Introduction
Um eine große Zahl von lebensfähigen und funktionellen humanen Zellen für eine Transplantation zu erzeugen, die Regulierung der Kulturbedingungen ist zwingend notwendig. Depletion von Nährstoffen sowie Anhäufung von Stoffwechselschlacken sind die Hauptursachen von Seneszenz und metabolischen Veränderungen, die die Qualität des Zellprodukt 1 reduzieren - 3. Dieses Verfahren veranschaulicht ein Verfahren zur Kultur von Säugerzellen in Sphäroide einen gerührten Bioreaktor mit einer eingestellten Rate Perfusion Zuführsystem Glukose zu regulieren in einem physiologischen Bereich 4 während der gesamten Dauer der Kultur kombiniert werden. Für den Zweck dieser Studien wurde die physiologischen Bereich zwischen 100 und 200 mg / dl definiert. Die gleichen Verfahren können verwendet werden, um andere Nährstoffe und Stoffwechselschlacken regulieren wie Lactat.
Statische Kulturen in kleinen Mengen (1 bis 30 ml) werden typischerweise in der Laborumgebung verwendet zu erhalten und Zelllinien für Experime differenzierenntal Zwecke. Zell Passagierung wird mit vollständigem Medium Änderungen durchgeführt, wie in regelmäßigen Abständen erforderlich. Die meisten "konventionellen" Kulturmedium hat eine hohe Glukosekonzentration (450 mg / dl für DMEM in diesen Studien verwendet) für weniger häufigen Medienwechsel, ohne das Risiko von Nährstoffbegrenzungen zu ermöglichen. Allerdings ist diese batch-Einspeisung Verfahren erfordert noch häufige Manipulation führt Variabilität in der Zellumgebung und erhöht das Risiko einer Kontamination von 5 bis 9. Gerührte Suspension Bioreaktoren (SSB) eine bessere Durchmischung sorgen und verringerte 3,10 Handhabung - 20, aber wie statische Kulturen, erfordern eine manuelle Medium Änderungen, die potenziell schädlichen Schwankungen Nährstoff- und Abfallprodukt Niveaus beitragen. Perfusions-Fütterung von SSB Kulturen reduziert diese Probleme durch eine kontinuierliche Infusion und Entfernung von Medium, aber große Veränderungen in der Nährstoffgehalt aufgrund des Zellwachstums bleiben ein Problem. Die Verwendung einer angepassten Fütterung rate aus Berechnungen der Nährstoffnutzung auf Basis der geschätzten Zell Anforderungen können die stabilen Zellumgebung bieten erforderlich die Lebensfähigkeit der Zellen zu optimieren und Funktion 21-24.
Es gibt eine große Menge an Literatur beschreibt Methoden für skalierbare SSB Kulturen von Säugetierzellen spezifisch für Kultur und Expansion von pluripotenten Zellen 25 - 32, mit anderen auf Insel konzentriert (beta) Zellen 17,33,34, oder die Produktion von biologischen Produkten 24, 35-38. Viele dieser untersuchten Zelltypen können in Sphäroid-Kulturen und spezifische Verfahren für den Zelltyp sollte die Implementierung einer kontinuierlichen Zuführungssystem vor optimiert werden verwendet wird gezüchtet werden. In dieser Demonstration wurde eine Perfusion Fütterungsmethode verwendet , um eine Beta - Zelllinie als Sphäroiden in einem gerührten Bioreaktor 39 gewachsen zu erweitern - 43. Das hier beschriebene Verfahren stellt eineinfache Implementierung Kursanpassungen der Fütterung auf Basis von Messungen off-line Glucose gezielte Kulturbedingungen zu erreichen. Einstellen der Vorschubgeschwindigkeit mit dieser Methode eine physiologische Zuckerspiegel aufrecht zu erhalten ist zu einem Anstieg Zellausbeuten gezeigt. Säugerzellen sind abhängig von einem Schlüsselnährstoff, Glukose, für die Energieproduktion, so dass die Verwendung dieser Zelllinie stellt ein Modell für viele kultivierten Säugetierzellen 44. Darüber hinaus beispielhaft für diese Linie die weitere Komplexität der Beta - Zellen, die Glukose zu chronisch hohen Niveaus von 45 empfindlich sind. Für diese Studie wurden β-TC6 Zellen erlaubt Sphäroide in der Kultur zu bilden , die durchschnittliche Größe der Langerhans'schen Inseln in vivo zu approximieren. Die Perfusionsbioreaktorsystem System 17 - 19,21,46 mit einer Vorschubgeschwindigkeit eingestellt Verbrauch zu Glukose, führte zu physiologischen Bedingungen zu erhalten und höhere Zellausbeuten ohne Veränderungen der Lebensfähigkeit.
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Protocol
1. Zelllinie und Wartung
- Erhalten β-TC6-Zellen (oder eine andere gewünschte adhärenten Säugerzelllinie). In Vorbereitung auf die Studie, Kultur, Passage und kryokonserviert werden die Zellen nach Anbieter Anweisungen.
2. Setzen Sie die kontinuierliche Fütterungssystem
HINWEIS: Die kontinuierliche Zuführung Systemdesign in der folgenden Methode wurde basierend auf ähnlichen Systemen in der Literatur beschrieben 17 - 19,21,47 - 49. Montage des Systems hier verwendet , ist im Detail in einer früheren Veröffentlichung 3 beschrieben.
- Sammeln Sie die Komponenten für das Fütterungssystem benötigt, das aus fünf Hauptkomponenten besteht: ein Mittelreservoir, peristaltische Pumpe, gerührten Bioreaktor, Abfallbehälter und kundenspezifische Schläuche / Probenentnahmeset.
- Stellen Sie den Medienspeicher ein 1 l Glasflasche mit, die Abfallbehälter einen 2 l Glasflasche mit, und die stirred Bioreaktor mit einem Volumen von 250 ml-Glasreaktor (aus dem Regal-Version) verwenden.
- Verwenden Sie eine digitale peristaltische Pumpe oder eine ähnliche Pumpe ist mit einem 8-Kanal Pumpenkopf Trägeraustausch zu steuern.
- Herstellung des Reservoirs und modifizierte Bioreaktor Deckel aus harten und autoklavierbaren Kunststoff mit Edelstahlrohr-Pass-Through-Ports Belüftung durch sterile Filter zur Verfügung zu stellen, und ermöglichen es für den Mitteltransfer zwischen Behälter und Bioreaktoren. Alternativ kaufen spezielle Deckel mit Flussöffnungen von verschiedenen Anbietern.
HINWEIS: Der Bioreaktor Deckel zusätzliche Durchgangs Ports für optionale Mess- und Überwachungssonden (zB Sauerstoffmonitor) enthalten. - Befestigen eines Abflußrohr (OT), hergestellt aus porösem Glas Belüftungsrohre mit einer mittleren Porengröße im Bereich von 40 um bis 60 um und einer Porendichte von 40% auf dem modifizierten SSB Deckel. Alternativ wählen Sie einen anderen Abfluss Rohr auf die spezifischen Anforderungen der Kultur basiert.
HINWEIS: Wählen Sie dieOT Porengröße nur Medium und Zelltrümmer, so dass Zellaggregate in der Kultur zu entfernen (wie 3 für weitere Details in Abschnitt 6 und Veröffentlichung beschrieben).
- Montieren Sie autoklavierbar Infusionsschlauch-Sets aus Polyvinylidenfluorid (PVDF) Schlauchverbinder und dauerhafte Schlauchpumpen. Die Länge des Abschnitts ist abhängig von dem Abstand zwischen den verschiedenen Komponenten.
HINWEIS: Seien Sie besonders vorsichtig, wenn Sie Schlauch Vielfalt der Auswahl Haltbarkeit und Zuverlässigkeit für die Langzeitversuche zu gewährleisten. - Montieren Sie den Schlauchsatz aus drei Teilen: eine Zuleitung, eine Abwasserleitung, und eine Probenleitung.
- Montieren Sie die Zuleitung mit zwei Schlauchdurchmesser (L / S 14 und L / S 13). Verwenden Sie die L / S 14 für den primären Schlauch, der den Abstand aus dem Bioreaktor zu dem Medienspeicher erstrecken wird, und legen Sie eine kurze Länge von L / S 13 in der Mitte der Rohrlänge für den Pumpenteil die entsprechenden PVDF Adapter verwenden.
- Verwenden Sie Standard-PVDF Schlauch-Widerhaken tubing Adapter zwei Stücke von L / S 14 Schläuche auf beiden Seiten der kürzeren Pumpenabschnitt (L / S 13) Schläuche zu verbinden.
HINWEIS: Alternativ dazu könnte die gesamte Rohrlänge sein kleinerem Durchmesser L / S 13 Schläuche, und die gesamte Schlauchlänge ersetzt werden könnte, wenn die Pumpe Schnitt Integrität in Frage.
- Montieren Sie den zweiten Rohrabschnitt für die Abfallentsorgung mit größerem Durchmesser (L / S 16) Schläuche und legen Sie einen kurzen Abschnitt der L / S 14 Schlauch in der Mitte für den Pumpabschnitt. Dies wird in der gleichen Weise wie die Zuleitung Montage PVDF Schlauch-Stachel-Adapter verwenden oder alternativ eine kontinuierliche Länge des gewünschten Pumpenschlauchgröße verwendet und ersetzen, wie gebraucht.
HINWEIS: Wenn die gleiche Pumpe und Pumpenkopf für die Speiseschaltung und dem Abfallkreislauf, der Pumpenabschnitt der Abfallbeseitigung Rohrleitungen verwendet werden, müssen einen größeren Durchmesser als der Pumpenabschnitt der Zufuhrleitung sein. Dies stellt sicher, daß die Entfernung Pumprate schneller ist als die Vorschubgeschwindigkeit, und wird die potent vermeidenial für große Änderungen in der Kulturvolumen und verringert das Risiko von Überlauf. - Bauen Sie die letzte Komponente des Schlauchsets: eine Probe Sammelanordnung.
- Dieses Verfahren beschreibt eine benutzerdefinierte Portsystem montiert Abtasten; alternativ kann eine sterile Probenahmeport von verschiedenen Anbietern erworben werden.
- Konstruieren Sie den Satz von drei kurzen (~ 6 cm) L / S 14 Schlauchlängen verbunden zusammen mit einem T-Typ PVDF-Anschluss und zwei kleine Schlauchschellen an zwei der Schlauchlängen.
- Befestigen eines sterilen Gasfilter für Gasentlüftungs einem der geklemmten Längen und die andere zur Verbindung mit einem sterilen Probenspritze verwendet wird (sterile Gasfilter müssen in einem bio-Sicherheitsschrank nach der Sterilisation so viele Sterilfilter hinzugefügt werden, sind nicht autoklavierbar).
- Verbinden die dritte Ende mit einem Edelstahl-Probenanschluss auf dem Deckel des Bioreaktors befestigt.
- Autoclave die Sampling-Baugruppe, während vor dem Beginn mit dem Bioreaktor verbundenDas Experiment (siehe 3 unten zu Schritt).
- Verwenden Sie diese Montage sterile Proben aus dem Bioreaktor zu sammeln, wie, ohne die kontinuierliche Zufuhr Prozess benötigt.
3. Autoklav Alle Materialien
- Bereiten Sie alle Bioreaktor Komponenten für die Dampfsterilisation.
- Sammeln Sie einzelne Komponenten für die Sterilisation. Medium und Abfallreservoirs (zusammengesetzt aus Schritt 2.1.1), 250 ml Spinnerflasche (ab 2.1.1 montiert), notwendig modifizierte Deckel (zusammengesetzt aus 2.1.3), Abflussrohr (beschrieben in 2.1.4), drei Schlauchsets ( in den Abschnitten 2.2 through2.5), Abflussrohr montiert (wie für kontinuierliche Beschickung erforderlich).
- Montieren Sie Spinnerflasche mit allen Komponenten und sicherzustellen, dass das Ablassrohr fest im Rotationskolben angebracht ist (in Abschnitt 2.1.4 beschrieben), und befestigen Sie den benutzerdefinierten montierten Probenanschluss (Abschnitt 2.5) oder eine andere Sampling-Anschluss an die Oberseite des Deckels .
- Wickeln Sie das gesamte Rührflasche Montage mit Autoclave Verpackungsmaterial und Autoklaven anzeigendes Band. Achten Sie darauf, dass die Umhüllung luftdicht. HINWEIS: Aluminiumfolie oder ähnlichem Material können die einzelnen Enden jeder Zugangsöffnung in dem Bioreaktor Deckel zur Abdeckung verwendet werden, die Sterilität des Verbinders zu bewahren / endet, wenn Abwickeln und wenn nicht mit den Schlauchsets im Inkubator.
- Montieren Sie die modifizierten Deckel des Mediums und Abfallbehälter und dann an die jeweiligen Glasflaschen befestigen. Cover sie Aluminiumfolie und Autoklaven anzeigendes Band.
- Individuell wickeln Sie die Schlauchsets (Abschnitt 2,2-2,5) mit Autoklaven wickeln und Band in der Endmontage zu unterstützen. Aluminiumfolie oder ähnlichem Material können die einzelnen Enden jedes Rohr Sterilität des Verbinders zu erhalten gesetzt zu wickeln verwendet werden / endet, wenn auspackt.
- Autoclave alle verpackt werden ein Standard - Trocken Autoklavzyklus (zB "Gravity" Einstellung mit ~ 15 psi bei 121 ° C für 30 Minuten oder mehr).
HINWEIS: Verwenden Sie nicht steril befestigenFilter vor dem Autoklavieren, wenn sie nicht bestätigt werden Autoklav sicher zu sein.
4. Sphäroidformation
ANMERKUNG: Diese Technik , die den in der Literatur beschriebenen ähnlich ist , 17 - 19,21,50 - 52 für andere Säugetier - Zellkulturen. Alle Verfahren nach der Sterilisation sollte in einer Laminarbox durchgeführt werden und unter Verwendung von sterilen Handschuhen sterilen Bedingungen für die Zellkultur aufrecht zu erhalten.
- Für alle Bedingungen, die Kultur und erweitern β-TC6 Zellen in Standard-adhärente Kulturen (nach Hersteller beschrieben), bis ausreichende Zellmengen erhalten die gewünschte Anzahl von Bioreaktoren zu impfen.
- Bauen Sie die kontinuierliche Zuführung Bioreaktor mit Abflussrohr , wie in Abbildung 1 und beschrieben in Abschnitt 2 gezeigt und Probenanschluss zu Probenahme Deckel verbinden. HINWEIS: Die Abflussrohr und Probenahme-Baugruppe sollte der Bioreact hinzugefügt werdenoder für die kontinuierliche Beschickung vor der Sphäroidbildung, und sollte aus dem Kulturmedium gezogen werden, bis kontinuierliche Zuführung gestartet.
- Sterilisieren Sie die modifizierte SSB Montage von Autoklaven (beschrieben in Abschnitt 3).
- Bringen Sie sterile Lüftungsöffnungen (0,22 & mgr; m oder kleiner Sterilfilter) an die entsprechenden Stellen auf den Deckeln der Spinnerflasche und Medium und Abfallbehälter.
ANMERKUNG: Dies ist wichtig , Dampfsperre zu verhindern, und der Gasaustausch zwischen dem Inkubator (5% CO 2) Umwelt und den Bioreaktor zu ermöglichen. Der Gasaustausch notwendig ist, den richtigen pH-Wert zu halten, wenn bikarbonatgestützte Medien.
- Sammle die Zellen durch vorsichtiges Trypsinisierung unter Verwendung von 0,25% (w / v) Trypsin - 0,53 mM EDTA - Lösung, bei Raumtemperatur durch mechanisches Rühren Aided für 2 - 3 min und Samen in Bioreaktoren mit einer Dichte von etwa 1,3 x 10 6 Zellen / ml in 200 ml Kulturmedium.
- Bewegen Sie bezeichneten Kolben aus dem Inkubator undin ein Bio-Sicherheitsschrank.
HINWEIS: Alle Zellkultur und Manipulationen sollten in einem Bio-Sicherheitsschrank unter Verwendung geeigneter steriler Technik erfolgen. - Entfernen Kulturmedium aus den Kolben durch Absaugen.
- Waschen Zellen durch Pipettieren von 5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (ohne Ca ++ oder Mg ++), in den Kolben und über die Zellen auf der Oberfläche gespült und dann auf die PBS anzusaugen.
- 3 ml Trypsin-EDTA - Lösung in jeden Kolben , die ( in der Regel etwa 10x 175 cm 2 T-Kolben) gesammelt werden.
- Lassen Sie geernteten Zellen für 2 bei Raumtemperatur inkubiert - 3 min in der Bio-Sicherheitsschrank.
- Agitieren vorsichtig von Hand Zellen aus Flaschenoberfläche zu lösen, und sammle die Zellen durch Zugabe von 6 ml Kulturmedium (mit Serum) in den Kolben, und übertragen die Zellen in ein 50 ml Röhrchen. Wenn ein 50-ml-Röhrchen voll ist, eine weitere 50-ml-Röhrchen verwenden, bis alle benötigten Zellen gesammelt wurden (etwa ein 50-ml-Tube für jeweils 5 T-175-Kolben benötigt werdengesammelt).
- Zentrifuge vorsichtig (ca. 50 x Schwerkraft) die gesammelten Zellsuspensionen, die Zellen zu pelletieren.
- Saugen Sie das restliche Medium verlässt das Pellet intakt.
- Sammle alle Zellen in einem einzelnen Rohr durch erneutes Suspendieren der Pellets in Kulturmedium (mit Serum) mit einer Pipette, und Transferieren alle Pellets in dem gleichen Röhrchen.
- Zählen Sie die Zelldichte einen Standard Hemocytometer mit Trypan - Blau - Färbung , wie in der Literatur 53 beschrieben.
- Hinzufügen gewünschte Anzahl von Gesamtzellen SSB für jede Bedingung zu steril (1,3 x 10 6 Zellen / ml war die gezielte Ausgangszelldichten für diese Demonstration).
- Hinzufügen Medium (mit der gewünschten Glukosekonzentration, in diesem Fall wir Medium Glucosespiegel im physiologischen Bereich verwendet), um eine Pipetten SSB mit der gewünschten Gesamtkulturvolumen zu erreichen (200 ml Kulturvolumen für diese Studien verwendet wurde).
HINWEIS: Für diese kontinuierlich gefüttert SSB die cu studiert ltures wurden ausgesät eine modifizierte "low-glucose" Version des Kulturmediums (100 mg / dl) gemessen. Dadurch konnten die Kulturen eher an der gewünschten Zielglucosekonzentration zu beginnen, als mit einem "High-glucose" Medium starten und warten auf den Glukoseverbrauch der Glukosespiegel nach unten in den physiologischen Bereich zu bringen Fütterung zu beginnen. Alle anderen Mittel für die in diesen Studien verwendet Einspeisen den Standard "high-glucose" Medium (500 mg / dl). - Bewegen Sie SSB mit Zellen auf einer Rührplatte in einer Zellkultur-Inkubator.
- Bewegen Sie bezeichneten Kolben aus dem Inkubator undin ein Bio-Sicherheitsschrank.
- Kulturzellen in den Bioreaktoren ohne bei 37 ° C für 3 Tage zugeführt wird , mit 5% CO 2, 100% relative Luftfeuchtigkeit und einer Rührgeschwindigkeit von 70 Upm Sphäroide zu ermöglichen zu bilden.
HINWEIS: Keine signifikante Proliferation sollte während der dreitägigen Sphäroidformation Zeitraum beobachtet werden. - Nach Sphäroidformation, teilen Sphäroiden unter Bioreaktoren mit den gewünschten Kulturbedingungen.
- unter Verwendung von sterilen Techniken (- 4 Schritte 2) Autoklaven oder in Gas alle Komponenten zu sterilisieren, und in einem biologischen Sicherheitsschrank montieren.
- Nach Sphäroidbildung, das SSB aus dem Inkubator entfernen und die Komponenten für die kontinuierliche Zuführungssystem in einem biologischen Sicherheitsschrank montieren.
- Zuerst füllen Sie das frische Mittelreservoir mit dem gewünschten Kulturmedium, und dann auf eine Seite der Zuleitung zu verbinden. Achten Sie auch darauf, dass das frische Medium Reservoir ordnungsgemäß mit einem Sterilfilter entlüftet wird.
- Verbinden der einen Seite der Zuleitung zu der Zufuhreinlassöffnung auf dem Bioreaktor in einer sterilen Weise. Ein Sterilfilter sollte zwischen der Speiseleitung und dem Bioreaktor Einlassöffnung zu filtern, um das Medium installiert werden, bevor es in den Bioreaktor eintritt.
- Schließen Sie die Abwasserleitung in den Bioreaktor Abflussrohr und dem Medium Abfallbehälter, und sicherzustellen, dass die Abfallbehälter ordnungsgemäß mit einem steril entlüftetE-Filter.
- Bewegen Sie die Baugruppe aus dem biologischen Sicherheitsschrank (dies wird wahrscheinlich zwei Menschen verlangen, dass alle der Gefäße und Schläuche zu tragen), und setzen Sie alle Komponenten aus für Langzeitkultur.
- Setzen Sie die SSB auf der Rührplatte innerhalb des Inkubators die gleichen Kulturparameter für Sphäroidformation mit (37 ° C, 5% CO 2, 100% Luftfeuchtigkeit und 70 Umdrehungen pro Minute). Hinweis: Es kann erforderlich sein, die Schlauchsegmente aus dem Bioreaktor zu trennen, wenn die Leitungen durch Löcher in der Seite des Inkubators ausgeführt werden müssen, anstatt nach außen durch die Dichtung in der Tür. Dies kann durch Umwickeln der Enden der Schlauchsets mit Aluminiumfolie vor dem Autoklavieren (Schritt 3) in einem aseptischen Weise durchgeführt werden und warten, um die Bioreaktorseite der Zu- und Ablaufrohrabschnitte zu befestigen, bis der Bioreaktor im Inkubator ist. Die Rohrleitungen können in Kraft gesetzt werden, und die Aluminiumfolie kann innerhalb des Inkubators und schnell an dem Bioreaktor entfernt werden.
- Führen verbleibenden Enden der Schlauchsets (die, die nicht in den Bioreaktor Deckel verbunden) heraus durch den Inkubator Zugangsöffnung (pass-through) oder durch eine Einkerbung in dem Inkubator Türdichtung.
- Außerhalb des Inkubators (in einem nahe gelegenen Biosicherheitsschrank wenn möglich), schnell die Zuleitung zum frischen Mittelreservoir zu verbinden, und die Abfallleitung zu dem Medium Abfallbehälter, und sicherzustellen, dass die Abfallbehälter ordnungsgemäß mit einem Sterilfilter entlüftet wird. HINWEIS: Um dies zu tun in einer aseptischen Weise, entfernen Sie die Aluminiumfolie aus dem Schlauch und Behälter-Anschlüsse und eine Verbindung zu den jeweiligen Schiffe so schnell wie möglich (vor allem, wenn diese Verbindung außerhalb des Biosicherheitsschrank getan werden muss).
- Setzen Sie frische Mittelreservoir (mit der gewünschten Fördermedium gefüllt) im nahe gelegenen Mini-Kühlschrank. Überprüfen Sie, um sicherzustellen, dass die Zu- und Ablaufleitungen der Lage sind, den Inkubator zu beenden und den Kühlschrank geben, ohne das Schließen an jeder der Türen verhindern. Es ist auch wichtig, dass die Vorschub lines nicht durch die Türen von entweder dem Kühlschrank oder dem Inkubator geschlossen gekniffen.
HINWEIS: Das Medium für diese Studien verwendet wurde, war die Standard-Hoch Glucose (500 mg / dl) Kulturmedium durch den Anbieter für diesen Zelltyp empfohlen. Alle hohen Glucosemedium könnte auf die spezifischen Bedürfnisse der Zelltyp verwendet werden, die kultiviert wird. Die Glucosekonzentration des Fütterungsmediums sollte vernünftigerweise höher (2x oder mehr) sein, als die gewünschte Konzentration in der Kultur als das Zuführungssystem beruht, um die Vorschubgeschwindigkeit von hohen Glucosemedium auf die Erhöhung ausreichende Glucosespiegel in den Kulturen zu erhalten, während vernünftige Vorschübe Beibehaltung . - Als nächstes kann die Abfallmittelreservoir auf der Tischplatte in einer günstigen Lage außerhalb des Inkubators gestellt werden.
- Als nächstes legen Sie die "Pumpenteil" der Zu- und Ablaufleitungen in den Pumpenkopf die richtige Ausrichtung zu gewährleisten, so dass die Zuleitungen Medium aus dem frischen Medium Reservoir in den SSB, und die Abfallleitungen pumpenwird Medium aus dem SSB und dem Abfallmedienspeicher zu pumpen.
- Schalten Sie die Pumpe auf den gewünschten Vorschubgeschwindigkeit.
- Berechnen Sie die Vorschubgeschwindigkeit Gleichung mit der eingestellten Vorschubgeschwindigkeit in der Literatur beschriebenen 3 und in der vorgesehenen repräsentativen Ergebnissen Abschnitt weiter unten.
- Verwenden, um die neuesten Informationen Zellzahl (Verfahren beschrieben in Schritt 5) zusammen mit dem Wachstumsvorhersage, und das Medium Glucose-Messungen, um die Vorschubgeschwindigkeit zu schätzen, um die gewünschte Glukosekonzentration in der Kultur zu erhalten.
HINWEIS: Die Zellwachstumsraten und Glukoseverbrauch Raten müssen vor erhalten werden, um diese Verfahren zu tun. - Stellen Sie die Pumpendrehzahl auf der Basis der berechneten Vorschubgeschwindigkeit.
- Wiederholen Sie die Berechnung der Vorschubgeschwindigkeit und stellen Sie die Pumpendrehzahl für jeden Probenpunkt (alle drei Tage für die beschriebene Methode).
6. Zellzahlen, Viability und Glucosekonzentration Messungen
<ol>- Beim Verlassen des kontinuierlich zugeführt SSB innerhalb des Bioreaktors, befestigen Sie eine sterile Spritze (5 ml Volumen Spritze für diese Untersuchungen verwendet wurde), um ungefilterte Verbindung des Probenanschluss.
- Bewegen Sie das Probenrohr nach unten in das Kulturmedium.
- Ausspannen Rohrabschnitt an der Spritze geht, und ziehen Sie die Gesamtprobenvolumen gewünscht.
- Bewegen Sie das Probenrohr nach oben, so dass sie nicht mehr in die Kultur eingetaucht ist, und weiterhin die Spritze zurückzuziehen, bis Luft entfernt wird.
- Klemmen Sie den Schlauch, der die Spritze speist, und nehmen Sie die Spritze mit der Probe, und beiseite stellen.
- eine zweite frische sterile Spritze mit Luft Vorbelastung und auf den Sterilfilter Seite des Probenanschluss befestigen.
- Ausspannen Rohr an der Spritze Filterseite gehen vondie Sampling-Port und dann zu spülen, Probenanschluss, indem Sie vorsichtig die Luft in der Spritze durch den Sterilfilter Austreiben. Dadurch wird sichergestellt, dass die Probenahme-Port eines beliebigen Rest Medium klar sein wird.
- Re-Klemme das Rohr auf den Filter gehen, trennen Sie die sterile Spritze und entsorgen.
- In Medium (mit Serum) zudie Probe zur Verdünnung nach Bedarf.
- Zählen Sie die Zellen, und berechnen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen durch die Aufnahme von Live (ungefärbten) Zellen, und tot (gefärbt) Zellen unabhängig (Lebensfähigkeit% = lebende Zellen / Gesamtzellen).
- Nehmen Sie Glukosemessungen, wie durch die Zuckermessgerät Anweisungen Ersetzen des Kulturmediums für Blut beschrieben.
- Tauchen Sie den Teststreifen in dem Medium zu prüfen (gesammelt aus Zählung Proben oben), und wiederholen Sie für die gewünschte Anzahl von Wiederholungen (drei Wiederholungen werden empfohlen).
- Testen Sie sowohl das frische Medium und Abfallmedium für Glukosekonzentrationen.
HINWEIS: Bei einigen Metern Messungen niedriger als 20 mg / dl (detektierbaren Schwellwert des Zählers), kann als ein Fehler in dem Zähler-Ausgang beobachtet werden.
7. Sphäroid Sinkgeschwindigkeit Messungen
- Um sicherzustellen, dass cell-Cluster sind nicht durch die kontinuierliche Zuführungssystem entfernt wird, messen die Absetzgeschwindigkeit von β-TC6 Sphäroide durch Beobachtung ihrer Sedimentation in einem großen Durchmesser Plastikpipette.
- Kultur β-TC6 Zellen in Bioreaktoren SSB Sphäroiden zu bilden, wie oben beschrieben.
- Nach 3 Tagen Kultur nehmen 30 ml-Proben der Sphäroid Suspension und in einen 50-ml-Tube.
- Pipettieren up sanft und unten einen breiten Durchmesser 25 ml Pipette gleichmäßig in Suspension zu verteilen, stoppen dann Pipettieren mit der Suspension in einem bekannten Niveau in der Pipette (zB 20 - ml - Markierung) und dann die Zeit für alle von den Sphäroiden aufnehmen zu 5 cm begleichen.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang oft genug statistische Sicherheit zu erreichen (in der Regel n> 3).
HINWEIS: Für biologische Studien, einem p-Wert von weniger als 0,05 wird als statistisch signifikant zu sein, wenn Messungen verglichen werden. Der Standardfehler des Mittelwerts wurde für die Berichterstattung Fehler verwendet, und die zwei nicht-paarigen Student-t-Test tailedwurde verwendet, um Bedingungen für die dargestellten Daten zu vergleichen.
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Representative Results
Medium Zuckerwerte und Schwankungen einschränken Zellexpansion in Standard - SSB Kulturen
Die Glucosespiegel schwanken in statischen Kulturen und SSB Kulturen auf der ganzen Kulturdauer 3. Diese Schwankungen intensivieren mit zunehmender Zellzahl während der 21-tägigen Züchtungsperiode und waren fast identisch in sowohl statische als auch SSB Kulturen. Diese Beobachtungen werden in unserer früheren Veröffentlichung 3 dargestellt. Die Glucosespiegel für die Dauer der Kulturperiode für beide Methoden super-physiologischen sein. Da diese chronische Exposition Zelle 54 Wachstum hemmen kann, wurde eine kontinuierliche Fütterung System entwickelt , um Zuckerschwankungen zu beseitigen und Nährstoffkontrolle während der Sphäroid Kultur zu verbessern.
Kontinuierliche Fütterungssystem für Sphäroid - Kultur
Kontinuierliche Zugabe von frischem Medium und alte Medium für die Dauer der Kulturperiode zu entfernenkann unter Verwendung eines einfachen Systems Medium Nachfüllung erfolgen. Das beschriebene System in Methode 2 und in Abbildung 1 verwendet gesetzt , eine Pumpe und Schläuche gezeigt kontinuierlich Medium und einen separaten Abfluss Rohr wieder aufzufüllen , um kontinuierlich Medium zu entfernen , während die Entfernung von Sphäroiden aus der Kultur zu verhindern. Der mittlere Einlass war auf der gegenüberliegenden Seite des Reaktors mit der richtigen Funktion des OT von störenden, jede Möglichkeit zu minimieren und für eine gute Durchmischung zu ermöglichen. Frisches Medium (mit hohem Glucose, 450 mg / dl) wurde bei Kühlschranktemperatur gehalten Langzeitstabilität zu gewährleisten und kontinuierlich mit einem Vollmedium Ersatzrate zu der Kultur durch ein Medium Einlass hinzugefügt alle drei Tage die Nährstoffe nachzufüllen. Dieses System begrenzt die Manipulationen und Intervention während der Kulturperiode erforderlich durch das manuelle Batch - Medium Austauschprozess mit einem kontinuierlichen Prozess 3,22,23 ersetzen. Das kalte Medium trat in den Bioreaktor in kleinen Mengen über time (0,046 ml / min), bezogen auf die Gesamtkulturvolumen (200 ml), die jeweils "drop" von zugegebenem Medium Zeit, um Temperatur mit der umgebenden Kulturmedium zu äquilibrieren, die bei 37 ° C war. Dies gewährleistet, daß das zugegebene kalte Medium nicht die gesamte Kulturtemperatur reduzieren im Inkubator gehalten wurde. Rühren des Kulturmediums, auch die Wärmeübertragungseffizienz erhöht und Temperaturgleichförmigkeit in diesen Kulturen verbessert. Temperaturerhaltung könnte ein Problem sein, wenn sehr hohe Vorschubraten mit kleinen Kulturvolumina verwendet wurden, aber diese unwahrscheinlichen Bedingungen waren nicht für diese Studien getestet. Das Kulturvolumen wurde auf einem konstanten Niveau in dem kontinuierlichen Fütterungssystem aufrechterhalten, indem sichergestellt wird, dass der durchschnittliche mittlere Abtragungsrate zur Zufuhrrate entsprach. Das System für diese Studien verwendet, tatsächlich entfernt Medium bei einer höheren Strömungsgeschwindigkeit als die Vorschubgeschwindigkeit, da die Entfernung Schlauchabschnitt verwendet größeren Durchmesser Schlauch für den Pumpenabschnitt. Trotz der schnelleren removal Rate wurde das Kulturvolumen durch Anpassen des Pegels des Abflußrohr im Inneren des Reaktors auf die gewünschte Kulturvolumen Pegel gehalten. Kontinuierliche Zugabe von frischem Medium zu der SSB in einem geringen Anstieg in der mittleren Ebene in den Reaktor geführt, und wenn das Medium den Pegel des OT erreicht wurde das Medium aus dem Reaktor mit einer schnelleren Rate entfernt wird. Das Medium wurde durch das poröse Glas OT entfernt, wodurch die Zelle Sphäroiden in Kultur zu verlassen, bis das Medium Ebene unterhalb der Unterseite des OT fiel. Dieses System verhindert die Komplexität von tenuous Strömung und Volumensensoren die Pumpengeschwindigkeiten zu steuern, und ist der Standard für den Einsatz mit vielen SSB basierten Kulturapparat 47,48. Der OT wurde entwickelt, um sicherzustellen, dass Sphäroide wurden nicht aus der Kultur durch die Entfernungsschaltung entfernt, und die Porengröße und Dichte im Frittenglasrohr waren groß genug ist (40% und 40 - 60 & mgr; m jeweils), um sicherzustellen, daß die lineare Strömungsgeschwindigkeit uns war geringer als die Absetzgeschwindigkeit der Sphäroideed für diese Kulturstudien. Die lineare Strömung berechnet wurde , wie im Detail 3 beschrieben. Die durchschnittliche lineare Geschwindigkeit Medium durch die Poren in der OT berechnet 0,17 cm / min, und dies war viel langsamer ist als die langsamste beobachteten Sphäroid Absetzgeschwindigkeit. Die durchschnittliche Sinkgeschwindigkeit wurde in Verfahren 7 und war 2,53 ± 0,26 cm / min für die verwendeten Sphäroiden in diesen Studien beschrieben, gemessen. Die Sphäroiden wurden beobachtet in der Größe zu erhöhen, wie die Kultur fortschreitet, und diese größeren Sphäroiden besiedelt schneller aufgrund ihrer erhöhten Masse-Widerstand-Verhältnis, die die Möglichkeit der Entnahme durch das OT weiter verringert. Einige Sphäroiden wurden in den unteren Poren an den Außenkanten des OT gefangen, aber dies war in erster Linie durch mechanische Kollision, wenn das Ablassrohr in das gerührte Medium eintaucht. Dies hinderte nicht ordnungsgemäße Funktion des OT, und nicht zu einer meßbaren Verlust von Sphäroiden in den getesteten Kulturen beitragen. Das OT für diese Studien wurde nach jeder Studie gereinigt, (mit DI-Wasserspülung), und nach der Verwendung für zwei Kulturstudien ersetzt das Risiko einer verminderten Funktion zu vermeiden. Das OT nach jeder Untersuchung durchgeführt werden könnte, wenn Sphäroide beobachtet werden während einer bestimmten Studie, die die Poren verstopfen (dies wurde in der vorliegenden Arbeit beobachtet). Aufgrund der zyklischen Entfernen des Mediums unter Verwendung dieses Verfahrens, das Medium Kulturvolumen um bis zu 6% schwankte. Die Schwankungen wurden durch die Oberflächenspannung des Mediums verursacht, dass die OT ein bisschen mehr Medium nach dem durchschnittlichen mittleren Niveau fiel unter dem Boden des OT zu entfernen erlaubt.
Die Beseitigung von Nährstoffen Schwankungen Verbesserte Zellwachstum in SSB Kulturen
Kontinuierlich Ersetzen des Mediums in SSB Kulturen das System unter Verwendung der oben erhöht Kulturausbeuten während der Kulturperiode von 21 Tagen beschrieben, im Vergleich zu den Standard-SSB Kulturen. Die Zufuhrrate wurde mit einer Rate konstant während des gesamten Kultivierungsperiode aufrechterhalten, die die gesamte Kultur Volu ersetztmich alle drei Tage zu sein, vergleichbar mit den Batch-fed SSB Kulturen. Eliminieren der Nährstoffschwankungen in einer Erhöhung der Zellausbeuten zur Folge (Figur 3) trotz der hohen Glucosekonzentration 3. Sphäroid Größe wurde auch am Ende der Kulturperiode von 2D - mikroskopische Beurteilung (Standard - Lichtmikroskopie in der Literatur beschrieben 3) gemessen, und die Sphäroiden in CF-SSB Kulturen waren signifikant größer (p <0,02, Student-t - Test) , dass in statischen oder Standard - SSB - Kulturen wie in der Literatur 3 berichtet. Diese Beobachtungen unterstützen die Zellzahl-Daten darauf hindeutet, eine höhere Wachstumsrate in CF-SSB Kulturen, während die Lebensfähigkeit auf dem gleichen hohen Niveau (96,23 ± 0,85%), unabhängig von Kulturbedingungen gehalten wurde. Die kontinuierlich zugeführt SSB (CF-SSB) Kultursystem eliminiert die Nährstoff Schwankungen in Sphäroid-Kulturen und Zellwachstumsraten verbessert, aber die Zuckerspiegel blieb super-physiologischen die noch weiter verhindert haben kann imp rovement in Zellexpansion (Abbildung 2). Weiter zu verbessern, auf der CF-SSB Kultursystem wurde ein Algorithmus verwendet, um die Vorschubgeschwindigkeit während des Kulturzeitraums mit dem Ziel der Verbesserung der Kontrolle der Glucosespiegel in SSB Kulturen anzupassen.
Die Berechnung der eingestellte Vorschubgeschwindigkeit
Mehrere Faktoren können für die Berechnung der Vorschubgeschwindigkeit aufrechtzuerhalten konsistente Glucosespiegel berücksichtigt werden. Die spezifischen Faktoren von Interesse für eine gegebene Studie und für eine bestimmte Zelllinie verändert werden. Für den Zweck dieser Demonstration, betrachteten wir Wachstumsrate und des Glucoseverbrauchs von früheren Kulturen bestimmt, sowie die tatsächlichen Glukosespiegel zum Zeitpunkt der Einstellung 3. Vorschub Anpassungen können in beliebigen Intervallen in der Zeit gemacht werden. Für diese Demonstration wurden Proben gesammelt und die Beschickungsrate wurde alle drei Tage auf der Grundlage der sequentiellen Berechnungen beschrieben wie folgt eingestellt.
t "> Berechnung der vorausgesagte WachstumsrateGleichung 1 sagt die das Zellwachstum während einer bestimmten Periode der Kultur, mit der vorhergesagten Zellzahl (N 2) , die die erwartete Gesamtzahl der Zellen in Kultur zu einem bestimmten Zeitpunkt in der Zukunft. Dieses Verfahren verwendet eine lineare Wachstumsrate Approximation wo die aktuelle Zellzahl (N 1) der geschätzten Wachstumsrate der Zellen in Sphäroid - Kulturen zugegeben wird (R g) multipliziert mit der Kulturperiode (t 2 -t 1).
(1)
Berechnete Basis Vorschub
Die Baseline - Zufuhrrate (R F) wurde unter Verwendung von Gleichung 2 berechnet , indem die Glucose in der Kultur während der Kulturperiode (Zähler) verbraucht Abschätzen und durch die Glukosekonzentration im Zufütterungsmedium (C F Dividieren 1) durch den gewichteten Durchschnitt der N 1 und N 2 aus Gleichung 1 wurde Verbrauchsrate multipliziert wird dann durch die Glucosekonzentration geteilt (C F) im Fördermedium die durchschnittliche mittlere Vorschubgeschwindigkeit zu berechnen benötigt, um die Glukose in der gleichen Kulturperiode verbraucht zu ersetzen.
(2)
Einstellen Vorschub mit Beobachtete Zuckerspiegel
Weitere Anpassungen wurden an der Basislinie Vorschubgeschwindigkeit aus der gemessenen Glukosespiegel (C 1) bei der gewählten Zeitpunkt 3. kann verwendet werden , um diese Glucose-eingestellte Vorschubgeschwindigkeit (GAFR) unter Verwendung von Gleichung aufzunehmen Niveau zu halten , wenn unerwartete Veränderungen im Wachstum oder Tod auftreten, in der Kultur. Diese equatio n inkorporiert eine Regelungskonstante (X), und ein Wert von 0,5 wurde für diese Daten 3 verwendet. C 1 steht für die Glukosekonzentration im Kulturmedium auf der Probe Tag gemessen, und C D den Zielmedium Glucosekonzentration. Der Endwert stellt die vorhergesagte Vorschubgeschwindigkeit von der zweiten Berechnung.
(3)
Abbildung 1: kontinuierliche Zufuhr Systemdiagramm mit Auslassrohr. (A) Schematische Darstellung des Systems gezeigt. (B) Frittenfilter Glas auf Abflußrohr gegeben , damit Medium aus der Kultur ohne Verlust von Zellen entfernt werden. Wiedergabe mit Genehmigung. 3
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Abbildung 2:. Glukosemessungen für SSB, CF-SSB, und das bereinigte CF-SSB Kulturen (A) Medium Zuckermessungen aus β-TC6 Sphäroid - Kulturen unter Verwendung von statischen, SSB, und CF-SSB Kulturmethoden und mit den üblichen hohen Glucosemedium zuzuführen. Die kontinuierliche Zufuhr ist in der Lage, die Zuckerschwankungen, aber die durchschnittliche Glukosespiegel im mittleren Änderung während der Kulturperiode dramatisch zu beseitigen und die weit über dem physiologischen Bereich (von der grauen Leiste angezeigt). Die eingestellte Vorschub der Lage ist, die Schwankungen sowie Aufrechterhaltung der Glucosekonzentrationen in der Nähe von physiologischen Konzentrationen für die Dauer der Kulturperiode zu eliminieren. Die Fehlerbalken für Glukosemessungen sind zu klein, auf der Skala sichtbar gezeigt werden (Standardfehler ≤ 4% für alle Messungen). Die Daten aus den Figuren ist in früheren Veröffentlichung mit Genehmigung vorgelegt. 3
Abbildung 3: Zellzahl von SSB, CF-SSB und das bereinigte CF-SSB Kulturen mit Wachstum bereinigt Vorschubgeschwindigkeiten Zellwachstum berichtet als fache Veränderung der Zellzahl während der 21-tägigen Kulturperiode Vergleich SSB mit regelmäßigen Medium Veränderungen gegenüber konstanten Vorschubgeschwindigkeit. SSB Kulturen und eingestellte Vorschubgeschwindigkeit SSB Kulturen. Die Fehlerbalken berichten über den Standardfehler des Mittelwerts, und p-Werte berichtet sind für eine un-gekoppelten zweiseitigen Student-t statistischen Test. Wiedergabe mit freundlicher Genehmigung. 3
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Discussion
Erzeugen von Säugerzellprodukten für die Herstellung von biologischen Wirkstoffen und für die Zelltherapie erfordert die Kultur und Überwachung von Säugetierzellen in großem Maßstab 55-58. Außerdem rufen diese Anwendungen für die Kulturbedingungen definiert und validiert. Erhöhung einfach das Volumen der Zellen Forschungstechnologien werden alle diese Anforderungen nicht erfüllen. Manuelle Medium Änderungen Schwankungen an Nährstoffen und Anhäufung von Abfallprodukten reduzieren Zellqualität, Rentabilität und Ertrag zu verursachen. Die Verwendung von Bioreaktoren für die kommerzielle Kultur von Mikroorganismen für die bio-pharmazeutische Anwendungen gut etabliert, und ähnliche Strategien auf Säugetierzellkulturen angewendet worden. Das komplexe Zusammenspiel von Säugerzellen mit ihrer Umgebung erfordert spezifische Modifikationen Nährstoffmengen zu regulieren, um Zellexpansionspotenzial zu optimieren.
Um diese Probleme anzugehen, haben wir ein straightforward Verfahren Glukosespiegel in einem bestimmten Zielbereich annähert, physiologische Werte in einer gerührten Suspension Bioreaktor mit einer einstellbaren Geschwindigkeit Perfusions-Zuführungsmechanismus zu halten. Um dies zu erreichen, Sphäroide einer Beta-Zelllinie wurden in einer gerührten Suspension Bioreaktor erzeugt. Ein Perfusion Fütterungssystem wurde eine kontinuierliche Fördermechanismus zu ersetzen Standard-Batch-Fütterungsverfahren zur Verfügung zu stellen eingesetzt. Zellwachstumsraten beobachtet wurden, und verwendet ungefähre Glukose Verwendung Raten vorherzusagen. Tatsächlichen Glukosespiegel wurden ebenfalls über die Zeit in der Kultur gemessen Vorschübe in Reaktion auf die tatsächlichen Nährstoffe verbraucht und Stoffwechselprodukte abgelagert in dem Medium von den Zellen einzustellen. Dieses Verfahren verhindert die Schwankungen der Glucosespiegel mit anderen statischen und SSB - Systemen gesehen 3 , in dem Glukosespiegel mit Mediumwechsel alle 3 Tage dramatisch schwanken. Mit Hilfe der Batch-Fütterungsstrategien sank Glukosekonzentrationen so viel wie 275 mg / dl über drei Tage, im späten Stadiums im 21-Tage-Expansion. Diese Schwankungen der Glucosespiegel begrenzt Zellausbeute.
Berechnung des Mediums Ersatzrate für Demonstrations des angepassten Zuführsystem eine etablierte Wachstumsrate und Glucoseverbrauchsrate für die Zelllinie, sowie die beobachteten (gemessenen) Kulturdichten und Glukosespiegel bei jeder Fütterungszeitpunkt aufgenommen. Für verschiedene Zelltypen oder für komplexere Gewebekultursystemen können diese Annahmen nicht zutreffen. Um sicherzustellen, genauere Glukosekontrolle umfasste der Algorithmus auch ein Rückkopplungssteuersystem zur Berücksichtigung der Variabilität der einzelnen Kulturen. Einschränkungen eines Perfusionsmethode auf die Wachstumsrate basiert allein, einschließlich der Auswirkungen der Heterogenität in Glucoseverwertung für Zellen in den Sphäroiden und Veränderungen der Glucoseverbrauch basierend auf Parametern wie beispielsweise Differenzierung Stammzellen, kann durch ein Rückkopplungssteuersystem gemildert werden. Je nach Anwendung können Zellen, die Expone aufweisenntial Wachstumsraten oder komplexere Wachstumsprofile könnte den Algorithmus zur Verbesserung der Leistung realisiert werden. Die Annahmen und Werte für die Vorschubratenberechnungen verwendet werden, können die tatsächlichen Kulturbedingungen einzuhalten verändert werden.
Die vorgestellten Verfahren sollen Zellen für eine therapeutische Anwendung zu erzeugen, in dem die Expansion und die Kultur von Sphäroiden für eine endliche Dauer sein würde und die Zellen selbst das Produkt sind .. kann es wünschenswert sein, für einige Forscher kontinuierlich erweitern oder Kulturzellen unter Verwendung von ein ähnliches Verfahren, aber dies würde andere Herausforderungen stellen nicht für diese Studien festgestellt. Wenn über längere Zeit kultiviert, würde weiterhin die Sphäroide in der Größe zu wachsen, und die Lebensfähigkeit einiger Zellen im Kern des Sphäroids kann aufgrund der zunehmenden Nährstoff- und Sauerstoffdiffusionsbeschränkungen leiden. Diese Kulturen können weitere Manipulationen erfordern große Sphäroide zu dissoziieren diese Begrenzung zu verhindern, wenn Langzeitkulturen erwünscht sind.Keine Abnahme der Lebensfähigkeit wurde für Sphäroide erzeugt mit diesem Protokoll beobachtet, was darauf hindeutet, dass diese Grenze nicht während der 21-tägigen Züchtungsperiode dieser Studie erreicht wurde.
Für zelluläre Therapien könnten diese Techniken in Kombination mit zusätzlichen Regelungssystemen verwendet werden, um Zellausbeute, die Funktion und Lebensfähigkeit zu verbessern. Beispielsweise könnte die SSB-Verfahren mit Erleichtern Technologien einschließlich Mikroträgeroberflächenkulturen für adhärente Zellen kombiniert werden, um Zellwachstumsraten zu verbessern oder Verkapselung von Zellen oder Sphäroiden. Ferner könnte komplexere Regelalgorithmen straffer Kultur Steuerung zu schaffen umgesetzt werden. Einspeisen Anpassung könnte mit der Steuerung von mehreren anderen Parametern kombiniert werden, wie beispielsweise pH - Wert, Konzentration an gelöstem Sauerstoff, der Temperatur und Einspritzen von Reagenzien weitere Verbesserungen 59,60 zu machen. Auf die Ergebnisse in anderen Anwendungen zu verbessern, kann dieses Verfahren automatisiert werden 15,24 und Vorschübe m berechnet werden kann ,Erz oder weniger oft, weitere Verfeinerung Kulturbedingungen.
Fertigungsverfahren von 61 bis 63 definiert sein und sorgfältig , um reproduzierbare biologische Produkte kontrolliert. Die Verwendung von kontinuierlichen Mediums Ersatz verwendet werden Schwankungen in großem Maßstab Zellproduktion beobachtet kritische Nährstoffe zu mildern, und eine einstellbare Zufuhrsystem enthalten, können noch mehr Kontrolle über die Zellumgebung zu implementieren, um die gewünschten Nährstoffniveaus aufrechtzuerhalten. Das beschriebene Verfahren kann mit anderen Säugetierzellen sowohl für zellulare und pharmazeutischen Produkten verwendet werden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β TC-6 Cells | ATCC, Manassas, VA | CRL-11506 | Mouse Insulinoma cell line (adherent cell type) |
| DPBS No Ca, No Mg | Invitrogen, Carlsbad, CA | 14190-144 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144?ICID=search-14190144 |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | See below for product numbers | |
| DMEM High Glucose (500 mM) | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11965-092 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092 |
| DMEM Low Glucose (100 mM) | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11885-084 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084 (note that this medium already contains pyruvate) |
| L-glutamine | Invitrogen, Carlsbad, CA | 25030081 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-product |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11360070 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070?ICID=search-product |
| Heat Inactivated Porcine Serum | Gibco - Life Technologies | 10082147 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147 |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen, Carlsbad, CA | 25200056 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056?ICID=search-product |
| T-150 Tissue Culture Treated Flasks | Corning, Corning, NY | 430825 | http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=430825(Lifesciences) &categoryname= |
| NuAire Cell culture incubator | Princeton, MN | US Autoflow. Any water-jacketed CO2 regulating cell culture incubator could be used. | |
| Centrifuge | Sorvall RT 7 (Any similar benchtop centrifuge may be used) | ||
| Refrigerator | Any laboratory refrigerator could be used (a small table-top version was used for these studies) | ||
| 1 L Glass Bottle | Corning, Corning, NY | 1395-1L | Any vendor could be used. http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=1395-1L(Lifesciences) &categoryname= |
| 2 L Glass Bottle | Corning, Corning, NY | 1395-2L | Any vendor could be used |
| 250 ml stirred bioreactors | Corning, Corning, NY | 4500-250 | http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=4500-250(Lifesciences) &categoryname= |
| Stir Plate | Fisher Scientific | 11-496-104A | Any incubator safe stir-plate can be used, any vendor |
| Tissue Culture Dishes 100 mm Diameter | Nunc, Rochester, NY (Fisher Scientific) | 1256598 | Any vendor could be used (ordered through Fisher Sci) |
| FALCON 50 ml Conical Tubes | Falcon, San Jose, CA | 1256598 | Any vendor could be used |
| Delran Plastic Used for Custom Parts | McMaster Carr | Various | Any material of choice could be used, but Deran is chosen because it is autoclave safe, non-reactive, and easy to machine. http://www.mcmaster.com/#acetal-homopolymer-sheets/=rjrcac |
| Stainless Steel Pipe for custom lids | McMaster Carr | Various | Any vendor could be used. http://www.mcmaster.com/#standard-stainless-steel-tubing/=rjrd91 |
| Custom Modified Delran Bioreactor Lids for Continuous Feeding | Custom made | Not aware of any vendors producing a similar product | |
| Custom Modified Glass Bottle Lids for Continuous feeding | Custom made | Some vendors (e.g., Fischer Sci, Corning) make similar products in the links below. | |
| Masterflex Digital Peristaltic Pump | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | EW-77919-25 | Any precision peristaltic pump could be used. http://www.coleparmer.com/Product/L_S_Eight_Channel_Four_Roller_ Cartridge_Pump_System_115_230 _VAC/EW-77919-25 |
| PVDF Tubing Connectors (various) | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | see link | Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Category/Cole_Parmer_PVDF_Premium _Luer_Fittings/55889 |
| Pharmed BPT Tubing L/S 16 | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | WU-06508-16 | Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-16 |
| Pharmed BPT Tubing L/S 14 | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | WU-06508-14 | Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-14 |
| Pharmed BPT Tubing L/S 13 | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | WU-06508-13 | Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-13 |
| Millipore Millex GP PES membrane 0.22 µl sterile syringe filter (used for venting, and medium filtration) | Fisher Scientific | SLGP033RS | Any vendor could be used |
| 25 ml Graduated Pipette | Fisher Scientific | 13-678-11 | Any vendor could be used, and various sizes may be used |
| Pipetter | Fisher Scientific | 13-681-15E | Any vendor, or similar product could be used |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-6 | Any vendor, or similar product could be used |
| Trypan Blue | Gibco - Life Technologies | 15250-061 | Any vendor, or similar product could be used. https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15250061 |
| Inverted Light Microscope | Leica | Any vendor, or similar product could be used | |
| One Touch Ultra Blood Glucose Meter | Fisher Scientific | 22-029-293 | Any vendor, or similar product could be used (e.g., Bayer) |
| One Touch Ultra-Strips | Fisher Scientific | 22-029-292 | Any vendor, or similar product could be used (e.g., Bayer) |
References
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