientific) | 1256598 | Any vendor could be used (ordered through Fisher Sci) |
| FALCON 50 ml Conical Tubes | Falcon, San Jose, CA | 1256598 | Any vendor could be used |
| Delran Plastic Used for Custom Parts | McMaster Carr | Various | Any material of choice could be used, but Deran is chosen because it is autoclave safe, non-reactive, and easy to machine. http://www.mcmaster.com/#acetal-homopolymer-sheets/=rjrcac |
| Stainless Steel Pipe for custom lids | McMaster Carr | Various | Any vendor could be used. http://www.mcmaster.com/#standard-stainless-steel-tubing/=rjrd91 |
| Custom Modified Delran Bioreactor Lids for Continuous Feeding | Custom made | Not aware of any vendors producing a similar product | |
| Custom Modified Glass Bottle Lids for Continuous feeding | Custom made | Some vendors (e.g., Fischer Sci, Corning) make similar products in the links below. | |
| Masterflex Digital Peristaltic Pump | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | EW-77919-25 | Any precision peristaltic pump could be used. http://www.coleparmer.com/Product/L_S_Eight_Channel_Four_Roller_ Cartridge_Pump_System_115_230 _VAC/EW-77919-25 |
| PVDF Tubing Connectors (various) | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | see link | Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Category/Cole_Parmer_PVDF_Premium _Luer_Fittings/55889 |
| Pharmed BPT Tubing L/S 16 | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | WU-06508-16 | Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-16 |
| Pharmed BPT Tubing L/S 14 | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | WU-06508-14 | Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-14 |
| Pharmed BPT Tubing L/S 13 | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | WU-06508-13 | Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-13 |
| Millipore Millex GP PES membrane 0.22 µl sterile syringe filter (used for venting, and medium filtration) | Fisher Scientific | SLGP033RS | Any vendor could be used |
| 25 ml Graduated Pipette | Fisher Scientific | 13-678-11 | Any vendor could be used, and various sizes may be used |
| Pipetter | Fisher Scientific | 13-681-15E | Any vendor, or similar product could be used |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-6 | Any vendor, or similar product could be used |
| Trypan Blue | Gibco - Life Technologies | 15250-061 | Any vendor, or similar product could be used. https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15250061 |
| Inverted Light Microscope | Leica | Any vendor, or similar product could be used | |
| One Touch Ultra Blood Glucose Meter | Fisher Scientific | 22-029-293 | Any vendor, or similar product could be used (e.g., Bayer) |
| One Touch Ultra-Strips | Fisher Scientific | 22-029-292 | Any vendor, or similar product could be used (e.g., Bayer) |
References
- Reuveny, S., Velez, D., Macmillan, J. D., Miller, L. Factors affecting cell growth and monoclonal antibody production in stirred reactors. J. Immunol. Methods. 86 (1), 53-59 (1986).
- Tarleton, R. L., Beyer, A. M. Medium-scale production and purification of monoclonal antibodies in protein-free medium. Biotechniques. 11 (5), 590-593 (1991).
- Weegman, B. P., et al. Nutrient regulation by continuous feeding removes limitations on cell yield in the large-scale expansion of Mammalian cell spheroids. PLoS One. 8 (10), e76611 (2013).
- Klueh, U., et al. Continuous glucose monitoring in normal mice and mice with prediabetes and diabetes. Diabetes Technol. Ther. 8 (3), 402-412 (2006).
- Hay, R. J. Operator-induced contamination in cell culture systems. Dev. Biol. Stand. 75, 193-204 (1991).
- Dazey, B., Duchez, P., Letellier, C., Vezon, G., Ivanovic, Z. Cord blood processing by using a standard manual technique and automated closed system "Sepax" (Kit CS-530). Stem Cells Dev. 14 (1), 6-10 (2005).
- Gastens, M. H., et al. Good manufacturing practice-compliant expansion of marrow-derived stem and progenitor cells for cell therapy. Cell Transplant. 16 (7), 685-696 (2007).
- Naing, M. W., Williams, D. J. Three-dimensional culture and bioreactors for cellular therapies. Cytotherapy. 13 (4), 391-399 (2011).
- Stacey, G. N. Cell culture contamination. Cancer Cell Culture. , Methods Mol Biol; 731. Humana Press. Totowa, NJ. 79-91 (2011).
- Zur Nieden, I. N., Cormier, J. T., Rancourt, D. E., Kallos, M. S. Embryonic stem cells remain highly pluripotent following long term expansion as aggregates in suspension bioreactors. J. Biotechnol. 129 (3), 421-432 (2007).
- Kehoe, D. E., Jing, D., Lock, L. T., Tzanakakis, E. S. Scalable stirred-suspension bioreactor culture of human pluripotent stem cells. Tissue Eng. Part A. 16 (2), 405-421 (2010).
- Krawetz, R., et al. Large-scale expansion of pluripotent human embryonic stem cells in stirred-suspension bioreactors. Tissue Eng. Part C. Methods. 16 (4), 573-582 (2010).
- Shafa, M., et al. Expansion and long-term maintenance of induced pluripotent stem cells in stirred suspension bioreactors. J. Tissue Eng. Regen. Med. 6 (6), 462-472 (2012).
- Oh, S. K. W., et al. Long-term microcarrier suspension cultures of human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 2 (3), 219-230 (2009).
- Olmer, R., et al. Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors. Tissue Eng. Part C. Methods. 18 (10), 772-784 (2012).
- Baptista, R. P., Da Fluri,, Zandstra, P. W. High density continuous production of murine pluripotent cells in an acoustic perfused bioreactor at different oxygen concentrations. Biotechnol. Bioeng. 110 (2), 648-655 (2013).
- Papas, K. K. Characterization of the metabolic and secretory behavior of suspended free and entrapped ART-20 spheroids in fed-batch and perfusion cultures [dissertation]. , Georgia Institute of Technology. Atlanta, GA. (1992).
- Papas, K. K., Constantinidis, I., Sambanis, A. Cultivation of recombinant, insulin-secreting AtT-20 cells as free and entrapped spheroids. Cytotechnology. 13 (1), 1-12 (1993).
- Sambanis, A., Papas, K. K., Flanders, P. C., Long, R. C., Kang, H., Constantinidis, I. Towards the development of a bioartificial pancreas: immunoisolation and NMR monitoring of mouse insulinomas. Cytotechnology. 15 (1-3), 351-363 (1994).
- Sharma, S., Raju, R., Sui, S., Hu, W. -S. Stem cell culture engineering - process scale up and beyond. Biotechnol. J. 6 (11), 1317-1329 (2011).
- Papas, K. K., Long, R. C., Constantinidis, I., Sambanis, A. Role of ATP and Pi in the mechanism of insulin secretion in the mouse insulinoma betaTC3 cell line. Biochem. J. 326 (Pt 3), 807-814 (1997).
- Papas, K. K., Long, R. C., Sambanis, A., Constantinidis, I. Development of a bioartificial pancreas: I. long-term propagation and basal and induced secretion from entrapped betaTC3 cell cultures. Biotechnol. Bioeng. 66 (4), 219-230 (1999).
- Papas, K. K., Long, R. C., Sambanis, A., Constantinidis, I. Development of a bioartificial pancreas: II. Effects of oxygen on long-term entrapped betaTC3 cell cultures. Biotechnol. Bioeng. 66 (4), 231-237 (1999).
- Hu, W. S. Cell culture process monitoring and control-a key to process optimization. Cytotechnology. 14 (3), 155-156 (1994).
- Alfred, R., et al. Efficient suspension bioreactor expansion of murine embryonic stem cells on microcarriers in serum-free medium. Biotechnol. Prog. 27 (3), 811-823 (2011).
- Cormier, J. T., zur Nieden, N. I., Rancourt, D. E., Kallos, M. S. Expansion of undifferentiated murine embryonic stem cells as aggregates in suspension culture bioreactors. Tissue Eng. 12 (11), 3233-3245 (2006).
- Dang, S. M., Zandstra, P. W. Scalable production of embryonic stem cell-derived cells. Methods Mol. Biol. 290 (1), 353-364 (2005).
- Elseberg, C. L., et al. Microcarrier-based expansion process for hMSCs with high vitality and undifferentiated characteristics. Int. J. Artif. Organs. 35 (2), 93-107 (2012).
- Kallos, M. S., Behie, L. A. Inoculation and growth conditions for high-cell-density expansion of mammalian neural stem cells in suspension bioreactors. Biotechnol. Bioeng. 63 (4), 473-483 (1999).
- Kehoe, D. E., Lock, L. T., Parikh, A., Tzanakakis, E. S. Propagation of embryonic stem cells in stirred suspension without serum. Biotechnol. Prog. 24 (6), 1342-1352 (2008).
- Kirouac, D. C., Zandstra, P. W. The systematic production of cells for cell therapies. Cell Stem Cell. 3 (4), 369-381 (2008).
- Serra, M., et al. Stirred bioreactors for the expansion of adult pancreatic stem cells. Ann. Anat. 191 (1), 104-115 (2009).
- Chawla, M., Bodnar, C. A., Sen, A., Kallos, M. S., Behie, L. A. Production of islet-like structures from neonatal porcine pancreatic tissue in suspension bioreactors. Biotechnol. Prog. 22 (2), 561-567 (2006).
- Weegman, B. P., et al. Temperature profiles of different cooling methods in porcine pancreas procurement. Xenotransplantation. , (2014).
- Cruz, H. J., Moreira, J. L., Carrondo, M. J. Metabolic shifts by nutrient manipulation in continuous cultures of BHK cells. Biotechnol. Bioeng. 66 (2), 104-113 (1999).
- Dowd, J. E., Jubb, A., Kwok, K. E., Piret, J. M. Optimization and control of perfusion cultures using a viable cell probe and cell specific perfusion rates. Cytotechnology. 42 (1), 35-45 (2003).
- Goudar, C., Biener, R., Zhang, C., Michaels, J., Piret, J., Konstantinov, K. Towards industrial application of quasi real-time metabolic flux analysis for mammalian cell culture. Cell Culture Engineering. 101, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol; 101. Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. 99-118 (2006).
- Hu, W. S., Piret, J. M. Mammalian cell culture processes. Curr. Opin. Biotechnol. 3 (2), 110-114 (1992).
- Knaack, D., et al. Clonal insulinoma cell line that stably maintains correct glucose responsiveness. Diabetes. 43 (12), 1413-1417 (1994).
- Poitout, V., Stout, L. E., Armstrong, M. B., Walseth, T. F., Sorenson, R. L., Robertson, R. P. Morphological and functional characterization of beta TC-6 cells--an insulin-secreting cell line derived from transgenic mice. Diabetes. 44 (3), 306-313 (1995).
- Poitout, V., Olson, L. K., Robertson, R. P. Insulin-secreting cell lines: classification, characteristics and potential applications. Diabetes Metab. 22 (1), 7-14 (1996).
- Suzuki, R., et al. Cyotomedical therapy for insulinopenic diabetes using microencapsulated pancreatic beta cell lines. Life Sci. 71 (15), 1717-1729 (2002).
- Skelin, M., Rupnik, M., Cencic, A. Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research. ALTEX. 27 (2), 105-113 (2010).
- Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nat. Protoc. 2 (9), 2276-2284 (2007).
- Murdoch, T. B., McGhee-Wilson, D., Shapiro, A. M. J., Lakey, J. R. T. Methods of human islet culture for transplantation. Cell Transplant. 13 (6), 605-617 (2004).
- Woodside, S. M., Bowen, B. D., Piret, J. M. Mammalian cell retention devices for stirred perfusion bioreactors. Cytotechnology. 28 (1-3), 163-175 (1998).
- Serra, M., et al. Improving expansion of pluripotent human embryonic stem cells in perfused bioreactors through oxygen control. J. Biotechnol. 148 (4), 208-215 (2010).
- Gálvez, J., Lecina, M., Solà, C., Cairó, J., Gòdia, F. Optimization of HEK-293S cell cultures for the production of adenoviral vectors in bioreactors using on-line OUR measurements. J. Biotechnol. 157 (1), 214-222 (2012).
- Trabelsi, K., Majoul, S., Rourou, S., Kallel, H. Development of a measles vaccine production process in MRC-5 cells grown on Cytodex1 microcarriers and in a stirred bioreactor. Appl. Microbiol. Biotechnol. 93 (3), 1031-1040 (2012).
- Liu, H., et al. A high-yield and scaleable adenovirus vector production process based on high density perfusion culture of HEK 293 cells as suspended aggregates. J. Biosci. Bioeng. 107 (5), 524-529 (2009).
- Zhi, Z., Liu, B., Jones, P. M., Pickup, J. C. Polysaccharide multilayer nanoencapsulation of insulin-producing beta-cells grown as pseudoislets for potential cellular delivery of insulin. Biomacromolecules. 11 (3), 610-616 (2010).
- Lock, L. T., Laychock, S. G., Tzanakakis, E. S. Pseudoislets in stirred-suspension culture exhibit enhanced cell survival, propagation and insulin secretion. J. Biotechnol. 151 (3), 278-286 (2011).
- Marchenko, S., Flanagan, L. Counting human neural stem cells. J. Vis. Exp. (7), e262 (2007).
- Campos, C. Chronic hyperglycemia and glucose toxicity: pathology and clinical sequelae. Postgrad. Med. 124 (6), 90-97 (2012).
- Eve, D. J., Fillmore, R., Borlongan, C. V., Sanberg, P. R. Stem cells have the potential to rejuvenate regenerative medicine research. Med. Sci. Monit. 16 (10), RA197-RA217 (2010).
- Hsiao, L. -C., Carr, C., Chang, K. -C., Lin, S. -Z., Clarke, K. Review Article: Stem Cell-based Therapy for Ischemic Heart Disease. Cell Transplant. , (2012).
- Oldershaw, R. A. Cell sources for the regeneration of articular cartilage: the past, the horizon and the future. Int. J. Exp. Pathol. 93 (6), 389-400 (2012).
- De Coppi, P. Regenerative medicine for congenital malformations. J. Pediatr. Surg. 48 (2), 273-280 (2013).
- Tziampazis, E., Sambanis, A. Modeling of cell culture processes. Cytotechnology. 14 (3), 191-204 (1994).
- Sidoli, F. R., Mantalaris, A., Asprey, S. P. Modelling of Mammalian cells and cell culture processes. Cytotechnology. 44 (1-2), 27-46 (2004).
- Yim, R. Administrative and research policies required to bring cellular therapies from the research laboratory to the patient’s bedside. Transfusion. 45, Suppl 4. 144S-158S (2005).
- Fink, D. W. FDA regulation of stem cell-based products. Science. 324 (5935), 1662-1663 (2009).
- Moos, M. Stem-cell-derived products: an FDA update. Trends Pharmacol. Sci. 29 (12), 591-593 (2008).
