Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

תקנת מזין ידי האכלה רציפה להרחבה בקנה מידה הגדולה של בתאי יונקים ב Spheroids

Published: September 25, 2016 doi: 10.3791/52224
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 3, 2, 2, 2, 4, 2
1Radiology, University of Minnesota, 2Medicine, University of Minnesota, 3School of Public Health, University of Minnesota, 4Surgery, University of Arizona

Introduction

כדי לייצר מספר רב של תאים אנושיים קיימא והפונקציונליים להשתלה, הסדרת תנאי התרבות הכרחית. דלדול של חומרי הזנה, יחד עם הצטברות הפסולת המטבולית הם התורמים העיקריים לשינויים מהזדקנות מטבולית לפגוע באיכות התא המוצר 1 - 3. הליך זה מדגים שיטה בתאי יונקים תרבות spheroids באמצעות bioreactor עוררה בשילוב עם מערכת האכלה שיעור זלוף המתואם להסדיר גלוקוז בטווח הפיזיולוגי 4 לכל אורכו של התרבות. לצורך המחקרים הללו, לטווח הפיזיולוגי הוגדר בין 100 ל -200 מ"ג / ד"ל. אותן שיטות שניתן להשתמש בהם כדי להסדיר מזינים אחרים ופסולת מטבולית כגון חומצת חלב.

תרבויות סטטי בנפחים קטנים (1 - 30 מיליליטר) משמשות בדרך כלל את הגדרת המעבדה לשמור ולבדל שורות תאים עבור experimeלמטרות פתיחות opening סגירות closures. passaging Cell מתבצע עם שינויים בינוניים מלאים לפי צורך במרווחים קבועים. רוב "קונבנציונלי" מדיום התרבות יש ריכוז גלוקוז גבוה (450 מ"ג / ד"ל DMEM שימוש במחקרים אלה) כדי לאפשר את השינויים בינוניים תכופים פחות, מבלי להסתכן ביצירת מגבלות מזינות. עם זאת, שיטה-האכלה תצווה זה עדיין דורשת מניפולציה תכופה, מציגה השתנות סביבת התא, ומגבירה את הסיכון לזיהום 5 - 9. Bioreactors השעיה עוררה (SSB) לספק ערבוב טוב יותר וירידת טיפול 3,10 - 20, אבל כמו תרבויות סטטי מצריך שינוי בינוני ידני שתורמים תנודות שעלולות להזיק ברמות המוצר מזינות ופסולת. האכלה זלוף של תרבויות SSB מפחיתה בעיות אלו על ידי עירוי מתמשך והסרה של מדיום, אבל שינויים גדולים ברמות מזינות עקב צמיחת תאים להישאר בעיה. השימוש של ra האכלה מתואםte מחישובים של שימוש מזין על בסיס דרישות תא מוערך יכול לספק את סביבת תאי יציבות נדרשת לייעל כדאיויות תא ומתפקד 21 - 24.

ישנו גוף גדול של ספרות המתאר שיטות תרבויות SSB להרחבה של בתאי יונקים במיוחד עבור התרבות והרחבת תאים פלוריפוטנטיים 25 - 32, עם אחרים התמקדו איון (בטא) תאים 17,33,34, או ייצור של מוצרים ביולוגיים 24, 35 - 38. רבים של סוגי התאים הנחקרים אלה עשויים להיות מבוגרים בתרבויות אליפטית, ונהלים ספציפיים עבור סוג התא בשימוש צריכים להיות מותאמים לפני יישום מערכת האכלה רציפה. בהפגנה זו, שיטת האכלת זלוף שמשה להרחיב קו תאי בטא גדל כמו spheroids בתוך bioreactor בחש 39 - 43. השיטה המתוארת במסמך זה מספקיישום פשוט של האכלת התאמות שיעור המבוססות על מדידות גלוקוז off-line כדי להשיג תנאי תרבות ממוקדות. התאמת קצב ההזנה בשיטה זו כדי לשמור על רמת גלוקוז פיזיולוגית מוצגת לתשואות תא עליות. בתאי יונקים מותנים מזין, גלוקוז מפתח, לייצור אנרגיה, ולכן שימוש שורות התאים מהווה מודל עבור בתאי יונקים בתרבית רבים 44. בנוסף, קו זה מדגים את המורכבות גדולות יותר של תאי בטא, אשר רגישים לרמות גבוהות הכרוניות של גלוקוז 45. לצורך המחקר, תאי β-TC6 הורשו יוצרים spheroids בתרבות כדי להיות קרובים ככל האפשר הגודל הממוצע של איי לנגרהנס in vivo. מערכת bioreactor זלוף 17 - 19,21,46 עם שיעור להאכיל המותאם לגלוקוז צריכה, הביאה שמירת מצבים פיסיולוגיים תשואות תא גבוהות ללא שינויים כדאיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. קו ותחזוקה ניידים

  1. להשיג תאי β-TC6 (או שורת תאים יונקת חסיד אחר רצויה). לקראת מחקר, תרבות, מעבר, ואת cryopreserve התאים בהתאם להוראות ספק.

2. להרכיב את מערכת ההאכלה הרציפה

הערה: עיצוב מערכת האכלה המתמיד השיטה הבאה התבססה על מערכות דומות התואר בספרות 17 - 19,21,47 - 49. עצרת של המערכת בשימוש כאן מתוארת בפירוט בפרסום קודם 3.

  1. אסוף את הרכיבים הדרושים עבור מערכת האכלה אשר מורכבת מחמישה מרכיבים עיקריים: מאגר בינוני, משאבת peristaltic, bioreactor בחש, מאגר פסולת, והמנהג סט צינורות / הדגימה תוכנן.
    1. הקמת המאגר הבינוני באמצעות בקבוק זכוכית 1 ליטר, המאגר הפסול באמצעות בקבוק זכוכית 2 L, ואת stirrebioreactor ד באמצעות כור זכוכית בנפח 250 מיליליטר (את גרסת המדף).
    2. השתמש משאבת peristaltic דיגיטלית או משאבה דומה עם ראש משאבת 8 ערוץ לשלוט חילופי בינוני.
    3. ייצור המאגר ומכסה bioreactor שונה מן הפלסטיק קשה autoclavable עם צינור נירוסטת תמסורת יציאות לספק אוורור דרך מסנני סטרילי, ולאפשר העברה בינונית בין מאגרי bioreactors. לחלופין, לרכוש מכסים מיוחדים עם יציאות תזרים מיצרנים שונים.
      הערה: מכסת bioreactor עשויה להכיל יציאות נוספות תמסורת עבור מכשור אופציונאלי בדיקות ניטור (למשל, צג חמצן).
    4. צרף צינור יצוא (OT) מפוברק בין צינורות אוורור זכוכית נקבוביים עם מגוון גודל נקבובי ממוצע של 40 מיקרומטר עד 60 מיקרומטר, ואת צפיפות נקבובית של 40% למכסת SSB השונה. לחלופין, לבחור עוד צינור יצוא מבוסס על הדרישות הספציפיות של התרבות.
      הערה: בחר אתגודל נקבובי OT כדי להסיר שאריות בינוניות ותא בלבד, עוזב אגרגטים תא בתרבות (כמפורט בסעיף 6 ופרסום 3 לפרטים נוספים).
  2. להרכיב סטי צינורות טפטוף autoclavable מ פלואוריד polyvinylidene (PVDF) מחברי צינורות צינורות משאבת peristaltic עמידים. אורכו של הקטע הוא תלוי המרחק בין המרכיבים השונים.
    הערה: זהירות בעת בחירת מגוון צינורות כדי להבטיח עמידות ואמינות לניסויים לטווח ארוך.
  3. להרכיב הצינורות להגדיר משלושה חלקים: קו הזנה, קו פסולת, וקו מדגם.
    1. הרכב את קו ההזנה באמצעות שני קטרי צינורות (L / S 14 ו- L / S 13). השתמש L / S 14 עבור הצינורות העיקריים יהיה לגשר על המרחק בין bioreactor למאגר הבינוני, וכנס אורך קצר של L / S 13 באמצע אורך הצינורות עבור מקטע המשאבה באמצעות מתאמי PVDF המתאימים.
    2. השתמש דוקרני צינור רגיל PVDF Tubiמתאמי ng להצטרף שתי חתיכות של L / S 14 צינורות משני צדי קטע משאבה הקצר (L / 13 S) צינורות.
      הערה: לחילופין, את כל אורכו של צינורות יכול להיות L בקוטר-קטן / S 13 צינורות, ואורך צינורות כולו יכול להיות מוחלף כאשר שלמות משאבת-סעיף מוטלת על כף המאזניים.
  4. הרכב את סעיף הצינורות השני לפינוי פסול באמצעות בקוטר גדול יותר (L / S 16) צינורות וכנס קטע קצר של צינורות L / S 14 באמצע עבור מקטע השאיבה. הדבר נעשה באותו אופן כמו קו הזנת הרכבה באמצעות PVDF מתאמים-תיל צינור, או לחלופין באמצעות אורך רציף של גודל צינורות משאבה הרצוי, והחלף לפי צורך.
    הערה: אם באותו המשאבה וראש משאבת שמש המעגל להאכיל המעגל פסולת, בסעיף המשאבה של קווי צינורות לפינוי פסול חייב להיות בקוטר גדול יותר מאשר סעיף המשאבה של קו ההאכלה. הדבר מבטיח כי שיעור משאבת הסרה מהיר מקצב ההזנה, ויימנע חזקIAL עבור שינויים גדולים בהיקף התרבות, ולהקטין את הסיכון של הצפה.
  5. הרכב את הרכיב הסופי של סט הצינורות: אסיפת אוסף מדגם.
    1. הליך זה מתאר את מנהג התאסף דגימת מערכת נמל; לחלופין, יציאת דגימת סטריליים ניתן לרכוש מיצרנים שונים.
    2. לבנות את הסט משלושה אורכי צינורות קצרים (~ 6 סנטימטרים) L / S 14 מחוברים יחדיו עם מחבר PVDF T-סוג, ושני מלחציים צינור קטנים על שני אורכי הצינורות.
    3. צרף מסנן גז סטרילי עבור אוורור גז לאחד האורכים הדקו, והשני משמש לחיבור מזרק דגימת סטרילי (מסנני גז סטרילי ייתכן שיהיו צורך להוסיף בארון ביו-בטיחות הבאה עיקור מסנן סטרילי רבים אינם autoclavable).
    4. חבר את הקצה השלישי למחבר מדגם נירוסטה המצורף על המכסה של bioreactor.
    5. חיטוי הרכבת הדגימה תוך מחובר bioreactor לפני התחילההניסוי (עיין לשלב 3 להלן).
    6. השתמש הרכבה זה כדי לאסוף דגימות סטרילי מן bioreactor לפי הצורך מבלי להפריע את תהליך אספקה ​​רצופה.

3. חומרים כל חיטוי

  1. יש להכין את כל המרכיבים bioreactor עבור עיקור החיטוי.
  2. אסוף רכיבים בודדים עבור עיקור. בינוני ומאגרי פסולת (התאספו משלב 2.1.1), בקבוק טווה 250 מיליליטר (מורכב מ 2.1.1), מכסים שונים הכרחיים (מורכב מ 2.1.3), צינור יצוא (המתואר 2.1.4), ערכות צינורות שלוש ( התאספו בסעיפים 2.2 through2.5), צינור יצוא (לפי הצורך להנקה רציפה).
    1. הרכב בקבוק טווה עם כל הרכיבים ולהיות בטוחים צינור היצוא מחובר היטב בתוך הבקבוק הטווה (כמתואר בסעיף 2.1.4), ולצרף את נמל הדגימה התאסף המותאם אישית (סעיף 2.5), או יציאת דגימה אחרת לראש של המכסה .
    2. עוטף את הרכבת בקבוק טווה כולו עם אוטומטיחומר לעטוף הקלאווה, חיטוי המציין קלטת. הקפד כי לעטוף אטום. הערה: רדיד אלומיניום או חומר דומה ניתן להשתמש כדי לכסות את קצות הפרט של כל יציאת גישה במכסת bioreactor לשמר סטריליות של המחבר / מסתיים כאשר עטיפה וכאשר שאינו מחוברים סטי הצינורות בתוך האינקובטור.
    3. הרכב את העפעפיים השונים של המאגרים הבינוניים ופסולת ולאחר מכן לצרף את בקבוקי זכוכית בהתאמה. מכסה אותם באמצעות רדיד אלומיניום ו חיטוי המציין קלטת.
    4. בנפרד לעטוף את ערכות צינורות (לסעיף - 2.2 2.5) עם לעטוף חיטוי וטיפ לסייע הרכבה סופית. ניתן להשתמש בנייר אלומיניום או חומר דומה לעטוף את הקצוות האישיים של כל צינורות להגדיר לשמר סטריליות של המחבר / מסתיים כאשר לקרוע את העטיפה.
    5. חיטוי כל הפריטים העטופים באמצעות מחזור חיטוי יבש רגיל (למשל, "Gravity" הגדרה עם ~ 15 psi ב 121 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות או יותר).
      הערה: אל תחבר סטרילימסננים לפני מעוקר אלא אם כן הם אישרו להיות בטוח החיטוי.

4. גיבוש אליפטית

הערה: טכניקה זו דומה לאלה המתוארים בספרות 17 - 19,21,50 - 52 עבור בתרביות תאים יונקים אחרים. כל הנהלים הבאים עיקור צריכים להיעשות ברדס זרימה למינרית ושימוש בכפפות סטריליות כדי לשמור על תנאים סטריליים עבור תרבית תאים.

  1. עבור כל התנאי, התרבות ולהרחיב התאים β-TC6 בתרבויות חסידות סטנדרטיות (שתואר על ידי ספק) עד כמויות תא מספיק מתקבלים לזרוע את המספר הרצוי של מתקני גידול.
    1. להרכיב את bioreactor ההאכלה הרציף עם צינור יצוא כפי שמוצג באיור 1 ו בסעיף 2, ולהתחבר נמל דגימת מכסת דגימה. הערה: צינור היצוא והרכבת נמל דגימה צריכה להתווסף bioreactאו האכלה רציפה לפני היווצרות אליפטית, ומורם למעלה מן מדיום התרבות עד ההאכלה רציפה הוא התחיל.
    2. לעקר את הרכבת SSB השונה על ידי חיטוי (כמפורט בסעיף 3).
    3. צרף פתחי סטרילית (0.22 מיקרומטר או קטנים מסננים סטריליים) כדי במיקומים המתאימים על העפעפיים של הבקבוק הטווה, וכלי בינוני ופסולת.
      הערה: זה חשוב כדי למנוע נעילת אד, וכדי לאפשר חילוף גזים בין החממה (5% CO 2) הסביבה ועל bioreactor. חילופי הגז יש צורך לשמור על pH הנכון בעת ​​שימוש בתקשורת שנאגר-ביקרבונט.
  2. אוספים את התאים על ידי trypsinization עדין באמצעות 0.25% (w / v) Trypsin- 0.53 פתרון mM EDTA, בטמפרטורת החדר בעזרת תסיסה מכני 2 - 3 דקות, וזרעי למתקני גידול בצפיפות של כ 1.3 x 10 6 תאים / מ"ל במדיום תרבות 200 מ"ל.
    1. העבר צלוחיות המיועד מתוך האינקובטורלתוך ארון ביו-בטיחות.
      הערה: כל התרבות ומניפולציות התא צריך להיעשות בתוך ארון ביו בטיחות באמצעות טכניקה סטרילית נכונה.
    2. הסר בינוני תרבות צלוחיות ידי aspirating.
    3. שטפו תאים על ידי pipetting 5 מ"ל של בופר פוספט (ללא Ca ++ או Mg ++), לתוך הבקבוק, ושטיפה ברחבי תאים על פני השטח, ולאחר מכן לשאוב PBS.
    4. הוסף 3 מ"ל של תמיסת טריפסין-EDTA בקבוק אחד כי ייאספו (בדרך כלל כ 10x 175 ס"מ 2 T-צלוחיות).
    5. אפשר תאים שנקטפו כדי לדגור בטמפרטורת החדר למשך 2 - 3 דקות בארון ביו בטיחות.
    6. להתסיס בעדינות ביד כדי לשחרר תאים מפני השטח הבקבוק, ולאסוף התאים על ידי הוספת 6 מ"ל של מדיום תרבות (עם סרום) אל הבקבוק, ולהעביר את התאים צינור 50 מ"ל. כאשר שפופרת 50 מ"ל אחד מלא, להשתמש עוד 50 צינור מ"ל עד שכל התאים הדרושים נאספו כ (צינור אחד 50 מ"ל יהיה צורך כל 5 T-175 צלוחיותאסף).
    7. בעדינות צנטריפוגה (כ 50 x הכבידו) השעיות התא שנאספו עד גלולת התאים.
    8. לשאוב את המדיום הנותרים עוזב גלולה ללא פגע.
    9. לאסוף את כל תאי צינור יחיד על ידי מחדש השעיית הכדורי במדיום התרבות (המכיל סרום) בעזרת פיפטה, והעבר כל הכדורים לתוך הצינור אותו.
    10. לספור את צפיפות התאים באמצעות hemocytometer רגיל עם כתמים כחולים trypan כמתואר בספרות 53.
    11. הוספת מספר רצוי של תאים הכוללים סטרילית SSB עבור כל תנאי (1.3 x 10 מיליליטר 6 תאים / היה צפיפות תא המוצא הממוקדת עבור ההפגנה הזאת).
    12. הוסף בינוני (עם ריכוז הסוכר הרצוי, במקרה הזה השתמשנו רמות גלוקוז בינוני בטווח הפיזיולוגי) כדי SSB בעזרת פיפטה להגיע נפח תרבות הכולל הרצוי (200 מ"ל נפח תרבות שימש למחקרים אלה).
      הערה: לקבלת הפד הרציף אלה SSB בוחן את המ"ק ltures היו זורעים באמצעות גירסת מערכת ה "נמוכה גלוקוז" שונה של המדיום תרבות (100 מ"ג / ד"ל). זה איפשר תרבויות להתחיל בריכוז הגלוקוז היעד הרצוי במקום להתחיל עם מדיום "גבוהה גלוקוז" ומחכה צריכת גלוקוז כדי להביא את רמות הגלוקוז לתוך לטווח הפיזיולוגי להתחיל האכלה. כל מדיום אחר האכלה במחקרים אלה השתמשו בתקן "גבוהה גלוקוז" בינוני (500 מ"ג / ד"ל).
    13. זז SSB עם תאים לצלחת ומערבבים בתוך תרבית תאי חממה.
  3. התרבות תאים של מתקני הגידול ללא האכלה במשך 3 ימים ב 37 מעלות צלזיוס, עם 5% CO 2, 100% לחות יחסית, ושיעור ומערבבים של 70 סל"ד לאפשר spheroids להיווצר.
    הערה: אין התפשטות משמעותית יש לשים לב בתקופת היווצרות אליפטית שלושה ימים.
  4. לאחר היווצרות אליפטית, לחלק spheroids בין bioreactors עם תנאי תרבות רצויים.
le "> 5. תרבות האכלה רציפה ושיעור Feed מתואם

  1. החיטוי או גז לעקר את כל הרכיבים, ולהרכיב ארון בטיחות ביולוגית באמצעות טכניקות סטרילית (שלבים 2 - 4).
  2. לאחר היווצרות אליפטית, להסיר את SSB מן החממה ולהרכיב את הרכיבים עבור מערכת הזנה רציפה בתוך ארון בטיחות ביולוגית.
    1. ראשית למלא את המאגר הבינוני הטרי עם מדיום התרבות הרצוי, ולאחר מכן להתחבר בצד אחד של קו ההזנה. גם להבטיח כי המאגר הבינוני הטרי פרק כראוי עם מסנן סטרילי.
    2. חבר צד אחד של הקו להאכיל את יציאת כניסת ההזנה על bioreactor באופן סטרילי. מסנן סטרילי צריך להיות מותקן בין קו ההזנה ואת יציאת כניסת bioreactor לסנן המדיום לפני שהוא נכנס bioreactor.
    3. חבר את הקו פסולת אל צינור יצוא bioreactor ואת המאגר פסולת הבינוני, ולהבטיח כי המאגר הפסול פרק כראוי עם sterilמסנן דואר.
  3. הזז את ההרכבה מתוך ארון הבטיחות הביולוגי (זה כנראה ידרוש שני אנשים לסחוב את כל כלי הצינורות), ולשים את כל המרכיבים לתרבות לטווח ארוך.
    1. שים את SSB לצלחת ומערבבים הפנימי של החממה באמצעות הפרמטרים תרבות זהה עבור היווצרות אליפטית (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, לחות 100% ו -70 סל"ד). הערה: ייתכן שיהיה צורך לנתק את פלחי צינורות זמנית מן bioreactor אם הקווים צריכים להפעיל דרך חורים בצד של החממה ולא החוצה דרך אטם הדלת. ניתן לעשות זאת בצורה מזוהם על ידי לפפה את הקצוות של קבוצות צינורות ברדיד אלומיניום לפני מעוקר (שלב 3), ומחכה לצרף בצד bioreactor המדורים הזנה ופסולת צינור עד bioreactor הוא בתוך האינקובטור. קווי הצינור ניתן לשים במקום, ואת רדיד האלומיניום ניתן להסיר בתוך האינקובטור ומצורפים במהירות bioreactor.
    2. הפעל קצוות נותרים של סטי צינורות (אלה לא מחובר מכסה bioreactor) החוצה דרך יציאת גישת החממה (pass-through), או דרך חריץ אטם דלת חממה.
    3. מחוץ החממה (בתוך ארון בטיחות ביולוגי הסמוכים במידת האפשר), חבר את קו ההזנה במהירות למאגר הבינוני הטרי, והקו פסולת למאגר הפסולת הבינוני, ולהבטיח כי המאגר הפסול פרק כראוי עם מסנן סטרילי. הערה: כדי לעשות זאת בצורה ספטית, להסיר את רדיד האלומיניום ממחברי צינורות כולים ולהתחבר כלי בהתאמה מהר ככל האפשר (במיוחד אם הקשר הזה צריך להיעשות מחוץ לארון הבטיחות הביולוגי).
    4. שם מאגר בינוני טרי (מלא בינוני להאכיל רצוי) בתוך מיני-מקרר סמוך. בדוק כדי לוודא כי צינורות הזנה ופסולת מסוגלים לצאת בחממה והזן את המקרר ושאינם מונעים את הדלתות בכל תיסגר. זה גם קריטי כי אני מזיןאינס לא צבט נסגר על ידי דלתות או במקרר או בחממה.
      הערה: המדיום המשמש במחקרים אלה היה גלוקוז סטנדרט גבוה (500 מ"ג / ד"ל) בינוני תרבות המומלץ על ידי הספק עבור סוג זה התא. בכל מדיום גלוקוז גבוהה יכול לשמש מבוסס על הצרכים הספציפיים של סוג תא בתרבית. ריכוז גלוקוז של המדיום להאכיל צריכה להיות גבוה יותר סביר (2x או יותר) מאשר את הריכוז הרצוי בתרבות כמערכת ההאכלה מסתמכת על גברת קצב ההזנה של מדיום גלוקוז גבוה כדי לשמור על רמות גלוקוז נאותות בתרבויות תוך שמירה על שיעורים להאכיל סבירים .
    5. לאחר מכן, המאגר בינוני פסולת ניתן לשים על גבי ספסל מחוץ לחממה במיקום נוח.
    6. הבא, במקום "סעיף המשאבה" של קווי הזנה ופסולת לתוך ראש משאבת הבטחה בכיוון הנכון כך שקו להאכיל יהיה לשאוב בינוני מהמאגר הבינוני הטרי לתוך SSB, ואת קווי הפסולתיהיה לשאוב בינוני מן SSB וכדי המאגר בינוני פסולת.
  4. הפעל את המשאבה על לשיעור להאכיל הרצוי.
    1. חשבתי את קצב ההזנה באמצעות משוואת שיעור להאכיל מתואם מתואר בספרות 3 ו במקטע תוצאות הנציגים להלן.
    2. השתמש במידע ספירת התא האחרון (ההליך המתואר בשלב 5) יחד עם התחזית לצמיחה, ומדידות גלוקוז הבינוניות כדי להעריך את השיעור להאכיל לשמירה על ריכוז הסוכר הרצוי בתרבות.
      הערה: שיעורי צמיחת תאי שיעורי צריכת גלוקוז יצטרכו לקבל לפני ביצוע הליכים אלה.
    3. הגדר את מהירות המשאבה על פי שער להאכיל מחושב.
  5. חזור על החישוב להאכיל שיעור ולהתאים את מהירות המשאבה עבור כל נקודת דגימה (כל שלושה ימים עבור השיטה המתוארת).

6. ספירת תאים, כדאיות, ומדידות ריכוז הגלוקוז

<ol>
  • לאסוף דגימות מכל bioreactor כל שלושה ימים, או לפי הצורך.
  • קח דגימות תרבות מתרבויות נמאסות ברציפות SSB באמצעות יציאת דגימה המיוחדת שתוארה לעיל.
    1. השארת SSB נמאס ברציפות בתוך bioreactor, לצרף מזרק סטרילי (מזרק בנפח 5 מ"ל שימש למחקרים אלה) לחיבור מסונן un של הנמל הדגימה.
    2. הזז את צינור הדגימה למטה לתוך מדיום התרבות.
    3. Unclamp בסעיף הצינור הולך המזרק, ולסגת נפח הדגימה הכולל הרצוי.
    4. הזז את צינור הדגימה כך שהוא כבר לא שקוע בתוך התרבות, וממשיך למשוך את המזרק עד אוויר מוסר.
    5. קלאמפ צינור שמזין את המזרק, ולנתק את המזרק המכיל את המדגם, ומניחים בצד.
    6. טרום לטעון מזרק סטרילי שני טרי עם אוויר, ולצרף אל צד הסינון סטרילי של נמל הדגימה.
    7. Unclamp הצינור הולך בצד-מסנן מזרק שלנמל הדגימה, ולאחר מכן לטהר את יציאת דגימה על ידי גירוש האוויר בעדינות את המזרק דרך מסנן סטרילי. הדבר מבטיח כי נמל הדגימה יהיה ברור של כל מדיום שיורית.
    8. Re-מהדק את הצינור הולך המסנן, ניתקת את המזרק סטרילי וזורק אותו.
  • קח את המזרק המכיל את מדגם התא מתרבה, ולגרש אותו לתוך צינור 10 מיליליטר. תת דוגמאות של כרכים ידועים ניתן לקחת ישירות הצינור הזה.
  • עבור ספירת תאים, להסיר נפח ידוע של תאי ולהעביר צינור מיקרו צנטריפוגות, צנטריפוגות בעדינות במשך 1 - 2 דק '(כ 50 x הכבידה).
  • מעבירים את supernatant בצינור נפרד עבור מדידות גלוקוז, מחדש להשעות גלולה עם נפח זהה של תמיסת טריפסין-EDTA (0.25% (w / v) טריפסין, 0.53 mM EDTA), ולספור בשלושה עותקים באמצעות hemocytometer רגיל עם trypan מכתים כחול כמתואר בספרות 53.
    1. הוסף בינוני (עם סרום) כדיהמדגם עבור דילול לפי הצורך.
    2. ספירת התאים, ולחשב את כדאיויות תא על ידי הקלטת חיה (בלא כתם) תאים, ומתים (מוכתם) תאים עצמאיים (כדאי% = תאי חיים / תאים בסך הכל).
  • אמוד את רמות הגלוקוז בינוניות בשלושה עותקים באמצעות מד הגלוקוז בדם-מקלוני בדיקה לשימוש חד.
    1. קח מדידות גלוקוז כמתואר בהוראות מד הגלוקוז החלפת המדיום תרבות דם.
    2. טובל את מקלון הבדיקה בטווח הבינוני להיבדק (שנאסף ממדגם ספירה לעיל), וחזור על המספר הרצוי של משכפל (שלושה משכפל מומלץ).
    3. בדוק את שני המדיום ופסול המדיום החדש עבור ריכוזי גלוקוז.
      הערה: עבור חלק מטרים, מדידות נמוכות מ -20 מ"ג / ד"ל (סף לזיהוי של מטר), אפשר לראות כשגיאה בפלט מטר.

    • 7. מדידות דרג שיקוע אליפטית

    1. כדי להבטיח cel כיאשכולות l אינם הוסרו על ידי האכלת המערכת הרציפה, למדוד את קצב השיקוע של spheroids β-TC6 ידי התבוננות השקיעה שלהם טפטפו פלסטיק בקוטר גדול.
    2. תרבות תאי β-TC6 ב bioreactors SSB ליצירת spheroids כפי שתואר לעיל.
    3. לאחר 3 ימים של תרבות, לקחת 30 מ"ל דגימות של ההשעיה אליפטית ומניחים צינור 50 מ"ל.
    4. בעדינות pipet מעלה ומטה בעזרת פיפטה מיליליטר רחבה בקוטר 25 לחלק באופן שווה השעיה, ואז להפסיק pipetting עם ההשעיה ברמה ידועה pipet (למשל, 20 מיליליטר הסימן), ולאחר מכן לרשום את הזמן כל spheroids כדי ליישב 5 ס"מ.
    5. חזור על הליך זה מספיק פעמים כדי להשיג בטחון סטטיסטי (בדרך כלל n> 3).
      הערה: עבור מחקרים ביולוגיים, ערך ap פחות מ 0.05 נחשב משמעותי מבחינה סטטיסטית כאשר משווים מדידות. סטיית התקן של הממוצע שימש שגיאות הדיווח, והשניים זנב לזווג un מבחן סטודנט-tשמש להשוות תנאים שנפלו בנתונים המוצגים.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    רמות תנודות גלוקוז בינוניות הגבל הרחבת תא בתרבויות SSB הרגיל

    רמות גלוקוז להשתנות בתרבויות סטטי ותרבויות SSB לאורך תקופת התרבות 3. תנודות אלה להגביר עם הגדלת מספר סלולארי במהלך תקופת תרבות 21-היום היו כמעט זהים הוא בתרבויות סטטי SSB. תצפיות אלו מוצגות בפרסום הקודם שלנו 3. רמות גלוקוז יכולות להיות סופר-פיזיולוגית למשך תקופת התרבות עבור שני השיטות. בגלל חשיפה כרונית זה עלולה לעכב צמיחת תאי 54, מערכת האכלה רציפה פותחה כדי לחסל תנודות גלוקוז לשפר את השליטה מזינה במהלך התרבות אליפטית.

    מערכות האכלה רציפות לתרבות אליפטית

    ברציפות הוספת בינוני טרי והסרת מדיום ישן למשך תקופת התרבותניתן להשיג זאת באמצעות מערכת חידוש בינונית פשוטה. המערכת כמתואר בשיטה 2 ו שמוצג באיור 1 בשימוש משאבה צינורות להגדיר לחדש בינוני ברציפות צינור יצוא נפרד להסיר בינוני ברציפות תוך מניעת הסרת spheroids מתרבות. הכניסה הבינונית הייתה בצד השני של הכור כדי למזער את אפשרות של הפרעה לתפקוד התקין של OT, וכדי לאפשר ערבוב יסודי. בינוני טרי (עם גלוקוז גבוה, 450 מ"ג / ד"ל) נשמר בטמפרטורת מקרר על מנת להבטיח יציבות לטווח ארוכה הוסיף ברציפות לתרבות דרך כניסה בינונית עם שיעור החלפה בינוני מלא כל שלושה ימים כדי לחדש את החומרים מזינים. מערכת זו מוגבלת המניפולציות וההתערבות הנדרשות בתקופת התרבות ידי החלפת הליך ההחלפה הבינונית יצווה הידני עם תהליך מתמשך 3,22,23. המדיום הקר נכנס bioreactor בנפחים קטנים על timדואר (0.046 מ"ל / דקה) ביחס להיקף תרבות הכולל (200 מ"ל), לתת לכל "טיפה" זמן בינוני הוסיף לאזן טמפרטורה עם המדיום התרבות הסובבת כי היה על 37 מעלות צלזיוס. זה הבטיח כי המדיום הקר הוסיף לא להוריד את טמפרטורת התרבות הכללית ומתוחזק בתוך החממה. ערבוב של מדיום התרבות גם גדל העברת חום יעיל, ושפר אחידות טמפרטורה בתרבויות אלה. תחזוקת טמפרטורה יכולה להיות דאגה אם שיעורים להאכיל מאוד גבוהים שמשו עם כרכי תרבות קטנים, אבל תנאים לא סבירים אלה לא נבדקו על מחקרים אלה. היקף התרבות נשמר ברמה קבועה במערכת ההאכלה הרציפה על ידי ההבטחה כי שיעור הסרת בינוני הממוצע היה שווה לשיעור ההאכלה. המערכת המשמש לימודים אלה בטלו למעשה בינוניים בקצב זרימה גבוה משיעור להאכיל כי סעיף צינורות הסרה בשימוש צינורות בקוטר גדול יותר עבור מקטע המשאבה. למרות רם מהרval מקום, נפח התרבות נשמר על ידי התאמת רמת צינור היצוא בתוך הכור לרמת נפח התרבות הרצויה. ברציפות הוספת בינוני טרי על SSB הביאה לעלייה קטנה ברמת בינוניים הכור, וכאשר בינוני הגיע לרמה של OT, בינוני הוסר מהכור בקצב מהיר. המדיום הוסר דרך OT הזכוכית הנקבובי, עוזב את spheroids התאים בתרבית עד הרמה הבינונית נפלה מתחת לחלק התחתון של OT. מערכת זו נמנעה המורכבות באמצעות חיישני זרימה ונפח קלושים לשלוט במהירויות משאבה, והוא הסטנדרט לשימוש עם מנגנון תרבות המבוססת רב SSB 47,48. בשטחים נועדו להבטיח כי spheroids לא הוסר מן התרבות דרך המעגל וסילוקם הגודל הנקבובי והצפיפות בצינור זכוכית fritted היו גדולים מספיק (40% ו 40 - 60 מיקרומטר בהתאמה) על מנת להבטיח כי מהירות הזרימה ליניארית היה נמוך משיעור שיקוע של spheroids לנואד ללימודי התרבות הללו. התזרים ליניארי חושב כמתואר בפירוט 3. המהירות הבינונית ליניארי ממוצע הדרך הנקבובית OT הייתה מחושבת להיות 0.17 סנטימטר / min, הדבר שלא היה איטי יותר מאשר הקצב ליישוב אליפטית האיטי ביותר שנצפה. מהירות שיקוע הממוצע נמדדה כמתואר בשיטה 7 והיה 2.53 ± 0.26 ס"מ / min הספרואידים שימוש במחקרים אלה. הספרואידים נצפו להגדיל את שטחו כמו התרבות מתקדמת, ו spheroids גדול אלה התיישבו מהר יותר בשל יחס המסה-גרירה מוגברת שלהם, אשר עוד ירד את האפשרות להסרה דרך OT. spheroids חלק נלכד בתוך הנקבוביות הנמוכות על הקצוות החיצוניים של OT, אבל זה היה בעיקר בשל התנגשות מכאנית כאשר צינור יצוא מטבלים לתוך המדיום הזז. זה לא מנע פעילותו התקינה של OT, ולא לתרום הפסד למדידה של spheroids ב התרבויות שנבדקו. בשטחים ללימודים אלה נוקו אחרי כל מחקר, (עם סומק מי DI), והחליף לאחר השימוש לשני לימודי תרבות על מנת למנוע הסיכון של פונקצית ירד. בשטחים יכולים להיות מוחלפים אחרי כל מחקר אם spheroids הם נצפו לסתום את הנקבוביות במהלך מחקר מסוים (הדבר לא נצפה בעבודה המוצגת). עקב ההסרה המחזורית של מדיום באמצעות שיטה זו, היקף ההתרבות הבינוני נע על ידי ככל 6%. התנודות נגרמו על ידי מתח הפנים של המדיום שאיפשר OT להסיר קצת יותר בינוני לאחר רמה בינונית הממוצע ירד מתחת לחלק התחתון של OT.

    ביטול צמיחת תאים משופרים תנודות תזונתיות בתרבויות SSB

    ברציפות ההחלפה הבינונית בתרבויות SSB באמצעות המערכת שתוארה לעיל תשואות תרבות עלו במהלך תקופת תרבות 21 הימים בהשוואה לתרבויות SSB הסטנדרטיים. השיעור להאכיל נשמר קבוע לאורך כל תקופת התרבות בשיעור שהחליף את volu התרבות השלםלי כל שלושה ימים כדי להשוות את תרבויות SSB הניזונים תצוינה. ביטול התנודות המזינות ביאה לגידול בתשואות תא (איור 3) למרות ריכוז 3 גלוקוז הגבוה. גודל אליפטית גם נמדד בסוף תקופת התרבות ידי הערכה המיקרוסקופית 2D (מיקרוסקופ אור הרגילה המתואר בספרות 3), ואת spheroids בתרבויות CF-SSB היו גדולה יותר באופן משמעותי (p <0.02, תלמיד-T Test) כי סטטי או תרבויות SSB סטנדרטיות כפי שדווח בספרות 3. תצפיות אלה תומכים נתוני ספירת תאי דבר המצביע על שיעור צמיחה גבוה בתרבויות CF-SSB בעוד הכדאיות נשמרה באותה רמה גבוהה (96.23 ± 0.85%) ללא קשר מצב התרבות. SSB נמאס ברציפות (CF-SSB) מערכת התרבות בוטלה התנודות המזינות בתרבויות אליפטית, ושפר שיעורי צמיחת תאים, אך רמות הגלוקוז נשארו סופר-פיסיולוגיות אשר עשויים היה למנוע עוד יותר שד rovement ב הרחבת התא (איור 2). כדי לשפר עוד יותר על מערכת תרבות CF-SSB, אלגוריתם שמש להתאים את קצב ההזנה במהלך תקופת התרבות במטרה לשפר את השליטה ברמות סוכר בתרבויות SSB.

    חישוב דרג Feed מתואם

    מספר גורמים יכולים להיחשב לצורך חישוב שיעור להאכיל כדי לשמור על רמות גלוקוז עקביות. הגורמים הספציפיים של עניין ניתן לשנות עבור מחקר נתון עבור קו תאים ספציפי. לצורך הפגנה זו, שקלנו שיעור הצמיחה והצריכה גלוקוז נקבע מתרבויות קודמות, כמו גם את רמות הגלוקוז בפועל בעת התאמת 3. התאמות קצב העדכון יכול להתבצע בכל מרווח בזמן. להדגמה זו, דגימות נאספו והשיעור להאכיל הותאם כל שלושה ימים על בסיס החישובים הרציפים תארו כדלקמן.

    t "> חישוב שיעור הצמיחה החזוי

    משוואה 1 מנבאת את צמיחת התאים במהלך תקופה מסוימת של תרבות, עם ספירת תאי חזה (N 2) המייצגת את המספר הכולל הצפוי של תאים בתרבית בזמן כלשהו בעתיד. שיטה זו משתמשת קירוב שיעור גידול ליניארי שבו ספירת התא הנוכחית (N 1) מתווספת שיעור הצמיחה המשוער של התאים בתרביות אליפטית (ז R) כפולות תקופת התרבות (t 2 -t 1).

    משוואה 1 (1)

    דרג Feed Baseline מחושב

    השיעור להאכיל בסיס (R F) חושב באמצעות משוואה 2 על ידי אומדן גלוקוז נצרך התרבות במהלך תקופת התרבות (במונה) וחלוקתו על ידי ריכוז גלוקוז בטווח הבינוני feed (C F 1) על ידי הממוצע המשוקלל של N 1 ו- N 2 ממשוואת 1. זה שיעור צריכה ואז חולק על ידי ריכוז גלוקוז (C F) בטווח הבינוני להאכיל לחשב את השיעור להאכיל בינוני הממוצע הדרוש כדי להחליף את הסוכר נצרך במהלך תקופת התרבות הזהה.

    משוואה 2 (2)

    דרג Feed התאמת עם רמות גלוקוז נצפים

    התאמות נוספות נעשו לשיעור להאכיל הבסיס כדי להתאים את רמות הגלוקוז הנמדד (ג 1) בנקודת הזמן שנבחר בעזרת משוואה 3. זה שיעור להאכיל גלוקוז-פורמה (GAFR) יכול לשמש כדי לשמור על רמות כאשר שינויים לא צפויים בצמיחה או מוות להתרחש בתרבות. equatio זה n משולב קבוע מלאה (X), ואת שווי של 0.5 שימש נתונים אלה 3. C 1 מייצג את ריכוז הגלוקוז נמדדת במדיום תרבות ביום המדגם, ו- C D מייצג את ריכוז הגלוקוז בינוני היעד. הערך הסופי מתקן את השיעור להאכיל חזה מהחישוב השני.

    משוואה 3 (3)

    איור 1
    איור 1: תרשים מערכות האכלה רציף עם Tube יצוא. (א) תרשים של המערכה הפגינה. (ב) פילטר זכוכית Fritted דגש על צינור יצוא לאפשר בינוני להסירו מתרבות ללא אובדן של תאים. איור לשכפל באישור. 3

    /files/ftp_upload/52224/52224fig2.jpg "/>
    איור 2:. מדידות גלוקוז עבור SSB, CF-SSB, ומותאמים תרבויות CF-SSB (א) מדידות גלוקוז בינוני מתרבויות אליפטית β-TC6 באמצעות סטטי, SSB, ו CF-SSB שיטות התרבות האכלה עם המדיום גלוקוז סטנדרט גבוה. ההאכלה הרציפה היא מסוגלת לנטרל את התנודתיות גלוקוז, אך רמות הגלוקוז הממוצעות השינוי הבינוני דראמטי במהלך תקופת התרבות, ורחוק מעל לטווח הפיזיולוגי (מסומנות ליד הבר האפור). ההאכלה המותאמת היא מסוגלת לנטרל את התנודתיות וכן לשמור על ריכוזי גלוקוז ליד רמות פיסיולוגיות למשך תקופת התרבות. ברי שגיאה למדידות גלוקוז הם קטנים מכדי להיות גלויים על הסקאלה המוצג (סטיית התקן ≤ 4% עבור כל המדידות). הנתונים מן הדמויות מוצגים בפרסום קודם באישורו. 3

    e = "תמיד"> איור 3
    איור 3: תא ספירה מן SSB, CF-SSB, ומותאם תרבויות CF-SSB עם מחירי Feed מותאמי צמיחת צמיחת תאים כפי שדווחה שינוי של פי מספר סלולארי במהלך תקופת תרבות 21 ימי השוואת SSB עם שינויים בינוניים קבועים נגד קצב עדכון קבוע. תרבויות SSB ותרבויות SSB שיעור להאכיל מתואם. ברים שגיאה לדווח על סטיית התקן של הממוצע, ו- p-values ​​המדווחים קשורים מבחן שני זנב un-לזווג תלמיד-t סטטיסטי. לשכפל באישור. 3

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    יצירת מוצרי תאים יונקים לייצור חומרים ביולוגיים עבור טיפולים בתאים דורשת ההתרבות וניטור בתאי יונקים בקנה מידה גדולה 55 - 58. יתר על כן, יישומים אלה מחייבים שורה של תנאי התרבות מוגדרות ומאומתים. כל שעליך לעשות הוא להגדיל את הנפח של תאים באמצעות טכנולוגיות מחקר לא לענות על כל הדרישות הללו. שינויים בינוניים ידניים גורמים לתנודות חומרים מזינות הצטברות של חומרים פסולת להפחית תא באיכות, כדאיות ואת תשואה. שימוש bioreactors הוא מבוסס היטב על התרבות הממוסחרת של מיקרואורגניזמים עבור יישומים ביו-פרמצבטיקה, אסטרטגיות דומות הוחלו בתרביות תאים יונקות. יחסי הגומלין המורכבים של בתאי יונקים עם סביבתם מחייבים שינויים מסוימים לווסת את רמות מזין על מנת לייעל פוטנציאל הרחבת תא.

    כדי לטפל בבעיות אלה, פיתחנו straightfoשיטת rward כדי לשמור על רמות גלוקוז בטווח יעד מבוקש, המתקרבת רמות פיסיולוגיות בתוך bioreactor השעיה עורר עם מנגנון האכלת מתכוונן שיעור זלוף. כדי להשיג זאת, spheroids של קו תאי בטא נוצרו בתוך bioreactor ההשעיה עוררה. מערכת האכלת זלוף הועסקה לספק מנגנון האכלה רציף להחליף הליכי האכלה תצווה סטנדרטיים. שיעורי צמיחת תאים נצפו, ומשתמשים חוזה את שיעור שימוש גלוקוז למידע. רמות גלוקוז בפועל נמדדו גם על הזמן בתרבות כדי להתאים את השיעורים להאכיל בתגובה מזינה בפועל נצרכו ומוצרי מטבולית שהופקדו המדיום על ידי התאים. שיטה זו מנעה תנודות ברמות הסוכר לראות עם מערכות סטטיות SSB אחרות 3 שבו רמות הגלוקוז נעו באופן דראמטי עם שינויים בינוניים כל 3 ימים. באמצעות אסטרטגיות אצווה-האכלה, ריכוזי גלוקוז ירד ככל 275 מ"ג / ד"ל במשך שלושה ימים, בשלב מאוחרים בהרחבת 21 יום. תנודות אלו ברמות הגלוקוז מוגבלות תשואת תא.

    חישוב שיעור ההחלפה הבינוני עבור הפגנה של האכלת המערכת המתואמת המשולבת עם קצב גידול הוקם וקצב צריכת גלוקוז עבור קו התא, כמו גם את צפיפויות התרבות (נמדדו) ציינו ורמות גלוקוז בכל נקודת זמן האכלה. עבור תאים מסוגים שונים, או למערכות בתרבית רקמה מורכבות יותר, בהנחות אלה עשויות לא להתייחס. כדי להבטיח שליטת גלוקוז מדויקת יותר, האלגוריתם כלל גם מערכת בקרת משוב כדי להסביר את ההשתנות של תרבויות בודדות. מגבלות שיטה זלוף מבוסס על שיעור צמיחה לבד, כולל השפעת ההטרוגניות ניצול הגלוקוז לתאים ברחבי spheroids ושינויים צריכת גלוקוז על פי פרמטרים כגון תאי גזע הבחנה, ניתן למתן על ידי מערכת בקרת משוב. בהתאם ליישום, תאים כי התערוכה exponeשיעורי צמיחת ntial או פרופילי צמיחה מורכבים יותר יכולים להיות מיושמים על מנת לשפר את ביצועי האלגוריתם. ההנחות והערכים המשמשים חישובים שיעור להאכיל ניתן לשנות לדבוק תנאי תרבות בפועל.

    השיטות שהוצגו נועדו לייצר תאים עבור יישום טיפולי שבה ההתרחבות וההתרבות של spheroids תהיה למשך סופי, והתאים עצמם הם התוצר .. זה יכול להיות רצוי כמה חוקרים להרחיב ברציפות או תאים בתרבית באמצעות שיטה דומה, אבל זה היה להציב אתגרים אחרים לא נתקלו ללימודים אלה. אם בתרבית לתקופות ממושכות, הספרואידים ימשיכו לגדול בגודל, ואת הכדאיות של תאים מסוימים בגרעין של אליפטית עלולה לסבול בשל הגדלת מגבלות דיפוזיה מזין וחמצן. תרבויות אלה עשויות לדרוש מניפולציות נוספות לניתק spheroids הגדול כדי למנוע מגבלה זו כאשר תרבויות לטווח ארוך הן רצויות.אין ירידת הכדאיות נצפתה spheroids שנוצר עם פרוטוקול זה, דבר המצביעה על כך מגבלה זו לא הושגה במהלך תקופת תרבות 21-היום של מחקר זה.

    לקבלת טיפולים הסלולר, טכניקות אלה יכולים לשמש בשילוב עם מערכות רגולטוריות נוספות כדי לשפר את תשואת תא, תפקודי ואת כדאיות. לדוגמא, שיטת SSB יכולה להיות משולבת עם טכנולוגיות להקל כולל תרבויות משטח מייקרו-נישאים תאים חסידים כדי לשפר את שיעורי צמיחת תאים, או אנקפסולציה של תאים או spheroids. יתר על כן, אלגוריתמי הסתגלות מורכבים יותר יכולים להיות מיושמים על מנת לספק שליטת תרבות הדוקה. התאמת האכלה יכולה להיות משולבת עם השליטה של פרמטרים אחרים מרובים, כגון pH, ריכוז חמצן מומס, טמפרטורה, ואת הזריקה של ריאגנטים לעשות שיפורים נוספים 59,60. כדי לשפר את התוצאות ביישומים אחרים, שיטה זו יכולה להיות אוטומטית 15,24, ושיעורים להאכיל ניתן לחשב מעפרות או בתדירות נמוכה יותר, תנאי תרבות זיקוק נוספים.

    ייצור תהליכי 61 - 63 צריכים להיות מותווה ומבוקרת בקפידה כדי להפוך את מוצרים ביולוגיים לשחזור. שימוש החלפת תווך רציף ניתן להשתמש כדי להקטין תנודות בחומרים מזינים קריטיים שנצפו ייצור תאים בקנה מידה גדול, ושילוב מערכת האכלה מתכווננת יכול ליישם אפילו יותר שליטה על סביבת התא, כדי לשמור על רמות חומרים מזינות רצויות. השיטה המתוארת יוכל לשמש עם בתאי יונקים אחרים עבור שני המוצרים הסלולר והפרמצבטיקה.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    β TC-6 Cells ATCC, Manassas, VA CRL-11506 Mouse Insulinoma cell line (adherent cell type)
    DPBS No Ca, No Mg Invitrogen, Carlsbad, CA 14190-144 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144?ICID=search-14190144
    Dulbecco's Modified Eagles Medium Invitrogen, Carlsbad, CA See below for product numbers 
    DMEM High Glucose (500 mM) Invitrogen, Carlsbad, CA 11965-092 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092
    DMEM Low Glucose (100 mM) Invitrogen, Carlsbad, CA 11885-084 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084 (note that this medium already contains pyruvate)
    L-glutamine Invitrogen, Carlsbad, CA 25030081 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-product
    Sodium Pyruvate Invitrogen, Carlsbad, CA 11360070 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070?ICID=search-product
    Heat Inactivated Porcine Serum Gibco - Life Technologies 10082147 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147
    Trypsin-EDTA Invitrogen, Carlsbad, CA 25200056 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056?ICID=search-product
    T-150 Tissue Culture Treated Flasks Corning, Corning, NY 430825 http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=430825(Lifesciences)
    &categoryname=
    NuAire Cell culture incubator Princeton, MN US Autoflow. Any water-jacketed CO2 regulating cell culture incubator could be used.
    Centrifuge Sorvall RT 7 (Any similar benchtop centrifuge may be used)
    Refrigerator Any laboratory refrigerator could be used (a small table-top version was used for these studies)
    1 L Glass Bottle Corning, Corning, NY 1395-1L Any vendor could be used. http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=1395-1L(Lifesciences)
    &categoryname=
    2 L Glass Bottle Corning, Corning, NY 1395-2L Any vendor could be used
    250 ml stirred bioreactors  Corning, Corning, NY 4500-250 http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=4500-250(Lifesciences)
    &categoryname=
    Stir Plate Fisher Scientific 11-496-104A Any incubator safe stir-plate can be used, any vendor
    Tissue Culture Dishes 100 mm Diameter Nunc, Rochester, NY (Fisher Scientific) 1256598  Any vendor could be used (ordered through Fisher Sci)
    FALCON 50 ml Conical Tubes Falcon, San Jose, CA 1256598 Any vendor could be used
    Delran Plastic Used for Custom Parts McMaster Carr Various Any material of choice could be used, but Deran is chosen because it is autoclave safe, non-reactive, and easy to machine. http://www.mcmaster.com/#acetal-homopolymer-sheets/=rjrcac
    Stainless Steel Pipe for custom lids McMaster Carr Various Any vendor could be used. http://www.mcmaster.com/#standard-stainless-steel-tubing/=rjrd91
    Custom Modified Delran Bioreactor Lids for Continuous Feeding Custom made Not aware of any vendors producing a similar product
    Custom Modified Glass Bottle Lids for Continuous feeding Custom made Some vendors (e.g., Fischer Sci, Corning) make similar products in the links below.
    Masterflex Digital Peristaltic Pump Cole Parmer, Vernon Hills, IL EW-77919-25 Any precision peristaltic pump could be used. http://www.coleparmer.com/Product/L_S_Eight_Channel_Four_Roller_
    Cartridge_Pump_System_115_230
    _VAC/EW-77919-25
    PVDF Tubing Connectors (various) Cole Parmer, Vernon Hills, IL see link Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Category/Cole_Parmer_PVDF_Premium
    _Luer_Fittings/55889
    Pharmed BPT Tubing L/S 16 Cole Parmer, Vernon Hills, IL WU-06508-16 Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
    _L_S_13_25/WU-06508-16
    Pharmed BPT Tubing L/S 14 Cole Parmer, Vernon Hills, IL WU-06508-14 Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
    _L_S_13_25/WU-06508-14
    Pharmed BPT Tubing L/S 13 Cole Parmer, Vernon Hills, IL WU-06508-13 Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
    _L_S_13_25/WU-06508-13
    Millipore Millex GP PES membrane 0.22 µl sterile syringe filter (used for venting, and medium filtration) Fisher Scientific SLGP033RS Any vendor could be used
    25 ml Graduated Pipette Fisher Scientific 13-678-11 Any vendor could be used, and various sizes may be used
    Pipetter Fisher Scientific 13-681-15E Any vendor, or similar product could be used
    Hemocytometer Fisher Scientific 02-671-6 Any vendor, or similar product could be used
    Trypan Blue Gibco - Life Technologies 15250-061 Any vendor, or similar product could be used. https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15250061
    Inverted Light Microscope Leica Any vendor, or similar product could be used
    One Touch Ultra Blood Glucose Meter Fisher Scientific 22-029-293 Any vendor, or similar product could be used (e.g., Bayer)
    One Touch Ultra-Strips Fisher Scientific 22-029-292  Any vendor, or similar product could be used (e.g., Bayer)

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Reuveny, S., Velez, D., Macmillan, J. D., Miller, L. Factors affecting cell growth and monoclonal antibody production in stirred reactors. J. Immunol. Methods. 86 (1), 53-59 (1986).
    2. Tarleton, R. L., Beyer, A. M. Medium-scale production and purification of monoclonal antibodies in protein-free medium. Biotechniques. 11 (5), 590-593 (1991).
    3. Weegman, B. P., et al. Nutrient regulation by continuous feeding removes limitations on cell yield in the large-scale expansion of Mammalian cell spheroids. PLoS One. 8 (10), e76611 (2013).
    4. Klueh, U., et al. Continuous glucose monitoring in normal mice and mice with prediabetes and diabetes. Diabetes Technol. Ther. 8 (3), 402-412 (2006).
    5. Hay, R. J. Operator-induced contamination in cell culture systems. Dev. Biol. Stand. 75, 193-204 (1991).
    6. Dazey, B., Duchez, P., Letellier, C., Vezon, G., Ivanovic, Z. Cord blood processing by using a standard manual technique and automated closed system "Sepax" (Kit CS-530). Stem Cells Dev. 14 (1), 6-10 (2005).
    7. Gastens, M. H., et al. Good manufacturing practice-compliant expansion of marrow-derived stem and progenitor cells for cell therapy. Cell Transplant. 16 (7), 685-696 (2007).
    8. Naing, M. W., Williams, D. J. Three-dimensional culture and bioreactors for cellular therapies. Cytotherapy. 13 (4), 391-399 (2011).
    9. Stacey, G. N. Cell culture contamination. Cancer Cell Culture. , Methods Mol Biol; 731. Humana Press. Totowa, NJ. 79-91 (2011).
    10. Zur Nieden, I. N., Cormier, J. T., Rancourt, D. E., Kallos, M. S. Embryonic stem cells remain highly pluripotent following long term expansion as aggregates in suspension bioreactors. J. Biotechnol. 129 (3), 421-432 (2007).
    11. Kehoe, D. E., Jing, D., Lock, L. T., Tzanakakis, E. S. Scalable stirred-suspension bioreactor culture of human pluripotent stem cells. Tissue Eng. Part A. 16 (2), 405-421 (2010).
    12. Krawetz, R., et al. Large-scale expansion of pluripotent human embryonic stem cells in stirred-suspension bioreactors. Tissue Eng. Part C. Methods. 16 (4), 573-582 (2010).
    13. Shafa, M., et al. Expansion and long-term maintenance of induced pluripotent stem cells in stirred suspension bioreactors. J. Tissue Eng. Regen. Med. 6 (6), 462-472 (2012).
    14. Oh, S. K. W., et al. Long-term microcarrier suspension cultures of human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 2 (3), 219-230 (2009).
    15. Olmer, R., et al. Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors. Tissue Eng. Part C. Methods. 18 (10), 772-784 (2012).
    16. Baptista, R. P., Da Fluri,, Zandstra, P. W. High density continuous production of murine pluripotent cells in an acoustic perfused bioreactor at different oxygen concentrations. Biotechnol. Bioeng. 110 (2), 648-655 (2013).
    17. Papas, K. K. Characterization of the metabolic and secretory behavior of suspended free and entrapped ART-20 spheroids in fed-batch and perfusion cultures [dissertation]. , Georgia Institute of Technology. Atlanta, GA. (1992).
    18. Papas, K. K., Constantinidis, I., Sambanis, A. Cultivation of recombinant, insulin-secreting AtT-20 cells as free and entrapped spheroids. Cytotechnology. 13 (1), 1-12 (1993).
    19. Sambanis, A., Papas, K. K., Flanders, P. C., Long, R. C., Kang, H., Constantinidis, I. Towards the development of a bioartificial pancreas: immunoisolation and NMR monitoring of mouse insulinomas. Cytotechnology. 15 (1-3), 351-363 (1994).
    20. Sharma, S., Raju, R., Sui, S., Hu, W. -S. Stem cell culture engineering - process scale up and beyond. Biotechnol. J. 6 (11), 1317-1329 (2011).
    21. Papas, K. K., Long, R. C., Constantinidis, I., Sambanis, A. Role of ATP and Pi in the mechanism of insulin secretion in the mouse insulinoma betaTC3 cell line. Biochem. J. 326 (Pt 3), 807-814 (1997).
    22. Papas, K. K., Long, R. C., Sambanis, A., Constantinidis, I. Development of a bioartificial pancreas: I. long-term propagation and basal and induced secretion from entrapped betaTC3 cell cultures. Biotechnol. Bioeng. 66 (4), 219-230 (1999).
    23. Papas, K. K., Long, R. C., Sambanis, A., Constantinidis, I. Development of a bioartificial pancreas: II. Effects of oxygen on long-term entrapped betaTC3 cell cultures. Biotechnol. Bioeng. 66 (4), 231-237 (1999).
    24. Hu, W. S. Cell culture process monitoring and control-a key to process optimization. Cytotechnology. 14 (3), 155-156 (1994).
    25. Alfred, R., et al. Efficient suspension bioreactor expansion of murine embryonic stem cells on microcarriers in serum-free medium. Biotechnol. Prog. 27 (3), 811-823 (2011).
    26. Cormier, J. T., zur Nieden, N. I., Rancourt, D. E., Kallos, M. S. Expansion of undifferentiated murine embryonic stem cells as aggregates in suspension culture bioreactors. Tissue Eng. 12 (11), 3233-3245 (2006).
    27. Dang, S. M., Zandstra, P. W. Scalable production of embryonic stem cell-derived cells. Methods Mol. Biol. 290 (1), 353-364 (2005).
    28. Elseberg, C. L., et al. Microcarrier-based expansion process for hMSCs with high vitality and undifferentiated characteristics. Int. J. Artif. Organs. 35 (2), 93-107 (2012).
    29. Kallos, M. S., Behie, L. A. Inoculation and growth conditions for high-cell-density expansion of mammalian neural stem cells in suspension bioreactors. Biotechnol. Bioeng. 63 (4), 473-483 (1999).
    30. Kehoe, D. E., Lock, L. T., Parikh, A., Tzanakakis, E. S. Propagation of embryonic stem cells in stirred suspension without serum. Biotechnol. Prog. 24 (6), 1342-1352 (2008).
    31. Kirouac, D. C., Zandstra, P. W. The systematic production of cells for cell therapies. Cell Stem Cell. 3 (4), 369-381 (2008).
    32. Serra, M., et al. Stirred bioreactors for the expansion of adult pancreatic stem cells. Ann. Anat. 191 (1), 104-115 (2009).
    33. Chawla, M., Bodnar, C. A., Sen, A., Kallos, M. S., Behie, L. A. Production of islet-like structures from neonatal porcine pancreatic tissue in suspension bioreactors. Biotechnol. Prog. 22 (2), 561-567 (2006).
    34. Weegman, B. P., et al. Temperature profiles of different cooling methods in porcine pancreas procurement. Xenotransplantation. , (2014).
    35. Cruz, H. J., Moreira, J. L., Carrondo, M. J. Metabolic shifts by nutrient manipulation in continuous cultures of BHK cells. Biotechnol. Bioeng. 66 (2), 104-113 (1999).
    36. Dowd, J. E., Jubb, A., Kwok, K. E., Piret, J. M. Optimization and control of perfusion cultures using a viable cell probe and cell specific perfusion rates. Cytotechnology. 42 (1), 35-45 (2003).
    37. Goudar, C., Biener, R., Zhang, C., Michaels, J., Piret, J., Konstantinov, K. Towards industrial application of quasi real-time metabolic flux analysis for mammalian cell culture. Cell Culture Engineering. 101, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol; 101. Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. 99-118 (2006).
    38. Hu, W. S., Piret, J. M. Mammalian cell culture processes. Curr. Opin. Biotechnol. 3 (2), 110-114 (1992).
    39. Knaack, D., et al. Clonal insulinoma cell line that stably maintains correct glucose responsiveness. Diabetes. 43 (12), 1413-1417 (1994).
    40. Poitout, V., Stout, L. E., Armstrong, M. B., Walseth, T. F., Sorenson, R. L., Robertson, R. P. Morphological and functional characterization of beta TC-6 cells--an insulin-secreting cell line derived from transgenic mice. Diabetes. 44 (3), 306-313 (1995).
    41. Poitout, V., Olson, L. K., Robertson, R. P. Insulin-secreting cell lines: classification, characteristics and potential applications. Diabetes Metab. 22 (1), 7-14 (1996).
    42. Suzuki, R., et al. Cyotomedical therapy for insulinopenic diabetes using microencapsulated pancreatic beta cell lines. Life Sci. 71 (15), 1717-1729 (2002).
    43. Skelin, M., Rupnik, M., Cencic, A. Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research. ALTEX. 27 (2), 105-113 (2010).
    44. Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nat. Protoc. 2 (9), 2276-2284 (2007).
    45. Murdoch, T. B., McGhee-Wilson, D., Shapiro, A. M. J., Lakey, J. R. T. Methods of human islet culture for transplantation. Cell Transplant. 13 (6), 605-617 (2004).
    46. Woodside, S. M., Bowen, B. D., Piret, J. M. Mammalian cell retention devices for stirred perfusion bioreactors. Cytotechnology. 28 (1-3), 163-175 (1998).
    47. Serra, M., et al. Improving expansion of pluripotent human embryonic stem cells in perfused bioreactors through oxygen control. J. Biotechnol. 148 (4), 208-215 (2010).
    48. Gálvez, J., Lecina, M., Solà, C., Cairó, J., Gòdia, F. Optimization of HEK-293S cell cultures for the production of adenoviral vectors in bioreactors using on-line OUR measurements. J. Biotechnol. 157 (1), 214-222 (2012).
    49. Trabelsi, K., Majoul, S., Rourou, S., Kallel, H. Development of a measles vaccine production process in MRC-5 cells grown on Cytodex1 microcarriers and in a stirred bioreactor. Appl. Microbiol. Biotechnol. 93 (3), 1031-1040 (2012).
    50. Liu, H., et al. A high-yield and scaleable adenovirus vector production process based on high density perfusion culture of HEK 293 cells as suspended aggregates. J. Biosci. Bioeng. 107 (5), 524-529 (2009).
    51. Zhi, Z., Liu, B., Jones, P. M., Pickup, J. C. Polysaccharide multilayer nanoencapsulation of insulin-producing beta-cells grown as pseudoislets for potential cellular delivery of insulin. Biomacromolecules. 11 (3), 610-616 (2010).
    52. Lock, L. T., Laychock, S. G., Tzanakakis, E. S. Pseudoislets in stirred-suspension culture exhibit enhanced cell survival, propagation and insulin secretion. J. Biotechnol. 151 (3), 278-286 (2011).
    53. Marchenko, S., Flanagan, L. Counting human neural stem cells. J. Vis. Exp. (7), e262 (2007).
    54. Campos, C. Chronic hyperglycemia and glucose toxicity: pathology and clinical sequelae. Postgrad. Med. 124 (6), 90-97 (2012).
    55. Eve, D. J., Fillmore, R., Borlongan, C. V., Sanberg, P. R. Stem cells have the potential to rejuvenate regenerative medicine research. Med. Sci. Monit. 16 (10), RA197-RA217 (2010).
    56. Hsiao, L. -C., Carr, C., Chang, K. -C., Lin, S. -Z., Clarke, K. Review Article: Stem Cell-based Therapy for Ischemic Heart Disease. Cell Transplant. , (2012).
    57. Oldershaw, R. A. Cell sources for the regeneration of articular cartilage: the past, the horizon and the future. Int. J. Exp. Pathol. 93 (6), 389-400 (2012).
    58. De Coppi, P. Regenerative medicine for congenital malformations. J. Pediatr. Surg. 48 (2), 273-280 (2013).
    59. Tziampazis, E., Sambanis, A. Modeling of cell culture processes. Cytotechnology. 14 (3), 191-204 (1994).
    60. Sidoli, F. R., Mantalaris, A., Asprey, S. P. Modelling of Mammalian cells and cell culture processes. Cytotechnology. 44 (1-2), 27-46 (2004).
    61. Yim, R. Administrative and research policies required to bring cellular therapies from the research laboratory to the patient’s bedside. Transfusion. 45, Suppl 4. 144S-158S (2005).
    62. Fink, D. W. FDA regulation of stem cell-based products. Science. 324 (5935), 1662-1663 (2009).
    63. Moos, M. Stem-cell-derived products: an FDA update. Trends Pharmacol. Sci. 29 (12), 591-593 (2008).

    Tags

    Bioengineering גיליון 115 גלוקוז תקנה מזינה האכלה רציפה bioreactor השעיה עוררה רחבה אליפטית התרבות bioreactor
    תקנת מזין ידי האכלה רציפה להרחבה בקנה מידה הגדולה של בתאי יונקים ב Spheroids
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Weegman, B. P., Essawy, A., Nash,… More

    Weegman, B. P., Essawy, A., Nash, P., Carlson, A. L., Voltzke, K. J., Geng, Z., Jahani, M., Becker, B. B., Papas, K. K., Firpo, M. T. Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids. J. Vis. Exp. (115), e52224, doi:10.3791/52224 (2016).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter